CN109596827A - 一种同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

一种同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条及其制备方法和应用 Download PDF

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李昌满
高晓旭
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Abstract

本发明公开了一种同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条及其制备方法和应用，所述试纸的底层为支撑板，该支撑板上依次黏附有紧密相连的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述硝酸纤维素膜上依次设置有4条检测线和1条质控线，所述结合垫上包被有上转换纳米粒子‑致病菌第一核酸适配体复合物；所述检测线上分别包被有致病菌第二核酸适配体‑链霉亲和素复合物，即捕获探针；所述质控线上包被有polyT序列‑链霉亲和素复合物，即质控探针。本试纸条灵敏度高、特异性好、成本低廉，可实现复杂样品中4种致病菌的同时检测，具有良好的应用前景。

Description

一种同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，特别涉及一种同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
食源性致病菌诱发的食源性疾病是当今全球最为突出的食品安全问题之一。世界卫生组织公布的信息表明，全球每年发生食源性疾病的病例达到数亿例，即使在发达国家至少有1/3的人患食源性疾病。
目前，针对食源性致病菌的鉴定和检测方法主要基于三个原理：1)微生物培养法；2)特异性DNA杂交；3)基于抗原-抗体识别技术。其中，传统的微生物培养法耗时长、效率低，不能及时检出食品中的病原菌，无法满足快速检测需求。基于特异性DNA杂交的PCR技术和核酸探针技术具有较高的灵敏度，但对工作人员和检测设备的要求较高。虽然免疫分析技术在以上方面得到了很大改观，但抗体的制备需要免疫动物、成本高、抗体易失活。因此，迫切需要发展高灵敏、成本低、实用性强的食源性致病菌快速检测技术。
近些年，核酸适配体(Aptamer)作为新型识别分子逐渐成为研究热点，其本质是一段单链寡核苷酸折叠成发夹、茎环、假结体及G-四链体等二级或三级结构，通过氢键、范德华力等与靶分子相互作用而形成稳定的复合物，其空间结构的多样性几乎可以与所有种类的靶分子(细胞因子、蛋白、生物毒素、金属离子、小分子物质、细胞、微生物等)发生结合。与传统的抗体相比，具有适应范围广；高亲和力和高特异性，不受免疫条件和免疫原性限制；制备简单，可体外人工合成；变性与复性可逆，性质稳定；易于标记和保存等优点。
基于免疫层析技术研制的免疫层析试纸条发展很快，能通过免疫反应的检测都能通过免疫层析技术进行。由于操作简单、快速、低成本等优点，非常适用于大量样品的初筛。目前广泛采用的免疫胶体金层析法试纸条存在以下不足之处：胶体金是一种纳米颗粒，制备胶体金纳米颗粒较难，且颗粒直径较难控制均匀；胶体金标记过程中用到强还原剂，同时要接触重金属者离子，对人体健康和安全有一定影响；胶体金标记过程是物理吸附过程，故液相时稳定性较差，只有当金颗粒集聚到一定量时，人肉眼才能观察到紫红的条带，且该颜色条带与背景对比度不大，从而限制了检测灵敏度，只能达到半定量的目的，且只能检测一种目标物，大大降低了检测效率。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条及其制备方法和应用，解决现有食源性致病菌的检测方法存在灵敏度低、成本高和检测效率低的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条，所述试纸的底层为支撑板，该支撑板上依次黏附有紧密相连的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述硝酸纤维素膜上依次设置有4条检测线和1条质控线，所述结合垫上包被有上转换纳米粒子-致病菌第一核酸适配体复合物；所述检测线上分别包被有致病菌第二核酸适配体-链霉亲和素复合物，所述致病菌第二核酸适配体的5’端修饰了生物素；所述质控线上包被有polyT互补序列-链霉亲和素复合物，所述polyT互补序列的5’端修饰了生物素。
所述polyT互补探针是与本发明中各致病菌核酸适配体序列中polyA序列互补，具体的，polyT互补序列为：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，其5’端标记生物素。
进一步，所述致病菌为大肠埃希氏菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。
进一步，肠埃希氏菌O157:H7第一核酸适配体Es-apt1的核苷酸序列为5’-ATCAAATGTGCAGATATCAAGACGATTTGTACAAGATAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’，其3’端采用生物素修饰；鼠伤寒沙门氏菌第一核酸适配体Sa-apt1的核苷酸序列为5’-TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAGAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’，其3’端采用生物素修饰；金黄色葡萄球菌第一核酸适配体St-apt1的核苷酸序列为5'-TCCCTACGGCGCTAACCCCCCCAGTCCGTCCTCCCAGCCTCACACCGCCACCGTGCTACAACAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’，其3’端采用生物素修饰；单增李斯特菌第一核酸适配体Li-apt1核苷酸序列为5’-TACTATCGCGGAGACAGCGCGGGAGGCACCGGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’，其3’端采用生物素修饰。
进一步，肠埃希氏菌O157:H7第二核酸适配体Es-apt2核苷酸序列为5'-GAGGAAAGTCTATAGCAG AGGAGATGTGTGAACCGAGTAA-3’，其5’端采用生物素修饰；鼠伤寒沙门氏菌第二核酸适配体Sa-apt2核苷酸序列为5'-GAGGAAAGTCTATAGCAGAGGAGATGTGTGAACCGAGTAA-3，其5’端采用生物素修饰；金黄色葡萄球菌第二核酸适配体St-apt2核苷酸序列为5'-TCCCTACGGCGCTAACCTCCCAACCGCTCCACCCTGCCTCCGCCTCGCCACCGTGCTACAAC-3’，其5’端采用生物素修饰；单增李斯特菌第二核酸适配体Li-apt2核苷酸序列为5'-TAGCGTGGGTAACCGTGTTGGGGGGTGCCA CGG TC-3’，其5’端采用生物素修饰。
进一步，所述上转换纳米粒子为氨基功能化上转换纳米颗粒，其粒径为15～30nm。
进一步，所述上转换纳米为NaYF4,Yb/Tm、NaYF 4:Yb/Er或NaYF 4:Yb/Ho等稀土元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒。
上述同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)亲和素偶联氨基功能化上转换纳米粒子的制备
称取上转换纳米材料分散于PBS缓冲溶液中，超声分散15～30min，加入戊二醛溶液，将上述混合溶液室温下振荡孵育1～2h，离心，弃上清，得到的固体粉末；再将所述固体粉末用PBS洗多次，并重悬于PBS中，超声分散，加入1.0mg/mL亲和素，室温下振荡孵育6～12h，离心分离，弃上清，将产物清洗多次，将所得沉淀物在37℃条件下干燥，即得到亲和素偶联氨基功能化上转换纳米粒子；
(2)上转换纳米粒子-致病菌第一核酸适配体复合物的制备
将步骤1)制备的亲和素偶联氨基功能化上转换纳米粒子溶于PBS中，超声分散，然后加入4种不同的生物素修饰的致病菌适配体，37℃孵育过夜，离心分离弃上清，将得到的沉淀用PBS缓冲液清洗多次，并用PBS缓冲液重悬，即得到4种不同的上转换纳米粒子-致病菌第一核酸适配体复合物；
(3)结合垫的制备
将玻璃纤维膜置于含质量百分数为1％NaCI、1％牛血清白蛋白、2％蔗糖、0.5％吐温-20和1％曲拉通的100mmol/L Tris-HCI缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h。
用三维平面点膜喷金仪将步骤2)制备的4种不同上的转换纳米粒子-致病菌第一核酸适配体复合物均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，37℃烘干后封装备用；
(4)硝酸纤维素膜的制备
将生物素修饰的致病菌第二适配体和链霉亲和素修饰的polyT序列分别均匀喷涂到硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，然后置于37℃干燥，封装后保存备用；
(5)试纸条的组装
在支撑板上按顺序粘贴上样品垫、结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，相邻粘贴物之间的重叠部分长度为2mm，用切割机切成4mm宽的试纸条，即得到同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条，与干燥剂一起装于铝箔袋中密封保存备用。
进一步，所述检测线和质控线上探针的喷液量为0.7μL/cm；所述相邻检测线之间间距为4mm，质控线与其最近的一条检测线的间隔距离为6mm。
上述同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条的使用方法，将适量样品溶液滴加到样品垫上，静止5～10min，在980nm激发，452nm发射波长下，检测检测线和质控线的荧光信号，判断样品中是否含有4种致病菌；若质控线和检测线中的一条或多条有荧光信号，则为阳性结果；若检测线不显现，质控线显现，则为阴性结果；若质控线不显现，则试纸条失效。
上述同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条在食品安全、环境监测中的检测应用。
本发明的检测原理：
目标物和结合垫上的上转换荧光纳米-适配体探针特异结合，随着毛细管作用继续层析到硝酸纤维素膜上，再与检测线上包被的不同目标物的另一核酸适配体发生特异性结合，在检测线(T线)上显现出荧光沉淀线；多余的上转换荧光纳米-适配体复合探针继续向前，核酸适配体上PolyA序列和质控线上包被的polyT互补探针发生结合，上转换纳米材料富集使得质控线(C线)显色。如果待测样品中不存在目标物时，上转换荧光纳米-适配体复合探针在T线上不产生富集，继续层析迁移和C线上的polyT互补探针发生结合，试纸条检测线不显色，而质控线显色(图2)。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、灵敏度高：上转换荧光纳米粒子可大幅提高信噪比，进而提高检测灵敏度。
2、同时检测4种致病菌：将4条食源性致病菌的适配体依次包被于玻璃纤维膜上，可满足多种食源性致病菌的同时快速检测，提高了检测效率，实现了大批样品的快速筛查。
3、成本低：适配体可体外人工合成，克服了抗体制备周期长、成本高的缺点，降低了试纸条生产成本。再者，相比于常规适配体试纸条，本发明的试纸条可同时检测4种食源性致病菌，检测成本更低。
附图说明
图1为荧光检测试纸条的结构示意图；
1.PVC板，2.样品垫，3.结合垫，4.硝酸纤维膜，5.检测线，6.质控线，7.吸水垫；
图2为荧光检测试纸条的检测原理示意图；
图3为荧光检测试纸条的检测结果判定示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规实验方法操作。
实施例1一种同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条
本实施例提供一种基于上转换纳米标记-适配体识别的4种致病菌荧光检测试纸条，包括PVC底板1，样品垫2，适配体功能化上转换纳米探针结合垫3，硝酸纤维素膜4和吸水垫7；所述硝酸纤维素膜4上依次设置有4条检测线5和质控线6；所述相邻粘贴物之间相互连接叠放。
所述结合垫(3)上包被有上转换纳米粒子-致病菌第一核酸适配体复合物；所述上转换纳米粒子为亲和素修饰的上转换纳米材料；所述第一核酸适配体为能特异性识别大肠埃希氏菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌，其3’端修饰了生物素，通过生物素-亲和素***，固定于上转换纳米粒子表面；
其中，肠埃希氏菌O157:H7第一核酸适配体Es-apt1的核苷酸序列：
5’-ATCAAATGTGCAGATATCAAGACGATTTGTACAAGATAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’；
鼠伤寒沙门氏菌第一核酸适配体Sa-apt1的核苷酸序列：
5’-TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAGAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’；
金黄色葡萄球菌第一核酸适配体St-apt1的核苷酸序列：
5'-TCCCTACGGCGCTAACCCCCCCAGTCCGTCCTCCCAGCCTCACACCGCCACCGTGCTACAACAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’；
单增李斯特菌第一核酸适配体Li-apt1核苷酸序列：
5’-TACTATCGCGGAGACAGCGCGGGAGGCACCGGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’；
所述检测线5上分别包被有致病菌第二核酸适配体-链霉亲和素复合物，其适配体5’端修饰了生物素；所述质控线6上包被有生物素化polyT互补序列-链霉亲和素复合物，其polyT互补序列5’端修饰了生物素。
其中，肠埃希氏菌O157:H7第二核酸适配体Es-apt2核苷酸序列：
5'-GAGGAAAGTCTATAGCAG AGGAGATGTGTGAACCGAGTAA-3’；
鼠伤寒沙门氏菌第二核酸适配体Sa-apt2核苷酸序列：
5'-GAGGAAAGTCTATAGCAGAGGAGATGTGTGAACCGAGTAA-3；
金黄色葡萄球菌第二核酸适配体St-apt2核苷酸序列：
5'-TCCCTACGGCGCTAACCTCCCAACCGCTCCACCCTGCCTCCGCCTCGCCACCGTGCTACAAC-3’；
单增李斯特菌第二核酸适配体Li-apt2核苷酸序列：
5'-TAGCGTGGGTAACCGTGTTGGGGGGTGCCA CGG TC-3’；
实施例2：一种同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条的制备方法
该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：
(1)亲和素偶联氨基功能化上转换纳米材料
定量称取10mg NaYF4,YB/Tm上转换纳米材料分散于5mL PBS(0.01mol/L)中，超声分散15min，加入1.25mL 25％的戊二醛溶液。然后，混合溶液室温下振荡孵育2h，离心，弃上清，得到的固体粉末。用0.01mol/L PBS洗三次，除去多余的戊二醛，粉末重悬于4mL0.01mol/L PBS中，超声分散，加入1mg/mL亲和素，室温下振荡孵育12h，离心分离，弃上清，将材料清洗多次，所得沉淀物在37℃条件下干燥，即得到亲和素修饰的NaYF4,YB/Tm。
(2)上转换纳米粒子-致病菌第一适配体复合探针的制备
称取2mg亲和素修饰的NaYF4,YB/Tm分散于1mL 0.01mol/L PBS中超声分散5min，加入100nmol/L适配体，37℃孵育过夜，离心分离，弃上清，并且用PBS缓冲液清洗多次以保证去除未与纳米材料连接的DNA单链，最后将得到的适配体功能化上转换纳米探针重悬于1mL PBS缓冲液中，4℃保存，即得到上转换纳米粒子-致病菌第一适配体复合探针。
(3)结合垫的制备
将玻璃纤维膜用裁剪刀切成一定规格的条状，然后置于含质量百分数为1％NaCI、1％牛血清白蛋白、2％蔗糖、0.5％吐温-20和1％曲拉通的100mmol/L Tris-HCI缓冲液中浸泡2h，37℃干燥2h，备用。
用三维平面点膜喷金仪将上述制备的上转换纳米粒子-核酸适配体复合探针均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，置于25℃烘干，得到配体功能化上转换纳米探针结合垫，封装备用。
(3)检测线和质控线的制备
用0.01mol/L PBS的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，配制1.0mg/mL的链霉亲和素溶液，将100μL 10μM的致病菌(大肠埃希氏菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌)第二适配体与25μL 1.0mg/mL生物素溶液混合，室温反应2h，反应溶液移到30KD超滤管，6000rpm，4℃离心20min，除去没有反应的适配体，用0.01mol/L PBS洗涂结合物，收集超滤管内的溶液，用0.01mol/L PBS定容至原体积，4℃保存备用。同样的方法制备polyT探针，即分别得到检测探针和质控探针，4℃保存备用。
用三维平面点膜喷金仪，将生物素修饰的致病菌第二适配体和链霉亲和素修饰的polyT序列(检测探针和质控探针)以0.7μL/cm的配速喷涂到硝酸纤维素膜上，分别得到4条检测线(T线)和1条质控线(C线)，相邻检测线之间间距为4mm，质控线与其最近的一条检测线的间隔距离为6mm。将喷好的NC膜置于25℃烘箱中烘干，4℃保存备用。
(4)试纸条的组装
在PVC底板上按顺序粘贴上玻璃纤维膜、适配体功能化上转换纳米探针结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，相邻粘贴物之间的重叠部分长度为2mm，用切割机切成4mm宽的试纸条，即得到组装好的适配体试纸条，与干燥剂一起装于铝箔袋中密封保存备用。
实施例3：同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条的使用方法
(1)试纸条检测
取出制备好的试纸条，将玻璃纤维膜端***到待测样品溶液中，等待10min后取出，在980nm激发，452nm发射波长下，检测T线和C线的荧光信号。
(2)结果判定
阳性：如果质控线6和检测线5上任意一条或者多条显色时，说明待测样品中含有目标菌，样品为阳性，结果判断见图3所示。
阴性：如果检测线5不显色，只有质控线6显色时，说明待测样品中不含有四种食源性致病菌，待测样品为阴性，结果判断见图3所示。
无效：如果质控线6不显色，则试纸条出现质量问题，检测结果无效，结果判断见图3所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 长江师范学院；
<120> 一种同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条及其制备方法和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atcaaatgtg cagatatcaa gacgatttgt acaagataaa aaaaaaaaaa aaaa 54
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tatggcggcg tcacccgacg gggacttgac attatgacag aaaaaaaaaa aaaaaaaa 58
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccctacggc gctaaccccc ccagtccgtc ctcccagcct cacaccgcca ccgtgctaca 60
acaaaaaaaa aaaaaaaaaa 80
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tactatcgcg gagacagcgc gggaggcacc ggggaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 53
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaggaaagtc tatagcagag gagatgtgtg aaccgagtaa 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaggaaagtc tatagcagag gagatgtgtg aaccgagtaa 40
<210> 7
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tccctacggc gctaacctcc caaccgctcc accctgcctc cgcctcgcca ccgtgctaca 60
ac 62
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tagcgtgggt aaccgtgttg gggggtgcca cggtc 35
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tttttttttt tttttttt 18

Claims (10)

1.一种同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条，其特征在于，所述试纸的底层为支撑板，该支撑板上依次黏附有紧密相连的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述硝酸纤维素膜上依次设置有4条检测线和1条质控线，所述结合垫上包被有上转换纳米粒子-致病菌第一核酸适配体复合物；所述检测线上分别包被有致病菌第二核酸适配体-链霉亲和素复合物，所述致病菌第二核酸适配体的5’端修饰了生物素；所述质控线上包被有polyT互补序列-链霉亲和素复合物，所述polyT互补序列的5’端修饰了生物素。
2.根据权利要求1所述同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条，其特征在于，所述致病菌为大肠埃希氏菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。
3.根据权利要求2所述同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条，其特征在于，肠埃希氏菌O157:H7第一核酸适配体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，鼠伤寒沙门氏菌第一核酸适配体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，金黄色葡萄球菌第一核酸适配体核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，单增李斯特菌第一核酸适配体核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求2所述同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条，其特征在于，肠埃希氏菌O157:H7第二核酸适配体核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，鼠伤寒沙门氏菌第二核酸适配体核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，金黄色葡萄球菌第二核酸适配体核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，单增李斯特菌第二核酸适配体核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.根据权利要求1所述同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条，其特征在于，所述上转换纳米粒子为氨基功能化上转换纳米颗粒，其粒径为15～30nm。
6.根据权利要求5所述同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条，其特征在于，所述上转换纳米粒子为NaYF4,Yb/Tm、NaYF 4:Yb/Er或NaYF 4:Yb/Ho。
7.如权利要求1～6任一项所述同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)亲和素偶联氨基功能化上转换纳米粒子的制备
称取上转换纳米材料分散于PBS缓冲溶液中，超声分散15～30min，加入戊二醛溶液，将上述混合溶液室温下振荡孵育1～2h，离心，弃上清，得到的固体粉末；再将所述固体粉末用PBS洗多次，并重悬于PBS中，超声分散，加入1.0mg/mL亲和素，室温下振荡孵育6～12h，离心分离，弃上清，将产物清洗多次，将所得沉淀物在37℃条件下干燥，即得到亲和素偶联氨基功能化上转换纳米粒子；
(2)上转换纳米粒子-致病菌第一核酸适配体复合物的制备
将步骤1)制备的亲和素偶联氨基功能化上转换纳米粒子溶于PBS中，超声分散，然后加入4种不同的生物素修饰的致病菌适配体，37℃孵育过夜，离心分离弃上清，将得到的沉淀用PBS缓冲液清洗多次，并用PBS缓冲液重悬，即得到4种不同的上转换纳米粒子-致病菌第一核酸适配体复合物；
(3)结合垫的制备
用三维平面点膜喷金仪将步骤2)制备的4种不同上转换纳米粒子-致病菌第一核酸适配体复合物均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，37℃烘干后封装备用；
(4)硝酸纤维素膜的制备
将生物素修饰的致病菌第二适配体和链霉亲和素修饰的polyT序列分别均匀喷涂到硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，然后置于37℃干燥，封装后保存备用；
(5)试纸条的组装
在支撑板上按顺序粘贴上样品垫、结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，相邻粘贴物之间的重叠部分长度为2mm，用切割机切成4mm宽的试纸条，即得到同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条，与干燥剂一起装于铝箔袋中密封保存备用。
8.根据权利要求7所述同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述检测线和质控线上探针的喷液量为0.7μL/cm；所述相邻检测线之间间距为4mm，质控线与其最近的一条检测线的间隔距离为6mm。
9.一种如权利要求1～6任一项所述同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条的使用方法，其特征在于：将适量样品溶液滴加到样品垫上，静止5～10min，在980nm激发，452nm发射波长下，检测检测线和质控线的荧光信号，判断样品中是否含有4种致病菌；若质控线和检测线中的一条或多条有荧光信号，则为阳性结果；若检测线不显现，质控线显现，则为阴性结果；若质控线不显现，则试纸条失效。
10.如权利要求1～6任一项所述同时检测4种致病菌的荧光检测试纸条在食品安全、环境监测中的检测应用。
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