CN103834663A

CN103834663A - 一种血清淀粉样蛋白a及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN103834663A
Application number: CN201410084163.2A
Authority: CN
Inventors: 向志明; 瞿符发; 肖述; 喻子牛
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2014-03-07
Filing date: 2014-03-07
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2034-03-07
Also published as: CN103834663B

Abstract

本发明公开了一种血清淀粉样蛋白A及其编码基因和应用。血清淀粉样蛋白A基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第148位-567位碱基所示。血清淀粉样蛋白A，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该基因在软体动物中属于首次发现，目前该基因除了在脊椎动物中有发现之外，在无脊椎动物中则只有在棘皮动物有所发现。定量PCR实验表明，牡蛎SAA在细菌感染后显著上调，与哺乳动物极为相似，因此该基因也可以作为检测牡蛎健康状况的金标准。通过检测该基因可以随时监测牡蛎的健康状况，对于牡蛎疾病的预防提供一个积极而准确的警戒信号，防止了灾害的扩大。该技术的应用，将进一步提升养殖贝类的种质创新能力，支撑产业的高效可持续性发展。

Description

一种血清淀粉样蛋白A及其编码基因和应用

技术领域：

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种血清淀粉样蛋白A及其编码基因和应用。

背景技术：

作为世界上最大的贝类养殖国，我国的贝类养殖已经成为沿海海水养殖业的支柱之一。我国贝类年产量占世界贝类总产量的60%以上。据2012年***统计，2011年，我国海洋贝类养殖产量为1179.6万吨，其中牡蛎375.63万吨，经济价值达到200多亿元人民币，占海水贝类养殖产量的30％以上，因此，牡蛎的养殖在我国沿海经济社会发展中占据举足轻重的地位，并具有巨大的发展潜力。但是，我国海洋贝类的发展是以传统养殖育种为主，以面积、能耗为代价的，产量因各种条件变化而波动，而且，由于缺乏有效的疾病检测手段，随着养殖规模的扩大，对于牡蛎养殖的风险也越来越大。以太平洋牡蛎为例，大规模死亡事件频繁发生，甚至一些养殖的二龄牡蛎死亡率也达到40%-50%，有的高达70%-80%，有的养殖场的牡蛎几乎全部死光。引起牡蛎死亡的原因很多，其中致病菌及寄生虫的侵害加重了牡蛎的大量死亡，特别是在水交换差、水质欠佳的高温季节更易使牡蛎患病死亡。因此，建立实时的牡蛎养殖病害的预防防治机制，是人们所亟待解决的问题之一。

血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A，SAA)属于载脂蛋白家族成员，是目前应用最为广泛的病理检测的金标准。在人类等脊椎动物中，SAA已经被开发成型的试剂盒，广泛的应用于甄别宿主的健康与否。环境胁迫、创伤以及病原菌感染均能引起SAA的急性显著性应答，这些因素使该蛋白具有广阔的应用前景。而且，该蛋白正常情况下表达水平不高，而病理情况下的表达高达正常水平的数百倍至数千倍，从而提高了仪器检验的灵敏度，检测手段的可操作性大大提高。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一个牡蛎的病理检测的标志性基因，即血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A，SAA)基因。

本发明的血清淀粉样蛋白A基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第148位-567位碱基所示。

本发明的第二个目的是提供血清淀粉样蛋白A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明的第三个目的是提供血清淀粉样蛋白A基因作为牡蛎健康状况的标志性基因在制备牡蛎的病理检测试剂中的应用。

本发明在香港巨牡蛎转录组测序的基础上，发现了一个牡蛎的病理检测的标志性基因，即血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A，SAA)基因。通过RACE技术，我们获得了该基因的全长，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的148bp-567bp所示，其编码的血清淀粉样蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该基因的核酸序列具有高度的物种特异性，其核酸序列约有40-60%同源于已知其他物种的SAA基因，该基因在软体动物中属于首次发现，目前该基因除了在脊椎动物中有发现之外，在无脊椎动物中则只有在棘皮动物有所发现。定量PCR实验表明，牡蛎SAA在细菌感染后显著上调，与哺乳动物极为相似，因此，该基因也可以作为检测牡蛎健康状况的金标准。通过检测该基因可以随时监测牡蛎的健康状况，对于牡蛎疾病的预防提供一个积极而准确的警戒信号，防止了灾害的扩大。该技术的应用，将进一步提升养殖贝类的种质创新能力，支撑产业的高效可持续性发展。

附图说明：

图1.实时定量PCR检测SAA mRNA在不同组织中的分布。实验结果表明SAA在性腺、外套膜与触唇中有显著性表达，在鳃、心脏、闭壳肌和消化腺中有中度表达，在血细胞几乎无表达。

图2.病原菌刺激诱导SAA的表达。溶藻弧菌（A）、葡萄球菌图（B）与酵母菌图（C）等病原菌分别刺激后，血细胞中SAA的表达显著上调。星号（**）指示和对照组差异极其显著。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一、RNA提取及反转录

a).香港巨牡蛎细胞或组织加Trizol后，采用组织研磨器研磨，室温放置5min，使其充***解。

b).12,000rpm离心5min，弃沉淀。

c).按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。

d).4℃12,000g离心15min。

e).吸取上层水相，至另一离心管中。

f).按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。

g).4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

h).按1ml75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

i).4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。

j).室温晾干或真空干燥5-10min。

k).可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。

l).在室温孵育15min之后，加入250μL DNase Stop Solution（DSA），在13,000×g离心1min。

m).重复步骤a-j，加100μL无核酸酶水，然后，在13,000×g离心1min，弃离心柱，使用分光光度计测量所收集的溶液中的RNA的浓度，分装后，贮存于-80℃。

n).第一条链cDNA的合成

1)DNase I消化

按照如下组分分别将各组的RNA加入到PCR离心管中

2)用枪头轻轻吹打混匀并稍作离心；37℃，15min,消化RNA中的DNA

3）加入1μL EDTA混匀，65℃，10min使DNase I失活

4）按照如下组分依次加到离心管：

用枪头轻轻吹打混匀并稍作离心，放置于37℃，30min；

5）85℃，5s使反转录酶失活，然后4℃短期保存，-20℃长期保存，由此得到第一条链cDNA。

二、差减杂交文库构建

差减杂交文库使用PCR-Select cDNA Subtraction Kit(Clontech,USA)试剂盒进行构建。香港巨牡蛎受溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）刺激8h后，收集血细胞，按照步骤一中的方法提取血细胞总RNA，并使用同样的方法提取对照组（未受弧菌处理）血细胞总RNA。以刺激后香港巨牡蛎作为tester，对照组作为driver，进行扣除杂交。将差减杂交后的cDNAs亚克隆到pGEM-Teasy vector(Promega,USA)并转化到Escherichia coli JM109(Promega,USA)感受态细胞。随机挑选2000个克隆并进行测序。

三、SAA基因全长的克隆

依据步骤二所得到的克隆测序，通过BLASTEN等生物软件分析并确定SAA序列，再以此序列为模版，通过GeneRacerTM RACE Ready cDNA试剂盒（Invitrogen,USA）进行该基因的5'/3'RACE，具体操作参照说明书。得到RACE序列后，通过拼接，以获得该基因的全长cDNA，该基因的全长cDNA全长623bp，其序列如SEQ ID NO.1所示，自148bp至567bp区段为其开放阅读框（命名为血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A，SAA)基因），编码139个氨基酸（其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，命名为：血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A，SAA)），5'非编码区长147bp，3'非编码区长56bp，有多聚腺苷酸加尾信号（AATAAA）和多聚腺苷酸尾巴。血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A，SAA)基因的核苷酸序列具有高度的物种特异性，其核酸序列约有40-60%同源于已知其他物种的SAA基因，该基因在软体动物中属于首次发现，目前该基因除了在脊椎动物中有发现之外，在无脊椎动物中则只有在棘皮动物有所发现。

PCR验证：

以ChSAA-F:5'-ATTCTCAGTATTGTCGGTGCTTT-3'，

ChSAA-R:5'-GTCTGGCGGCGTCATAGTTA-3'；

作为引物，以步骤一的第一条链cDNA作为模板，进行PCR反应，PCR反应体系为：TaKaRa Ex Taq（5U/μL）0.25μL，10×Ex Taq Buffer（Mg²⁺Plus）5μL，dNTP Mixture（各2.5mM）4μL，cDNA模板1μL，ChSAA-F（20μM）1μL，ChSAA-R（20μM）1μM，灭菌蒸馏水37.75μL。PCR反应程序为：94℃3min；（98℃30sec，55℃30sec，72℃30sec）30个循环；72℃10min。扩增得到的PCR产物经过测序，其序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第156位至385位所示。

四、实时定量PCR

进行实时定量PCR所使用的试剂盒为LightCycler480SYBR Green I（Roch），所使用的仪器为LightCycler480System（Roche），所使用的模板为步骤一所获得的反转录产物（第一条链cDNA），所使用的内参GAPDH，所使用的引物有：

ChSAA-F:5'-ATTCTCAGTATTGTCGGTGCTTT-3'

ChSAA-R:5'-GTCTGGCGGCGTCATAGTTA-3'

GAPDH-F:5'-GGATTGGCGTGGTGGTAGAG-3'

GAPDH-R:5'-GTATGATGCCCCTTTGTTGAGTC-3'

qRT-PCR的反应体系如下：2×Mix：10μL,ChSAA-F：0.2μM；ChSAA-R：0.2μM；反转录产物（cDNA）：50ng。

热循环条件如下：95℃处理10min；接下来运行40个循环：95℃变性5秒，60℃退火延伸20秒。qRT-PCR运行完成后，进行溶解曲线分析以确定PCR扩增是否特异。使用2^－ΔΔCT方法对转录本进行相对定量。对于每一份样品，实验组和对照组均设置3个平行反应。

五、组织分布及样品处理

分别提取5只牡蛎的各个组织的总RNA（见步骤一）并反转录为cDNA，采用步骤四的Real-time PCR技术检测了本发明的SAA基因（血清淀粉样蛋白A基因，其序列如SEQ IDNO.1的第148位-567位碱基所示）在香港巨牡蛎的血细胞，腮，触唇，性腺，消化腺，外套膜，心脏，闭壳肌中的分布情况。结果显示它在各个组织中广泛表达，其中在血细胞中表达量最低，几乎无表达，而在外套膜最高（图1）。

取正常牡蛎，分别注射1.0×10⁹个活的病原菌，以PBS为参照，在不同的时间点以5个一组的方式取样，提取血细胞的总RNA并反转录为cDNA（参见步骤一）。依此为模版，进行样品的Real-time PCR检测（参照步骤四），结果发现溶藻弧菌（图2A），葡萄球菌（图2B）以及酵母菌（图2C）都引起SAA基因的显著表达。

Claims

1.一种血清淀粉样蛋白A基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第148位-567位碱基所示。

2.一种血清淀粉样蛋白A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A基因作为牡蛎健康状况的标志性基因在制备牡蛎的病理检测试剂中的应用。