CN108060209A - 一种重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括沙门氏菌基因引物组DNA、重组酶恒温扩增试剂盒、无菌蒸馏水和核酸免疫胶体金试纸条。本发明试剂盒操作简便，非常适用于现场检测；检测成本低，整个检测过程仅需20min；灵敏度比PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测限高104倍，因此其可被广泛用于各种致病菌的检测，能够准确、灵敏、快速地检测沙门氏菌。

Description

一种重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的 试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，涉及食品中的沙门氏菌检测，尤其是一种重组酶聚合酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒及利用该试剂盒检测沙门氏菌的方法。
背景技术
近年来，由于食品安全事件的频发，世界卫生组织及消费者越来越重视食品安全问题。沙门氏菌是一种革兰氏阴性菌杆菌，在自然界中分布广泛，极易污染肉类、海产品、蛋类等许多食品，消费者食用被沙门氏菌污染的食品就会引发食物中毒。在我国，每年由细菌引起的食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒居首位，约占40％。检测和鉴定沙门氏菌的方法主要包括传统的细菌培养与生化鉴定和PCR方法。传统培养方法耗时长，大概2-3天，不适合于现场检测。PCR方法操作复杂，需要专门的操作人员和昂贵的热循环装置。这两种检测方法不能满足食品安全检测要求快速、便携、准确、特异性和灵敏度高的要求。
为了适用现场检测的要求，恒温扩增方法得到了广泛的应用，其最大的优点是可以在恒定的温度下发生反应。应用恒温扩增技术检测致病菌，简单的数字水浴锅可以取代昂贵的PCR仪，大大降低了检测成本。恒温扩增方法主要包括环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、解旋酶为基础的扩增(HDA)、重组酶扩增(RPA)。在这些恒温扩增方法中，解旋酶扩增(RPA)以操作简单、反应温度低(37℃-42℃)、扩增所需时间短(5-25min)而优于其他的恒温扩增方法。重组酶扩增是通过模拟DNA体内扩增，利用重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶，将目标DNA扩增数十亿倍。重组酶能够不通过加热就解开双链DNA。RPA反应开始的时候，重组酶结合单链DNA(引物)，形成核酸蛋白复合体。这些复合体能够扫描与引物序列互补的目标双链DNA。接着，核酸蛋白复合体侵入5'端位点形成D状环。单链结合蛋白与被置换单链结合使其稳定。同时，重组酶离开寡核苷酸的3'端，降解后被DNA聚合酶利用。之后，链置换DNA聚合酶结合在核酸蛋白复合体的游离3'端，进行链延伸，形成新的互补链。在链延伸的过程中，新合成的单链与原始互补链配对。以上步骤循环进行，就可以实现DNA的指数增长。
传统检测恒温扩增产物的方法是使用琼脂糖凝胶电泳，该方法耗时长，并且需要凝胶成像***，不符合食源性致病菌现场检测简便、快速的要求。胶体金免疫检测试纸条是20世界90年代发展起来的一项新型体外诊断技术。试纸条制作简单，价格便宜，使用方便，并且保存期长。目前关于将试纸条与重组酶恒温扩增结合起来检测沙门氏菌的分析方法未见报道。该技术操作简单快速，结果容易判定，无需复杂的仪器和专业的技术人员，具有很强的现场应用价值。
通过检索，尚未发现与本发明申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒及利用该试剂盒检测沙门氏菌的方法，该试剂盒具有高灵敏度、高特异性、可视化、操作简单、便携式的特点。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括沙门氏菌基因引物组DNA、重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒、无菌蒸馏水和核酸免疫胶体金试纸条：
其中，所述沙门氏菌基因引物组DNA为沙门氏菌恒温扩增的正向引物和反向引物，所述正向引物序列为SEQ1：5’-digoxinCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCG-3’，所述反向引物序列为SEQ2：5’-biotin-CAACCAGATAGGTAGGTAATGGAATGACGA-3’；
所述核酸免疫胶体金试纸条包括PVC背板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述PVC背板沿水平方向设置，该PVC背板上由左至右依次相连接设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠设置，所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔设置检测线和质控线，所述检测线和质控线沿纵向设置，所述检测线处的硝酸纤维素膜上包被设置链霉亲和素，所述质控线处的硝酸纤维素膜上包被设置兔抗鼠二抗，所述结合垫上包被设置高辛抗体-胶体金标记物；
所述核酸免疫胶体金试纸条在使用过程中，质控线若无颜色，证明该核酸免疫胶体金试纸条失效。
而且，所述核酸试纸条的制备方法如下：
⑴采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
⑵取1ml步骤⑴中的胶体金加入到无菌离心管中，将1mg/ml鼠抗地高辛单克隆抗体10ul加入到上述胶体金中，制得抗地高辛抗体-胶体金标记物；
⑶将步骤⑵中制备抗地高辛抗体-胶体金标记物包被于结合垫上；
⑷在试纸条的硝酸纤维素膜上包被链霉亲和素作为检测线，并将兔抗鼠二抗包被在硝酸纤维素膜上作为质控线；试纸条使用过程中，质控线若无颜色，证明试纸条失效；
⑸在PVC背板上按顺序粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，即得核酸免疫胶体金试纸条。
而且，所述样品垫和硝酸纤维素膜购自美国Millipore公司，所述结合垫、吸水纸和PVC背板购自上海金标生物科技公司，所述链霉亲和素购自sigma公司，所述鼠抗地高辛单克隆抗体和兔抗鼠多克隆抗体购自Abcam公司。
而且，所述胶体金的制备方法如下：
采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金：
先取200ml去离子水倒入三角烧瓶中，于恒温电磁力搅拌器上加热至沸腾一分钟，清洗三角烧瓶，之后倒掉沸水；取99ml去离子水到三角烧瓶中，取1ml的质量浓度为1％的HAuCl4到上述99ml的去离子水中，加热至沸腾；沸腾后，快速加入2.25ml质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，2min内可以观察到明显的颜色变化；当胶体金颜色呈现酒红色并且保持不变后，继续加热15min，之后室温下冷却后保存于棕色广口瓶中，4℃保存备用；制备好的胶体金溶液清亮透明，表面无漂浮物。
而且，所述重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒购于TwistDx Ltd.Babraham,UK公司。
而且，所述重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒能够扩增检测核酸分子，扩增片段的长度为188bp，目标DNA的浓度≥20fg。
而且，所述重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒扩增的温度为39℃，扩增时间为10min。
而且，所述正向引物上连有地高辛，能与胶体金上标记的抗地高辛单克隆抗体结合；反向引物上连有生物素，能与试纸条T线上包被的链霉亲和素结合。
利用如上所述的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒检测沙门氏菌的方法，步骤如下：
⑴取1ml沙门氏菌菌液，18000g离心5min，弃上清，用PBS重悬，在95℃水浴锅中孵育5min，5000g离心10min，取上清，提取得到DNA；
⑵将步骤⑴中提取得到的DNA作为模板，取2.5ul加入到PCR反应管中，使用重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒对其进行扩增，加入29.5ul的Twist Basic buffer，10.5ul无菌水，2.4ul 10uM的正向引物，2.4ul 10uM的反向引物2.4ul，重组聚合酶一粒，混合均匀后加入2.5ul MgSO4，总反应体系为50ul，之后置于39℃的水浴锅中反应10min，得到扩增产物；
⑶取步骤⑵中的扩增产物10ul，与90ul 0.01M PBS混合后，滴加到核酸免疫胶体金试纸条的样品垫上，2～3min后肉眼观察结果；
结果判读：肉眼直接判读：
1)阴性(—)：仅在质控线出现一条黑灰色条带，在检测线内无黑灰色条带出现，证明所检测的样本没有沙门氏菌污染；
2)阳性(+)：出现两条黑灰色条带，一条位于检测线内，另一条位于质控线内，证明所检测的样本存在沙门氏菌污染。
本发明取得的优点和积极效果是：
1、本发明试剂盒操作简便，非常适用于现场检测；检测成本低，整个检测过程仅需20min；灵敏度比PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测限高104倍，因此其可被广泛用于各种致病菌的检测，能够准确、灵敏、快速地检测沙门氏菌。
2、由于RPA恒温扩增试剂盒操作简单，无需复杂的反应仪器，利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在39℃条件下实现等温扩增，因此本发明的试剂盒使用成本较低；本发明的试剂盒反应时间迅速，可以在10min内完成核酸扩增，2min内获得试纸条检测结果，整个检测过程包括：煮沸法提取DNA，RPA扩增，试纸条检测，整个检测过程可以在25min内完成。
3、本发明试剂盒得到的反应结果直观准确，无需进行复杂的操作，虽然RPA扩增产物可以用琼脂糖凝胶电泳今次那个检测，但需要比较复杂的检测仪器、耗时长并且灵敏度低，如果在正反引物的5’端分别进行digoxin和biotin标记，然后使用免疫检测试纸条对扩增产物进行检测，既可以准确的对结果进行直观检测又可以提高检测的灵敏度，并且使其更适用于现场检测快速、简单的操作要求。
4、本发明试剂盒可以快速、灵敏的检测沙门氏菌，无需昂贵的仪器，只需一个数字化水浴锅即可完成反应，试剂盒操作简单，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广使用。
5、重组酶恒温扩增技术是一种利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶在恒定温度下(37℃-42℃)，利用正向和反向引物，实现目标核酸指数扩增的新技术，这种扩增不需要复杂的热循环过程，无需特殊的仪器，对操作人员的要求也不高，具有简单、便携、快速等特点。重组酶恒温扩增产物使用免疫胶体金试纸条进行检测，试纸条的组成包括样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜，吸水纸，和PVC背板。硝酸纤维素膜(NC膜)上包被有链霉亲和素和兔抗鼠二抗分别构成检测线(T)和质控线(C)。
附图说明
图1为本发明中核酸免疫胶体金试纸条的检测试纸条工作原理、组装方法及结构连接示意图；
图2为本发明中优化最佳反应温度和反应时间结果图；其中，A为优化最佳反应温度结果图；B为优化最佳反应时间结果图；
图3为本发明中恒温扩增结合试纸条在纯菌液中的检测限图：RPA扩增沙门氏菌的DNA在39℃下扩增5min和10min分别用试纸条和凝胶电泳检测扩增产物，RPA扩增反应时间为5min，凝胶电泳和试纸条的检测限分别为20pg和200pg，如图3中A、B所示；RPA扩增反应时间为10min，凝胶电泳和试纸条的检测限分别为2pg和20fg，如图3中C、D；当模板量为20fg，使用试纸条分析扩增产物，试纸条T线颜色明显比阴性对照试纸条T线颜色深，因此，20fg沙门氏菌模板DNA是RPA-LF的最低检出限；
图4为本发明中恒温扩增结合试纸条的特异性验证图：在最优的扩增反应条件下，选取5株沙门氏菌和6株非沙门氏菌检测RPA-LF的特异性；其中，A为RPA-LF检测沙门氏菌种外验证图，B为RPA-LF检测沙门氏菌种内验证图；
图5为本发明中分别在牛奶，鸡胸肉和鸡蛋中接种1.05×100，1.05×101，1.05×102CFU/mL或CFU/g的沙门氏菌，在37℃下增菌0-4h；其中，A、D、G为将不同浓度的沙门氏菌接种到牛奶样品中，B、D、H为将不同浓度的沙门氏菌接种到鸡胸肉样品中，C、F、I为将不同浓度的沙门氏菌接种到鸡蛋样品中；A，B，C为将样品增菌0h，D、E、F为将样品增菌1h，G、H为增菌2h，I为增菌4h。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括沙门氏菌基因引物组DNA、重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒(TwistAmpBasic)、无菌蒸馏水和核酸免疫胶体金试纸条：
其中，所述沙门氏菌基因引物组DNA为沙门氏菌恒温扩增的正向引物和反向引物，所述正向引物序列为SEQ1：5’-digoxinCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCG-3’，所述反向引物序列为SEQ2：5’-biotin-CAACCAGATAGGTAGGTAATGGAATGACGA-3’；
所述核酸免疫胶体金试纸条包括PVC背板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述PVC背板沿水平方向设置，该PVC背板上由左至右依次相连接设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处(部分)重叠设置，所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔设置检测线和质控线，所述检测线和质控线沿纵向设置，所述检测线处的硝酸纤维素膜上包被设置链霉亲和素，所述质控线处的硝酸纤维素膜上包被设置兔抗鼠二抗，所述结合垫上包被设置高辛抗体-胶体金标记物；
所述核酸免疫胶体金试纸条在使用过程中，质控线若无颜色，证明该核酸免疫胶体金试纸条失效。
较优地，所述核酸试纸条的制备方法如下：
⑴采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
⑵取1ml步骤⑴中的胶体金加入到无菌离心管中，将1mg/ml鼠抗地高辛单克隆抗体10ul加入到上述胶体金中，制得抗地高辛抗体-胶体金标记物；
⑶将步骤⑵中制备抗地高辛抗体-胶体金标记物包被于结合垫上；
⑷在试纸条的硝酸纤维素膜上包被链霉亲和素作为检测线，并将兔抗鼠二抗包被在硝酸纤维素膜上作为质控线；试纸条使用过程中，质控线若无颜色，证明试纸条失效；
⑸在PVC背板上按顺序粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，即得核酸免疫胶体金试纸条。
较优地，所述样品垫和硝酸纤维素膜购自美国Millipore公司，所述结合垫、吸水纸和PVC背板购自上海金标生物科技公司，所述链霉亲和素购自sigma公司，所述鼠抗地高辛单克隆抗体和兔抗鼠多克隆抗体购自Abcam公司。
较优地，所述胶体金的制备方法如下：
采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金：
先取200ml去离子水倒入三角烧瓶中，于恒温电磁力搅拌器上加热至沸腾一分钟，清洗三角烧瓶，之后倒掉沸水；取99ml去离子水到三角烧瓶中，取1ml的质量浓度为1％的HAuCl4到上述99ml的去离子水中，加热至沸腾；沸腾后，快速加入2.25ml质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，2min内可以观察到明显的颜色变化；当胶体金颜色呈现酒红色并且保持不变后，继续加热15min，之后室温下冷却后保存于棕色广口瓶中，4℃保存备用；制备好的胶体金溶液清亮透明，表面无漂浮物。
较优地，所述重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒(TwistAmp Basic)购于TwistDxLtd.Babraham,UK公司。
较优地，所述重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒(TwistAmp Basic)能够扩增检测核酸分子，扩增片段的长度为188bp，目标DNA的浓度≥20fg。
较优地，所述重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒(TwistAmp Basic)扩增的温度为39℃，扩增时间为10min。
较优地，所述正向引物上连有地高辛，能与胶体金上标记的抗地高辛单克隆抗体结合；反向引物上连有生物素，能与试纸条T线上包被的链霉亲和素结合。
利用如上所述的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒检测沙门氏菌的方法，步骤如下：
⑴取1ml沙门氏菌菌液，18000g离心5min，弃上清，用PBS重悬，在95℃水浴锅中孵育5min，5000g离心10min，取上清，提取得到DNA；
⑵将步骤⑴中提取得到的DNA作为模板，取2.5ul加入到PCR反应管中，使用重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒(TwistAmp Basic)对其进行扩增，加入29.5ul的Twist Basicbuffer，10.5ul无菌水，2.4ul 10uM的正向引物，2.4ul 10uM的反向引物2.4ul，重组聚合酶一粒，混合均匀后加入2.5ul MgSO4，总反应体系为50ul，之后置于39℃的水浴锅中反应10min，得到扩增产物；
⑶取步骤⑵中的扩增产物10ul，与90ul 0.01M PBS混合后，滴加到核酸免疫胶体金试纸条的样品垫上，2～3min后肉眼观察结果；
结果判读：肉眼直接判读：
1)阴性(—)：仅在质控线出现一条黑灰色条带，在检测线内无黑灰色条带出现，证明所检测的样本没有沙门氏菌污染；
2)阳性(+)：出现两条黑灰色条带，一条位于检测线内，另一条位于质控线内，证明所检测的样本存在沙门氏菌污染。
较优地，使用本发明试剂盒检测沙门氏菌的具体方法如下：
1、使用煮沸法提取沙门氏菌基因组DNA：
具体方法为：取1ml菌体，1,8000g离心5min，去上清，之后用1ml的PBS缓冲液重悬，95℃水浴中孵育5min，5000g离心10min，取上清至干净的离心管中备用；
2、RPA扩增所需的引物组如下所示：
正向引物序列为：5’-digoxinCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCG-3’，
反向引物序列为：5’-biotin-CAACCAGATAGGTAGGTAATGGAATGACGA-3’；
所述的检测沙门氏菌的RPA恒温扩增试剂盒购于TwistDx Ltd.(Babraham,UK)公司；
所述的检测沙门氏菌的RPA核酸试纸条试剂盒，还包含无菌蒸馏水，沙门氏菌基因组DNA，还包括发明内容中制备的核酸试纸条；
所述的检测沙门氏菌的RPA核酸试纸条试剂盒检测沙门氏菌的的方法，包含以下步骤：
(1)配制RPA反应体系，向200ul的PCR管中加入29.5ul的Buffer，10.5ul无菌水，正向引物2.4ul(10uM)，反向引物2.4ul(10uM)，模板DNA 2.5ul，重组聚合酶1粒，混匀后加入2.5ul MgSO4，总反应体系为50ul，置于39℃的水浴锅中反应10min；
(2)取10ul步骤(1)的RPA扩增产物，与90ul的PBS缓冲液(0.01M)混合均匀后，用制备好的核酸试纸条检测，3min后观察结果；
(3)结果判读：肉眼直接判读：
1)阴性(—)：仅在质控区(C)出现一条黑灰色条带，在检测区(T)内无黑灰色条带出现，证明所检测的样本没有沙门氏菌污染；
2)阳性(+)：出现两条黑灰色条带，一条位于检测区(T)内，另一条位于质控区(C)内，证明所检测的样本存在沙门氏菌污染；
(4)灵敏度的判定：RPA扩增沙门氏菌的DNA在39℃下扩增5min和10min分别用试纸条和凝胶电泳检测扩增产物，RPA扩增反应时间为5min，凝胶电泳和试纸条的检测限分别为20pg和200pg，如附图3A,B所示。RPA扩增反应时间为10min，凝胶电泳和试纸条的检测限分别为2pg和20fg，如图3C,D。当模板量为20fg，使用试纸条分析扩增产物，试纸条T线颜色明显比阴性对照试纸条T线颜色深，因此，20fg沙门氏菌模板DNA是RPA-LF的最低检出限。
随后进行沙门氏菌菌落总数的最低检测限试验，将沙门氏菌纯菌液进行系列稀释，得到菌落数分别为1.05×100到1.05×108CFU/mL的纯菌液，采用沸水浴15min释放菌体DNA，10000g离心取上清，作为RPA扩增反应的模板，采用试纸条对扩增产物进行分析，同时采用PCR结合试纸条对1.05×100到1.05×108CFU/mL的沙门氏菌纯菌液进行检测，比较RPA与PCR的灵敏度，如图4所示，RPA-LF对纯菌液的检出限为1.05×101CFU/mL，而PCR-LF的检出限为1.05×105CFU/mL。
本发明中优化RPA反应的最佳反应温度和时间：
为了确定RPA反应的最适温度，选取扩增温度为36℃，37℃，38℃，39℃，40℃，41℃，扩增反应的时间选取10min，通过试纸条对扩增反应的产物进行分析，如图2中A所示，在36℃,37℃,和38℃下扩增，试纸条颜色较淡，在39℃,40℃,和41℃下的扩增反应，试纸条颜色无显著差别，因此，选择39℃作为后续实验的反应温度。随后检验扩增反应时间对扩增反应的影响，选择的扩增反应时间分别为2.5,5,10,15,20和25min，如图2中B所示，从2.5min到10min，随着扩增反应时间的延长，试纸条的亮度逐渐加深。扩增反应时间为10min或15min，试纸条条带的亮度无显著差别。当扩增反应时间为20或25min，虽然试纸条条带的亮度加深，但RPA反应时间过长，容易产生由于非特异性扩增而产生的假阳性。因此，本发明中，选择的最佳扩增时间为10min。
使用本发明试剂盒检测沙门氏菌的特异性的相关检测结果：
在最优的扩增反应条件下，选取5株沙门氏菌和6株非沙门氏菌检测RPA-LF的特异性。如图4所示，5株沙门氏菌经RPA扩增反应后，试纸条T线颜色均较亮，6株非沙门氏菌试纸条T线均不显色，因此，可以证明，RPA-LF有较好的特异性。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒及利用该试剂盒检测沙门氏菌的方法
<130> 2017-12-22
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 正向引物序列为SEQ1()
<400> 1
ctacaagcat gaaatggcag aacagcgtcg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 反向引物序列为SEQ2()
<400> 2
caaccagata ggtaggtaat ggaatgacga 30

Claims (9)

1.一种重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括沙门氏菌基因引物组DNA、重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒、无菌蒸馏水和核酸免疫胶体金试纸条：
其中，所述沙门氏菌基因引物组DNA为沙门氏菌恒温扩增的正向引物和反向引物，所述正向引物序列为SEQ1：5’-digoxinCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCG-3’，所述反向引物序列为SEQ2：5’-biotin-CAACCAGATAGGTAGGTAATGGAATGACGA-3’；
所述核酸免疫胶体金试纸条包括PVC背板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述PVC背板沿水平方向设置，该PVC背板上由左至右依次相连接设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠设置，所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔设置检测线和质控线，所述检测线和质控线沿纵向设置，所述检测线处的硝酸纤维素膜上包被设置链霉亲和素，所述质控线处的硝酸纤维素膜上包被设置兔抗鼠二抗，所述结合垫上包被设置高辛抗体-胶体金标记物；
所述核酸免疫胶体金试纸条在使用过程中，质控线若无颜色，证明该核酸免疫胶体金试纸条失效。
2.根据权利要求1所述的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述核酸试纸条的制备方法如下：
⑴采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
⑵取1ml步骤⑴中的胶体金加入到无菌离心管中，将1mg/ml鼠抗地高辛单克隆抗体10ul加入到上述胶体金中，制得抗地高辛抗体-胶体金标记物；
⑶将步骤⑵中制备抗地高辛抗体-胶体金标记物包被于结合垫上；
⑷在试纸条的硝酸纤维素膜上包被链霉亲和素作为检测线，并将兔抗鼠二抗包被在硝酸纤维素膜上作为质控线；试纸条使用过程中，质控线若无颜色，证明试纸条失效；
⑸在PVC背板上按顺序粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，即得核酸免疫胶体金试纸条。
3.根据权利要求2所述的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述样品垫和硝酸纤维素膜购自美国Millipore公司，所述结合垫、吸水纸和PVC背板购自上海金标生物科技公司，所述链霉亲和素购自sigma公司，所述鼠抗地高辛单克隆抗体和兔抗鼠多克隆抗体购自Abcam公司。
4.根据权利要求2所述的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述胶体金的制备方法如下：
采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金：
先取200ml去离子水倒入三角烧瓶中，于恒温电磁力搅拌器上加热至沸腾一分钟，清洗三角烧瓶，之后倒掉沸水；取99ml去离子水到三角烧瓶中，取1ml的质量浓度为1％的HAuCl4到上述99ml的去离子水中，加热至沸腾；沸腾后，快速加入2.25ml质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，2min内可以观察到明显的颜色变化；当胶体金颜色呈现酒红色并且保持不变后，继续加热15min，之后室温下冷却后保存于棕色广口瓶中，4℃保存备用；制备好的胶体金溶液清亮透明，表面无漂浮物。
5.根据权利要求1所述的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒购于TwistDx Ltd.Babraham,UK公司。
6.根据权利要求1所述的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒能够扩增检测核酸分子，扩增片段的长度为188bp，目标DNA的浓度≥20fg。
7.根据权利要求1所述的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒扩增的温度为39℃，扩增时间为10min。
8.根据权利要求1所述的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述正向引物上连有地高辛，能与胶体金上标记的抗地高辛单克隆抗体结合；反向引物上连有生物素，能与试纸条T线上包被的链霉亲和素结合。
9.利用如权利要求1至8任一项所述的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒检测沙门氏菌的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴取1ml沙门氏菌菌液，18000g离心5min，弃上清，用PBS重悬，在95℃水浴锅中孵育5min，5000g离心10min，取上清，提取得到DNA；
⑵将步骤⑴中提取得到的DNA作为模板，取2.5ul加入到PCR反应管中，使用重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒对其进行扩增，加入29.5ul的Twist Basic buffer，10.5ul无菌水，2.4ul 10uM的正向引物，2.4ul 10uM的反向引物2.4ul，重组聚合酶一粒，混合均匀后加入2.5ul MgSO4，总反应体系为50ul，之后置于39℃的水浴锅中反应10min，得到扩增产物；
⑶取步骤⑵中的扩增产物10ul，与90ul 0.01M PBS混合后，滴加到核酸免疫胶体金试纸条的样品垫上，2～3min后肉眼观察结果；
结果判读：肉眼直接判读：
1)阴性(—)：仅在质控线出现一条黑灰色条带，在检测线内无黑灰色条带出现，证明所检测的样本没有沙门氏菌污染；
2)阳性(+)：出现两条黑灰色条带，一条位于检测线内，另一条位于质控线内，证明所检测的样本存在沙门氏菌污染。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109957622A (zh) * 2019-03-27 2019-07-02 华南农业大学 一种检测鸭传染性浆膜炎的rpa-lfd可视化试剂盒及其应用
CN110241021A (zh) * 2019-05-23 2019-09-17 广州普世利华科技有限公司 一种免仪器核酸现场快速检测试剂盒
CN110794130A (zh) * 2019-10-22 2020-02-14 中科佑隆（杭州）食安标准科技有限公司 一种核酸二合一免疫金标速测卡、制备方法及其检测方法
CN110982914A (zh) * 2019-12-18 2020-04-10 江苏海洋大学 一种沙门氏菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用
CN111505275A (zh) * 2020-03-20 2020-08-07 浙江工业大学 一种基于Cas9核酸等温扩增的免疫层析多重基因检测方法
CN111560449A (zh) * 2020-05-20 2020-08-21 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种早期快速诊断鸡白痢沙门氏菌的试剂盒
CN112779358A (zh) * 2021-01-27 2021-05-11 重庆威斯腾前沿生物研究院有限责任公司 一种dcas9介导检测HPV16型E6基因的免疫层析方法
CN114525352A (zh) * 2022-03-24 2022-05-24 郑州轻工业大学 多重pcr与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105331710A (zh) * 2015-11-20 2016-02-17 浙江省疾病预防控制中心 一种沙门氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒及检测方法
CN106636387A (zh) * 2016-12-14 2017-05-10 天津科技大学 沙门氏菌核酸快速检测试剂盒、试纸及检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105331710A (zh) * 2015-11-20 2016-02-17 浙江省疾病预防控制中心 一种沙门氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒及检测方法
CN106636387A (zh) * 2016-12-14 2017-05-10 天津科技大学 沙门氏菌核酸快速检测试剂盒、试纸及检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAIBIN LIU等: "Development of an isothermal amplification-based assay for the rapid visual detection of salmonella bacteria", 《JOURNAL OF DAIRY SCIENCE》 *
吕世静等: "《临床免疫学检验》", 31 August 2015, 中国医药科技出版社 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109957622A (zh) * 2019-03-27 2019-07-02 华南农业大学 一种检测鸭传染性浆膜炎的rpa-lfd可视化试剂盒及其应用
CN110241021A (zh) * 2019-05-23 2019-09-17 广州普世利华科技有限公司 一种免仪器核酸现场快速检测试剂盒
CN110241021B (zh) * 2019-05-23 2022-04-12 广州普世利华科技有限公司 一种免仪器核酸现场快速检测试剂盒
CN110794130A (zh) * 2019-10-22 2020-02-14 中科佑隆（杭州）食安标准科技有限公司 一种核酸二合一免疫金标速测卡、制备方法及其检测方法
CN110982914A (zh) * 2019-12-18 2020-04-10 江苏海洋大学 一种沙门氏菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用
CN111505275A (zh) * 2020-03-20 2020-08-07 浙江工业大学 一种基于Cas9核酸等温扩增的免疫层析多重基因检测方法
CN111505275B (zh) * 2020-03-20 2023-03-31 浙江工业大学 一种基于Cas9核酸等温扩增的免疫层析多重基因检测方法
CN111560449A (zh) * 2020-05-20 2020-08-21 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种早期快速诊断鸡白痢沙门氏菌的试剂盒
CN112779358A (zh) * 2021-01-27 2021-05-11 重庆威斯腾前沿生物研究院有限责任公司 一种dcas9介导检测HPV16型E6基因的免疫层析方法
CN112779358B (zh) * 2021-01-27 2023-06-09 重庆威斯腾前沿生物研究院有限责任公司 一种非诊断目的的dcas9介导检测HPV16型E6基因的免疫层析方法
CN114525352A (zh) * 2022-03-24 2022-05-24 郑州轻工业大学 多重pcr与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法
CN114525352B (zh) * 2022-03-24 2024-05-17 郑州轻工业大学 多重pcr与胶体金试纸条联合高通量检测致病菌的方法

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