CN114525352A - 多重pcr与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法 - Google Patents

多重pcr与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法：根据三种不同致病菌的特异性基因片段分别设计一对上、下游引物，且上游引物5'端修饰巯基，下游引物5'端分别修饰生物素、荧光素和地高辛；将三种致病菌样品用PBS洗涤并重悬于PBS中，煮沸8‑15min后冷却至室温，离心，分别取上清DNA并进行多重PCR扩增，获得PCR产物；PCR产物与胶体金结合，封闭后滴加至试纸条上，肉眼观察结果。本发明利用PCR扩增技术来提高检测食源性致病菌的灵敏度，具有高通量检测、灵敏度高、特异性强、耗时短等优点，适用于致病菌的检测。

Description

多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法
技术领域
本发明属于食品安全技术领域，涉及纳米技术和生物技术。具体地，尤其涉及一种多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌方面的方法，其利用多重PCR扩增技术来提高检测食源性致病菌的灵敏度。
背景技术
随着食品工业的发展，食品安全问题成为了食品行业以及各界关注的焦点问题之一，其中食源性致病菌的产生是发生食品安全问题的一个重要原因。食品中由单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)、大肠杆菌O157:H7（E.coli O157:H7）和鼠伤寒沙门氏菌(S. typhimurium)等微生物引起的疾病发病率显著增加。而食源性致病菌检测技术的关键就是要有较高的灵敏度、较强的专一性以及尽可能短的分析时间,而现阶段的检测技术不足以对其顺利进行同步、精确及快速的检测,所以很多新型的检测方式已被视为研究的首选。由于纳米材料具有更大的比表面积和特殊的性质，应用更广泛。
目前普通的PCR扩增技术通常通过凝胶电泳法读取结果，这种方法具有耗时、灵敏度低的缺点。针对于此，特提出此发明。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌方面的方法，其将纳米材料胶体金与试纸条联合来检测食源性致病菌。本发明利用多重PCR扩增技术来提高检测食源性致病菌的灵敏度，具有高通量检测灵敏度高、特异性强、检测时间短等优点，特别适用于致病菌的检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法（检测原理如图1所示），其包括如下步骤：
a）根据三种不同致病菌的特异性基因片段分别设计一对上、下游引物，且上游引物5'端修饰巯基，下游引物5'端分别修饰生物素、荧光素和地高辛；
b）将三种致病菌样品用PBS洗涤并重悬于PBS中，煮沸8-15min后冷却至室温，离心，分别取上清DNA并利用步骤a）中的引物进行多重PCR扩增，获得PCR产物；具体为：各取2μL上清DNA，步骤a）中的引物各2 μL，25 µL 2× Taq PCR Master Mix buffer，加ddH2O至50 μL进行 PCR反应；PCR混合物先在95℃预变性5 min，开始循环过程，首先95℃变性30 s、53℃退火30 s、72℃延伸30 s，共进行32个循环。最后，在72℃下继续伸展10分钟即得PCR产物；
c）50 μL PCR产物与50 μL 胶体金在低pH溶液（pH=3的柠檬酸缓冲液）中结合，离心、弃上清，用含10% BSA的PBS封闭后滴加至试纸条上，肉眼观察结果。
具体的，步骤a）中，所述致病菌为单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌或铜绿假单胞菌等。待测的食源性致病菌样品可以是纯培养的食源性致病菌菌液或者含食源性致病菌的食品样品。
具体的，步骤c）中，所述纳米材料胶体金经下述步骤制备获得：在milli Q超纯水中加入HAuCl4溶液至HAuCl4终浓度为0.1mM，混匀，用智能磁力加热搅拌器搅拌加热至沸腾；迅速加入1%柠檬酸钠溶液并维持加热7-10min, 室温冷却，即得。优选的，可以在90-100mLmilli Q超纯水中加入80-120 µl 浓度0.1M 的HAuCl4溶液至HAuCl4终浓度为0.1mM；沸腾后，迅速加入1-3mL1%柠檬酸钠溶液。
具体的，步骤c）中，所述试纸条包括底板、以及依次粘接在底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上有三条检测线，所述检测线上分别包被有抗生物素抗体、抗荧光素抗体、抗地高辛抗体；即第一条检测线上包被有抗生物素抗体，第二条检测线上包被有抗荧光素抗体，第三条检测线上包被有抗地高辛抗体。
进一步优选的，所述样品垫的材质为聚酯纤维素膜，所述吸水垫的材质为吸水滤纸。
进一步的，用磷酸缓冲液（10mM，pH 7.4）将抗生物素抗体稀释后，用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成第一条检测线；用磷酸缓冲液（10mM，pH 7.4）将抗荧光素抗体稀释后，用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成第二条检测线；用磷酸缓冲液（10mM，pH7.4）将抗地高辛抗体稀释后，用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成第三条检测线；将包被好的硝酸纤维素膜置于30-45℃条件下干燥1-4 h，获得设有三条检测线的硝酸纤维素膜，且检测线上分别包被有抗生物素抗体、抗荧光素抗体、抗地高辛抗体。
本发明中，实验所用PBS均指浓度0.01 M、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液，并需提前灭菌。
本发明先是制备合成了胶体金，再利用简单煮沸法提取致病菌DNA并且通过PCR扩增的原理，用于高灵敏检测食源性致病菌。主要包括：先通过柠檬酸钠法合成制备胶体金，再将过夜培养的食源性致病菌通过简单的煮沸法提取DNA，取DNA模板并且引入巯基、生物素、荧光素和地高辛进行多重PCR扩增；同时制备试纸条，检测线分别为抗生物素抗体、抗荧光素抗体和抗地高辛抗体；PCR产物的一端有巯基，另一端分别有生物素、荧光素和地高辛；然后将PCR产物和胶体金结合，利用10% BSA封闭后通过试纸条时生物素会被第一条检测线上的抗体捕获，荧光素会被第二条检测线上的抗体捕获，地高辛会被第三条检测线上的抗体捕获，从而三条检测线都会有红色条带。本发明是通过多重PCR扩增以及胶体金的信号放大方式实现检测。本发明检测方法灵敏度高，对单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7菌液的检测限分别是1.0×101CFU/mL、1.0×102 CFU/mL、1.6×102CFU/mL。
本发明利用多重PCR扩增技术和试纸条，PCR经过32个循环扩增了大量的DNA；试纸条制备方法简单，样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次贴合在底板上，其中，抗生物素抗体、抗荧光素抗体和抗地高辛抗体分别喷涂于硝酸纤维素膜形成三条检测线，具有创新性。本发明具有高通量检测，灵敏度高，特异性强，检测时间短等特点。与其它现有的传统检测方法相比，本发明具有如下显著有益效果：
1）检测所用材料经济，试剂稳定、且操作简单方便快捷；
2）本发明通过多重PCR扩增以及AuNPs信号放大方式确保了检测方法的灵敏度；
3）本发明对食源性致病菌的选择性通过特异性引物的扩增，对检测的准确性进行了保障；
4）本发明方法检测快速、高通量检测、灵敏度高、特异性较强，检测时间在3h内，对单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7菌液的检测限分别是1.0×101CFU/mL、1.0×102 CFU/mL、1.6×102CFU/mL，较传统琼脂糖凝胶法更加灵敏，并且比传统的平板计数法（耗时长，需要1-2天）更快速、准确，且可对不可培养状态的菌进行检测。
附图说明
图1为本发明的检测原理示意图；
图2为本发明制备的胶体金（AuNPs）在不同放大倍数下的TEM图；
图3为本发明制备的AuNPs的UV-vis光谱图（A）及AuNPs和AuNPs-PCR产物的FT-IR光谱图（B）；
图4为本发明制备的AuNPs的粒径分布图（A）及AuNPs(a)和AuNPs-PCR产物(b)的ζ电势图（B）；
图5为本发明中检测不同浓度纯培养的单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7的试纸条结果（A，图中从左至右分别代表空白对照和单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7浓度109、108、107、106、105、104、103、102、101 CFU/mL）和凝胶电泳图（B，图中1至9分别代表单核细胞增生李斯特菌浓度0.8×109、0.9×108、0.9×107、0.9×106、1.0×105、0.8×104、0.9×103、0.8×102、1.0×101 CFU/mL；鼠伤寒沙门氏菌浓度1.1×109、1.2×108、1.2×107、1.2×106、1.3×105、1.1×104、1.4×103、1.0×102、2.0×101CFU/mL；大肠杆菌O157:H7浓度1.5×109、1.4×108、1.5×107、1.6×106、1.6×105、1.5×104、1.2×103、1.6×102、3.0×101CFU/mL，M: DNA分子量标准 Marker (100~1500bp)，C: 空白对照）；
图6为本发明中检测单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌时的检测特异性，即不同食源性致病菌的试纸条可视图（A，图中从左至右依次是：空白对照、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、铜绿假单胞菌）和凝胶电泳图（B，图中1至10依次是：单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、铜绿假单胞菌；M: DNA分子量标准 Marker(100~1500 bp); C: 空白对照）。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围，本领域的技术人员根据上述发明内容作出的一些非本质改进和调整，均在本发明保护范围内。
实施例中所用PBS均指浓度0.01 M、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液，并需提前灭菌。BSA指代牛血清蛋白。
实施例1
本实施例中，用到的纳米材料胶体金经下述步骤制备获得：
将250 mL的锥形瓶、磁搅拌棒在氢氧化钠溶液（1M）中浸泡至少15分钟，用大量去离子水冲洗，然后用milli Q超纯水冲洗。将99.9 mL milli Q超纯水装入锥形瓶，加入100µl浓度0.1M的HAuCl4溶液，使最终的HAuCl4浓度为0.1mM，混匀，用智能磁力加热搅拌器搅拌加热至沸腾，迅速加入1mL 1% 柠檬酸钠溶液，维持加热约8 min, 室温冷却，即得胶体金，4℃保存备用。
本实施例中，所用到的试纸条经下述方法制备获得：
试纸条包括底板、以及依次粘接在底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；底板(D70019)、样品垫(F30080)、硝酸纤维素膜(1900703)和吸水垫(H0022)购于上海杰一生物技术有限公司；样品垫宽2cm，硝酸纤维素膜宽2.5cm，吸水垫宽4cm，硝酸纤维素膜上有三条检测线，每条检测线间隔距离0.5cm，检测线上分别包被有抗生物素抗体（Anti-Biotinantibody ab53494购于abcam）、抗荧光素抗体（抗荧光素抗体，购于百迈格生物科技有限公司）、抗地高辛抗体（型号200-002-156购于Jackson）。样品垫的材质为聚酯纤维素膜，吸水垫的材质为吸水滤纸。用磷酸缓冲液（10mM，pH 7.4）将抗生物素抗体稀释后，用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成第一条检测线；用磷酸缓冲液（10mM，pH 7.4）将抗荧光素抗体稀释后，用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成第二条检测线；用磷酸缓冲液（10mM，pH7.4）将抗地高辛抗体稀释后，用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成第三条检测线。将包被好的硝酸纤维素膜置于45℃条件下干燥3h，获得设有三条检测线的硝酸纤维素膜，且检测线上分别包被有抗生物素抗体、抗荧光素抗体和抗地高辛抗体。
一种多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法，具体包括如下步骤：
a）根据食源性致病菌单核细胞增生李斯特菌（ATCC 15313）特异性基因片段（hly基因）、鼠伤寒沙门氏菌（CICC 21484）特异性基因片段（hut基因）、大肠杆菌O157:H7（ATCC43895）特异性基因片段（rfbE基因）分别设计一对上、下游引物，已知的hly基因片段为360bp，hut基因片段为495bp，rfbE基因片段为678bp。分别为：hly基因片段上游引物LM-hlyF （序列为5'-TGAATGCAATTTCGAGCCTA-3'）和下游引物LM-hlyR（序列为5'-CGCCGAAGTTTACATTCAAGC-3'），且上游引物5'端修饰巯基，下游引物5'端修饰生物素；hut基因片段上游引物ST-hutF （序列为5'- ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGCTG-3'）和下游引物ST-hutR （序列为5'- ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA-3'），且上游引物5'端修饰巯基，下游引物5'端修饰荧光素；rfbE基因片段上游引物EC-rfbEF （序列为5'-AACGGTTGCTCTTCATTTAG-3'）和下游引物EC-rfbER （序列为5'-GAGACCATCCAATAAGTGTG-3'），且上游引物5'端修饰巯基，下游引物5'端修饰地高辛（上述所有引物及修饰皆委托华大基因合成和修饰）。
b）分别将处于对数生长期的单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7用PBS洗涤并重悬于PBS中，在无菌操作下用PBS梯度稀释为109 CFU/mL、108 CFU/mL、107 CFU/mL、106 CFU/mL、105 CFU/mL、104 CFU/mL、103 CFU/mL、102 CFU/mL和101 CFU/mL。将已经稀释好的不同浓度的单核细胞增生李斯特菌菌液、鼠伤寒沙门氏菌菌液、大肠杆菌O157:H7菌液100℃煮沸10min，冷却至室温，离心，分别取上清DNA作为模板并利用步骤a）中的引物进行多重PCR扩增，获得PCR产物；具体为：各取2 μL上清DNA，步骤a）中生物素、荧光素和地高辛标记引物各2 μL，25 µL 2× Taq PCR Master Mix（购于生工生物工程股份有限公司），加ddH2O至50 μL进行PCR扩增。PCR混合物先在95℃预变性5 min，开始循环过程，首先95℃变性30 s、53℃退火30 s、72℃延伸30 s，共进行32个循环。最后，在72℃下继续伸展10分钟即得PCR产物；
c）50 μL PCR产物与50 μL 胶体金（AuNPs）在pH=3的柠檬酸缓冲液中结合3 min，离心弃上清，重悬到100μL含有10% BSA的PBS中封闭2 h，封闭后取20 μL滴加于试纸条上，10 min后肉眼观察结果。
图2 为本发明制备的AuNPs在不同放大倍数下的TEM图；TEM图中显示：本发明制备的AuNPs呈椭圆形光滑微球。
图3中A为本发明制备的AuNPs的UV-vis光谱图， UV-vis光谱图展示出AuNPs在525nm处吸收峰最大。图3中B为本发明制备的AuNPs和AuNPs-PCR产物的FT-IR光谱图；对于AuNPs的FT-IR光谱图，在1241 cm-1处的峰是由于C-CH3拉伸振动引起的，在1452 cm-1处的峰是由于亚甲基C-H的弯曲振动引起的，另外在3240 cm-1处的峰是由于羟基官能团的O-H拉伸振动引起的；由FT-IR光谱图可知本发明制备的AuNPs和PCR产物已经结合。
图4中A为本发明制备的AuNPs的粒径分布图，图中结果显示：AuNPs粒径约在40-50nm之间。图4中B为本发明制备的AuNPs和AuNPs-PCR产物的ζ电势图；ζ电势图展示了AuNPs(a)和AuNPs-PCR产物 (b) 的ζ电势分别为-26.4±1.2 mV和-37.75±1.5 mV，由电位变化可知PCR产物已经结合到AuNPs上。
实施例2
如图1中（B和C）所示，当样品中同时有三种目标菌时，PCR可以扩增出产物（PCR产物上同时带有巯基、生物素、荧光素和地高辛），检测线1上包被的抗生物素抗体通过捕获PCR产物上的生物素同时捕获AuNPs，即检测线1出现红色条带；检测线2上包被的抗荧光素抗体通过捕获PCR产物上的荧光素同时捕获AuNPs，即检测线2出现红色条带；检测线3上包被的抗地高辛抗体通过捕获PCR产物上的地高辛同时捕获AuNPs，即检测线3出现红色条带。当样品中无目标菌时，PCR无法扩增出同时带有巯基、生物素、荧光素和地高辛的产物，检测线上包被的抗体无法捕获同时带有巯基、生物素、荧光素和地高辛的产物同时无法捕获AuNPs，因此检测线无红色条带。即阳性结果为三条检测线都有红色条带，阴性结果为检测线没有红色条带。
同时利用传统的琼脂糖凝胶法检测PCR产物，通过传统的平板计数法对不同浓度不同菌液中菌落数进行检测，和本发明方法作比较，用以说明本发明检测方法具有较高的灵敏度。
结果分析：通过传统平板计数法对109、108、107、106、105、104、103、102、101 CFU/mL的单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）纯菌液进行检测，菌液中实际菌落数为0.8×109、0.9×108、0.9×107、0.9×106、1.0×105、0.8×104、0.9×103、0.8×102、1.0×101 CFU/mL；对不同浓度梯度的鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）纯菌液进行检测，菌液中实际菌落数为1.1×109、1.2×108、1.2×107、1.2×106、1.3×105、1.1×104、1.4×103、1.0×102、2.0×101 CFU/mL；对不同浓度梯度的大肠杆菌O157:H7（E. coli O157:H7）纯菌液进行检测，菌液中实际菌落数为1.5×109、1.4×108、1.5×107、1.6×106、1.6×105、1.5×104、1.2×103、1.6×102、3.0×101 CFU/mL。
图5给出了本发明同时检测不同浓度梯度纯培养的单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7的试纸条图 (A) 和传统的琼脂糖凝胶电泳图 (B)。图5的A中检测线（T line）在不同菌落数（从左至右依次是109、108、107、106、105、104、103、102、101 CFU/mL）时都有红色条带。PCR产物经2.0% 琼脂糖凝胶电泳40 min，在凝胶成像***中测定扩增结果，分别在360bp、495bp、678bp处出现目的条带，和预期片段相吻合（见图5中B，菌浓度低于107CFU/mL时，凝胶电泳图不能检测出），表明PCR产物有三条目标条带，凝胶电泳图（图5中B）验证说明本发明检测方法具有良好的可信度。
传统琼脂糖凝胶法对单核细胞增生李斯特菌纯菌液的检测灵敏度为9×106 CFU/mL；对鼠伤寒沙门氏菌纯菌液的检测灵敏度为1.2×107 CFU/mL；对大肠杆菌O157:H7纯菌液的检测灵敏度为1.5×107 CFU/mL。图5中 A的试纸条可视图显示：本发明对单增李斯特菌的检测限低至1.0×101 CFU/mL；对鼠伤寒沙门氏菌的检测限低至1.0×102 CFU/mL；对大肠杆菌O157:H7的检测限低至1.6×102 CFU/mL，较传统琼脂糖凝胶法更加灵敏，并且比传统的平板计数法（耗时长，需要1-2天）更快速、准确，且可对不可培养状态的菌进行检测。
实施例3
特异性检测：取浓度为108 CFU/mL的单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）、大肠杆菌O157:H7（E. coli O157:H7）、鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）、副溶血性弧菌（V . parahemolyticus）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）参照上述实施例2进行检测，通过凝胶电泳图评价本发明方法的检测特异性。
图6为本发明检测纯培养菌液的检测特异性图；琼脂糖凝胶电泳（图6中B）结果显示只有一种目标菌时，出现一条目的条带；有两种目标菌时，出现两条目的条带；有三种目标菌时，出现三条目的条带，而没有目标菌时没有出现目的条带。本发明试纸条（图6中A）结果显示：只有一种目标菌时，有一条检测线有红色条带；有两种目标菌时，有两条检测线有红色条带；有三种目标菌时，三条检测线都有红色条带出现，而没有目标菌时检测线没有红色条带，由此说明本发明检测方法特异性良好。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a）根据三种不同致病菌的特异性基因片段分别设计一对上、下游引物，且上游引物5'端修饰巯基，下游引物5'端分别修饰生物素、荧光素和地高辛；
b）将三种致病菌样品用PBS洗涤并重悬于PBS中，煮沸8-15min后冷却至室温，离心，分别取上清DNA并利用步骤a）中的引物进行多重PCR扩增，获得PCR产物；
c）PCR产物与胶体金结合，离心、弃上清，用含10% BSA的PBS封闭后滴加至试纸条上，肉眼观察结果。
2.如权利要求1所述多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法，其特征在于，步骤a）中，所述致病菌为单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌或铜绿假单胞菌。
3.如权利要求1所述多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法，其特征在于，步骤c）中，所述胶体金经下述步骤制备获得：在milli Q超纯水中加入HAuCl4溶液至HAuCl4终浓度为0.1mM，混匀，搅拌加热至沸腾；加入1%柠檬酸钠溶液并维持加热7-10min,室温冷却，即得。
4.如权利要求1所述多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法，其特征在于，步骤c）中，所述试纸条包括底板、以及依次粘接在底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上有三条检测线，所述检测线上分别包被有抗生物素抗体、抗荧光素抗体、抗地高辛抗体。
5.如权利要求4所述多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法，其特征在于，所述样品垫的材质为聚酯纤维素膜，所述吸水垫的材质为吸水滤纸。
6.如权利要求4所述多重PCR与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法，其特征在于，用磷酸缓冲液将抗生物素抗体稀释后，用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成第一条检测线；用磷酸缓冲液将抗荧光素抗体稀释后，用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成第二条检测线；用磷酸缓冲液将抗地高辛抗体稀释后，用划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成第三条检测线；将包被好的硝酸纤维素膜置于30-45℃条件下干燥1-4 h。
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