CN113480652B - 一种重组cho细胞发酵培养生产重组egfr抗体活性分子的方法 - Google Patents

一种重组cho细胞发酵培养生产重组egfr抗体活性分子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组CHO细胞发酵培养生产重组EGFR抗体活性分子的方法。所述方法包括下述步骤：(1)接种培养：将用于生产重组EGFR抗体活性分子的CHO细胞株种子液接种于第一培养基中，得初始发酵液，并发酵培养；(2)补料发酵：接种培养发酵48‑96h后，每天或每隔1天或每隔2天补加1‑8％初始培养体积的第二培养基，继续发酵。本发明的方法获得的发酵液副产物少，产量高，非常适合工业化生产。

Description

一种重组CHO细胞发酵培养生产重组EGFR抗体活性分子的方法
技术领域
本发明涉及生物医药发酵技术领域，具体而言，涉及一种重组CHO细胞发酵培养生产重组EGFR抗体活性分子的方法。
背景技术
表皮生长因子受体，即EGFR(epidermal growth factor receptor，简称为EGFR)是原癌基因c-erbB1的表达产物，是一个170kDa的跨膜糖蛋白受体酪氨酸激酶，在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。EGFR的单克隆抗体西妥昔单抗和帕尼单抗的问世大大拓宽了转移性结直肠肿瘤疗效。
糖基化作为抗体最重要的翻译后修饰对抗体的生物活性具有重要的作用，不同糖基化修饰对单抗药物的药化药代特性及药效的发挥有着重要的作用，因此糖基化水平和糖基化修饰类型是单抗药物的重要参数。而中国专利CN 105779394B以葡萄糖和谷氨酸单钠盐为控制参数进行流加培养降低抗体酸性峰含量和改良抗体糖型的细胞培养方法，缺乏对甘露糖修饰的研究。由于甘露糖修饰的单抗分子与C1q的亲和力较低，其CDC活性也较低。甘露糖型对单抗的药代动力学性质影响较大，大量文献报道甘露糖IgG分子在人血循环中具有较短的半衰期。甘露糖结构在人体中容易引起免疫反应。细胞株和生产工艺的变化常也伴随着甘露糖含量的变化。鉴于甘露糖型对单抗产品的活性、药代动力学性质、免疫原性都具有重要影响，甘露糖的糖型和含量被视为单抗产品的关键质量属性(CQA)之一，对甘露糖的控制显得尤为重要。现有的改变糖基化的方法主要是通过基因水平来改造宿主细胞相关的糖基化酶进而改变抗体的糖型或糖基化水平，但该方法周期长，并且由于其安全性、复杂性和稳定性需要较长时间的验证和确定，不利于生物制品的审批。
使用商业化培养基的实践操作中所生产的EGFR抗体与市售西妥昔单抗唾液酸修饰方面，N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)和N-乙酰神经氨酸(NANA)均有，而NAGA易导致免疫反应，临床上出现多例毒副作用的报导。
由于单抗类制品在翻译后修饰过程中产生的电荷异质性对单抗生物学功能的发挥及其重要，因而其成为单抗生产工艺中需要控制的非常重要的质量属性，也是生产工艺稳定性的重要反应指标。电荷异质性产生酸碱峰，而重组EGFR抗体酸性峰的生物学活性只有主峰和碱性峰生物学活性的30-40％，但是酸性峰、主峰和碱性峰具有相似的化学性质，通过后期纯化分离控制电荷异质性具有一定的挑战性，而通过控制细胞培养工艺流程来控制抗体电荷异质性的方法也具有一定的难度，现有的技术表明，现有细胞培养工艺，如专利申请申请号201610153532.8，通过葡萄糖和谷氨酸单钠盐为控制参数进行流加培养，增大谷氨酰胺浓度可以降低酸性峰，使得酸性峰含量由40.35％逐渐降低到37.5％。虽然酸性组分得到了降低，但是占比依然高达37.5％。再加上作为生物制品必须批次间保持一致，使其成为本领域一直难于解决的问题。
在细胞培养过程中，决定单克隆抗体糖基化的主要因素有细胞表达***、培养模式、生产工艺、培养基等，这几个方面都会改变抗体糖基化修饰，对单克隆抗体研究及生产等相关研究带来了巨大挑战。现有技术报导，即使所有补料成分相同，仅培养模式由分批培养变成分批补料式培养，糖基化修饰都有明显不同。特定表达的宿主细胞，即使只有一个补料成分不同，糖基化修饰也明显不同。细胞培养基中，L-谷氨酰胺是一种必需氨基酸，谷氨酰胺不仅可作为培养细胞的能量来源，而且参与蛋白质的合成和核酸代谢。谷氨酰胺缺乏会导致细胞生长不良甚至死亡，其作用非常重要。对于一些特定的细胞，也有相应的浓度要求。例如对于CHO细胞，谷氨酰胺的浓度要达到4mmol/L时，方可满足细胞的正常生长。但有学者研究发现，对于有的哺乳动物细胞，谷氨酰胺的浓度达到2mmol/L时，细胞就可以正常生长。谷氨酰胺作为一种添加剂，L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。半胱氨酸是一种必需氨基酸，属于含巯基的氨基酸，是合成谷胱甘肽的必需氨基酸。胱氨酸是半胱氨酸的二聚体，在两个半胱氨酸之间形成二硫键即为胱氨酸，半胱氨酸盐酸盐具有还原性,可以消耗培养基中的氧。商业化培养基中对于配方都是保密的，其氨基酸组成和含量不得而知，谷氨酰胺、半胱氨酸等的添加需要结合其他组分和发酵工艺进行筛选，才能发挥培养基的最大优势。而补加量的多少和时机，又受到表达***、生产工艺很大的影响。
因此，如何在表达宿主细胞已知的前提下，通过细胞培养条件提高产量，并对甘露糖、唾液酸、电荷异质性进行很好的控制成为本领域一直难于解决的问题。
发明内容
本发明提供一种副产物少，产量高的重组CHO细胞发酵生产重组EGFR抗体活性分子的方法。
一种重组CHO细胞发酵生产重组EGFR抗体活性分子的方法，包括下述步骤：
(1)接种培养：将用于生产重组EGFR抗体活性分子的CHO细胞株种子液接种于第一培养基中，得初始发酵液，并发酵培养；
(2)补料发酵：接种培养发酵48-96h后，每天或每隔1天或每隔2天补加1-8％初始发酵液体积的第二培养基，继续发酵；
(3)当细胞活率≤50％或培养14-20天后，终止培养，收获发酵液；
其中，所述第一培养基以CDM4PERMab为基质，且还添加有：4-8mM/LL-Gln(L-谷氨酰胺)和2-5g/L Sheff-CHO PF ACF；
所述第二培养基以高效补料培养基为基质，且还添加有：20-80g/LSheff-CHO PFACF；
且补料发酵时，添加L-胱氨酸二盐酸盐，使得发酵液中含有40-80mg/L的L-胱氨酸二盐酸盐；且
发酵时，发酵液葡萄糖浓度为3-6g/L，pH为7.2±0.3。
在另一优选例中，所述高效补料培养基为2*103A高效补料培养基。
在另一优选例中，所述第一培养基还包括0.01-1wt％泊洛沙姆188，较佳地，0.02-0.3wt％。
在另一优选例中，所述细胞的接种密度为1*105～1*106cells/ml。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述发酵具有一个或多个选自下组的技术特征：
(i)发酵培养的温度37±1℃；
(ii)pH为7.0-7.3；
(iii)DO:40±2％；
(iv)搅拌：75±10rpm；
(v)表通空气：2.0±0.2LPM；或
(vi)底通空气：1.5±0.2LPM。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述发酵具有一个或多个选自下组的技术特征：
(i)pH为7.0-7.3；
(ii)DO:40±2％；
(iii)搅拌：75±10rpm；
(iv)表通空气：2.0±0.2LPM；或
(i)底通空气：1.5±0.2LPM。
在另一优选例中，在步骤(2)中，所述补料发酵是在发酵72h-96h后，每天或每隔1天或每隔2天补加1-8％初始培养体积的第二培养基，继续发酵。
在另一优选例中，在步骤(2)中，所述补料发酵是在发酵72-96h后，每天或每隔1天或每隔2天补加2-8％初始培养体积的第二培养基，继续发酵。
在另一优选例中，所述补料发酵为梯度加料：
(a)第一阶段：在补料发酵的192-216h内，每隔1天或每隔2天补加5-6％初始培养体积的第二培养基，且保持发酵液葡萄糖浓度为5-6g/L；
(b)第二阶段：在第一阶段后的96-120h内，每隔1天或每隔2天补加2-4％初始培养体积的第二培养基，且保持发酵液葡萄糖浓度为2.5-3.5g/L；和
(c)第三阶段：在第二阶段后，每隔1天或每隔2天补加1-1.5％初始培养体积的第二培养基，且保持发酵液葡萄糖浓度为2.5-3.5g/L。
在另一优选例中，第二培养基补加的总体积为初始发酵液体积的25-40％，较佳地，28-35％。
在步骤(2)补料发酵中，当活细胞密度达到N*106cells/ml,其中N为大于等于8的整数时，发酵温度以如下方式调整：发酵温度＝40-N/2，且发酵温度最低为30℃。
在另一优选例中，在步骤(2)补料发酵中，当N为大于或等于8时，按发酵液终浓度为0.4-0.6mM/L添加丁酸钠。本发明中丁酸钠具有抑制细胞生长的作用，同时有助于改善细胞的代谢情况，并提高抗体产量。
在另一优选例中，在发酵中，保持发酵液中的葡萄糖浓度为1.5-6.5g/L，较佳地2.0-5.5g/L，更佳地4.5-5.5g/L。
在另一优选例中，收获的发酵液中重组EGFR抗体中甘露糖MAN5的水平为＜1.2％，MAN6,MAN7,MAN8和MAN9无检出。收集的发酵液中重组EGFR抗体中，唾液酸NGNA无检出，NANA占蛋白摩尔比为2-3mol/mol。酸性组分小于8％。产品产量高，免疫反应低，适合产业化生产和应用。
在另一优选例中，所述收获的发酵液中重组EGFR抗体活性分子的含量≥6.5g/L，更佳地，≥7.0g/L，通常为7.5-9g/L。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实验例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为实验例1、1-1和1-2细胞活率(％)曲线。
图2为实验例1、1-1和1-2活细胞密度(106cells/mL)曲线。
图3实验例和对比例发酵终止时细胞活率(％)。
图4实验例和对比例发酵终止时活细胞密度(106cells/ml)。
图5实验例和对比例发酵终止时抗体表达量(g/l)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种重组CHO细胞发酵培养基及其发酵培养生产重组EGFR抗体活性分子的方法，通过优化培养基组成及发酵培养工艺，从而得到发酵液EGFR抗体活性分子MAN5水平小于1.2％、且重组EGFR抗体甘露糖MAN5的水平低于1.2％，MAN6,MAN7,MAN8和MAN9未检出。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“室温”或“常温”是指温度为4-40℃，较佳地，25±5℃。
重组EGFR抗体活性分子
本发明中，所述EGFR抗体活性分子(即西妥珠单抗)的氨基酸序列如下：重链
SEQ ID NO:1
QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVSGFSLT NYGVHWVRQS PGKGLEWLGV 50
IWSGGNTDYN TPFTSRLSIN KDNSKSQVFF KMNSLQSNDT AIYYCARALT 100
YYDYEFAYWG QGTLVTVSAA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD 150
YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY 200
ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK 250
DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS 300
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV 350
YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 400
DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK 449
轻链：
SEQ ID NO:2
DILLTQSPVI LSVSPGERVS FSCRASQSIG TNIHWYQQRT NGSPRLLIKY 50
ASESISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYCQQ NNNWPTTFGA 100
GTKLELKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 150
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 200
LSSPVTKSFN RGEC 214
制备方法
本发明提供了一种重组CHO细胞发酵生产重组EGFR抗体活性分子的方法，包括下述步骤：
(1)接种培养：将用于生产重组EGFR抗体活性分子的CHO细胞株种子液接种于第一培养基中，得初始发酵液，并发酵培养；
(2)补料发酵：接种培养发酵48-96h后，每天或每隔1天或每隔2天补加1-8％初始发酵液体积的第二培养基，继续发酵；
(3)当细胞活率≤50％、细胞密度≥10×106cells/mL或培养16-20天后，终止培养，收获发酵液；
其中，所述第一培养基以CDM4PERMab为基质，且还添加有：4-8mM/L L-Gln(L-谷氨酰胺)和2-5g/L Sheff-CHO PF ACF；
所述第二培养基以高效补料培养基为基质，且还添加有：20-80g/L Sheff-CHO PFACF；
且补料发酵时，添加L-胱氨酸二盐酸盐，使得发酵液中含有40-80mg/L的L-胱氨酸二盐酸盐；且
发酵时，发酵液葡萄糖浓度为3-6g/L，pH为7.2±0.3。
在另一优选例中，所述高效补料培养基为2*103A高效补料培养基。
在另一优选例中，所述第一培养基还包括0.01-1wt％泊洛沙姆188，较佳地，0.02-0.3wt％。
在另一优选例中，所述细胞的接种密度为1*105～1*106cells/ml。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述发酵具有一个或多个选自下组的技术特征：
(i)发酵培养的温度37±1℃；
(ii)pH为7.0-7.3；
(iii)DO:40±2％；
(iv)搅拌：75±10rpm；
(v)表通空气：2.0±0.2LPM；或
(vi)底通空气：1.5±0.2LPM。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述发酵具有一个或多个选自下组的技术特征：
(i)pH为7.0-7.3；
(ii)DO:40±2％；
(iii)搅拌：75±10rpm；
(iv)表通空气：2.0±0.2LPM；或
(i)底通空气：1.5±0.2LPM。
在另一优选例中，在步骤(2)中，所述补料发酵是在发酵72h-96h后，每天或每隔1天或每隔2天补加1-8％初始培养体积的第二培养基，继续发酵。
在另一优选例中，在步骤(2)中，所述补料发酵是在发酵72-96h后，每天或每隔1天或每隔2天补加2-8％初始培养体积的第二培养基，继续发酵。
在另一优选例中，所述补料发酵为梯度加料：
(a)第一阶段：在补料发酵的192-216h内，每隔1天或每隔2天补加5-6％初始培养体积的第二培养基，且保持发酵液葡萄糖浓度为5-6g/L；
(b)第二阶段：在第一阶段后的96-120h内，每隔1天或每隔2天补加2-4％初始培养体积的第二培养基，且保持发酵液葡萄糖浓度为2.5-3.5g/L；和
(c)第三阶段：在第二阶段后，每隔1天或每隔2天补加1-1.5％初始培养体积的第二培养基，且保持发酵液葡萄糖浓度为2.5-3.5g/L。
在步骤(2)补料发酵中，当活细胞密度达到N*106cells/ml时，发酵温度以如下方式调整：发酵温度＝40-N/2，其中N为大于等于8的整数，且发酵温度最低为30℃。
在另一优选例中，在步骤(2)补料发酵中，当N为大于或等于8时，按发酵液终浓度为0.4-0.6mM/L添加丁酸钠。本发明中丁酸钠具有抑制细胞生长的作用，同时有助于改善细胞的代谢情况，并提高抗体产量。
在另一优选例中，在发酵中，保持发酵液中的葡萄糖浓度为1.5-6.5g/L，较佳地2.0-5.5g/L，更佳地4.5-5.5g/L。
在另一优选例中，收获的发酵液中重组EGFR抗体中甘露糖MAN5的水平＜1.2％，MAN6,MAN7,MAN8和MAN9无检出。收集的发酵液中重组EGFR抗体中，唾液酸NGNA无检出，NANA占蛋白摩尔比为2-3mol/mol。酸性组分小于8％。产品产量高，免疫反应低，适合产业化生产和应用。
在另一优选例中，所述收获的发酵液中重组EGFR抗体活性分子的含量≥6.5g/L，更佳地，≥7.0g/L，通常为7.5-9g/L。
本发明的主要优点包括：
1.本发明通过特定的第一培养基和第二培养基组合，并在发酵48-96h后，每隔1-3补加1-8％的条件下添加第二培养基进行发酵，有效控制发酵液中重组EGFR抗体活性分子MAN5水平控制在1.2％以下；
2.在本发明通过特定的第一培养基和第二培养基组合，发酵液中MAN6,MAN7,MAN8,MAN9未检出，有利于质量控制；
3.本发明在细胞密度达到当活细胞密度达到8*106cells/ml时，调整发酵温度，并添加丁酸钠，进一步促进EGFR抗体活性分子表达，使得重组EGFR抗体活性分子表达量高达7g/L以上。
4.NGNA未检出，NANA占蛋白摩尔比为2-3mol/mol，免疫反应低，安全性好。
5.酸性组分小于10％，产品生物活性高。
6.本发明方法发酵14-20天终止，细胞活率可达90％以上。
7.本发明的方法重复性好，适合工业化生产。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实验例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实验例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或《细胞生物学实验教程》(王金发，何炎明天，刘兵著，科学出版社，第二版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本申请方法适用于不同的生物反应器，如2L，5L，50L，100L，250L，1000L，2000L等规格。
试剂：(培养基CDM4PERMab TM(购自HyClone),L-Gln(L-谷氨酰胺)(购自Gibco),Sheff-CHO PF ACF(购自Kerry))和泊洛沙姆188(Poloxamer 188，购自Cytiva)；2*103A高效补料培养基(购自上海多宁)；L-胱氨酸二盐酸盐(购自Sigma)。
本申请中，每天，指每24±4h；每隔1天，指每48±4h；每隔2天，指每72±4h。
本申请，细胞活率，活细胞密度均采用贝克曼公司的细胞技术仪检测。
本申请中的检测方法，若没有特别说明，其余均为参照《中国药典》2015年版三部通则测定。
其中：
唾液酸含量测定是采用高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)，其中高效液相色谱仪为Agilent(1260)，唾液酸荧光标记试剂盒(TAKARA(4400))，色谱柱为Jupiter 5μm C18；
电荷异质性测定是采用阳离子交换色谱测定(IEC-HPLC)(经CpB酶切)，其中高效液相色谱仪为Agilent(1260)，色谱柱为Thermo propac WCX-10，4×250mm；在色谱图中，在主峰(即主成分)之前洗脱的蛋白相关峰被分类为酸性组分；相对地，在主峰之后洗脱的蛋白相关峰被分类为碱性组分。主成分、酸性组分和碱性组分的相对量可以表示为占总峰面积的百分数。
抗体表达量的测定是采用亲和色谱测定(Protein A作为配基)，其中高效液相色谱仪为Agilent(1260)，色谱柱为AbsolutTM A色谱柱。
高甘露糖组分的测定采用质谱法在亚基水平进行测定，用FabRICATOR酶将分子解离为Fab亚基和Fc亚基，再通过反向色谱串联质谱测定Fc亚基分子量，再通过提取离子峰面积来计算Fc亚基上N糖型为高甘露糖的组分的含量。质谱仪为Waters Xevo G2-XS QTof，色谱柱：ACQUITY UPLC BEH300 C4
下述实验例中的种子液可购自上海景泽生物技术有限公司。
实验例1发酵液添加丁酸钠和发酵温度调整试验
一种重组CHO细胞发酵培养生产重组EGFR抗体活性分子的方法，按下述方法进行:
培养基准备：
第一培养基为：CDM4PERMab140L,6mM/L的L-Gln；3g/L的Sheff-CHO PF ACF,0.2％的泊洛沙姆188，pH调整为7.2；
第二培养基组成为：高效补料培养基，50g/L的Sheff-CHO PF ACF；pH调整为7.2；其中高效补料培养基采用2*103A高效补料培养基；
(1)接种培养：将用于生产重组EGFR抗体活性分子的CHO细胞株按照6*105cells/ml接种于第一培养基中，发酵培养；发酵培养的温度37℃，pH:7.00，DO:40％；搅拌：75rpm；空气(表通)：2.0LPM；空气(底通)：1.5LPM；
(2)补料发酵培养：
补料发酵：接种培养发酵72h后，补加5％初始培养体积的第二培养基，继续发酵48h；以后每48h补加5％初始培养体积的第二培养基，继续发酵；
添加第二培养基同时(±4小时)添加L-胱氨酸二盐酸盐，使L-胱氨酸二盐酸盐在发酵液中浓度为50mg/L；
发酵每24h，测定活细胞密度。发酵72h测定活细胞密度为14×106cells/mL。根据公式发酵温度＝40-N/2，其中N为大于等于8的整数，且发酵温度最低为30℃。调整发酵温度为33℃(即N＝14)。保持此温度直至发酵结束。
发酵液保持葡萄糖浓度为5g/L；
发酵参数为，pH:7.00，DO:40％；搅拌：75rpm；空气(表通)：2.0LPM；空气(底通)：1.5LPM；渗透压为400mOsm/kg。
(3)发酵至第20天，终止培养，收获发酵液。
实验例1-1
所有步骤同实验例1，区别为发酵72h添加丁酸钠，使发酵液中丁酸钠终浓度为0.5mM/L。
实验例1-2
所有步骤同实验例1，区别为发酵采用恒定温度(37℃)进行。
实验结果
实验例1、实验例1-1和实验例1-2中抗体表达量、甘露糖、酸性组分和唾液酸等测定结果与市售西妥昔唾液酸比较见下表1
表1
Figure BDA0003190321730000111
由上表可知，该方法生产的抗体表达量高，实验例中抗体表达量范围在7.7-8.7g/L。实际上，发明人在多个筛选测试中，细胞培养结果得到的酸性组分一直保持在20％以上水平，后来意外地发现，本发明的技术方案可有效的降低酸性峰比例，保持在6.0-6.4％。且本发明方法获得的抗体只含NANA，不含NAGA，故免疫原性非常低。而市售同类产品西妥昔单抗，NAGA占EGFR抗体蛋白摩尔浓度为1.1，有较高的安全性风险。
该发酵方法只检测出MAN5，含量为1.1-1.2％，MAN6、MAN7、MAN8和MAN9未检出，酸性组分比例(％，CEX-HPLC，cpB酶切)介于6.0-6.4％，有利于质量控制。
细胞生长曲线见图1和图2。可以看出，实验例1、实验例1-1和实验例1-2中，细胞发酵20天，细胞活率均超过80％，活细胞密度大于20×106cells/ml，这说明细胞生长状况良好。
测试例2不同培养基配置和市售培养基发酵工艺试验
按表2比例配置3个本申请的培养基。
表2
培养基 组分 实验例2 实验例3 实验例4
第一培养基 CDM4PERMab
第一培养基 L-Gln(mM/L) 6 4 8
第一培养基 Sheff-CHO PF ACF(g/L) 3 2 5
第一培养基 泊洛沙姆188(％) 0.2 0.2 0.2
第二培养基 2*103A高效补料培养基
第二培养基 Sheff-CHO PF ACF(g/L) 50 80 20
L-胱氨酸二盐酸盐(mg/L) 50 40 80
其中L-胱氨酸二盐酸盐在补料发酵阶段直接添加到发酵液中，发酵液中L-胱氨酸二盐酸盐浓度分别为：实验例2为50mg/L；实验例3为40mg/L；实验例4为80mg/L。
对比例1-10
按照表3配置10例对比例培养基
表3
Figure BDA0003190321730000121
其中L-胱氨酸二盐酸盐直接添加到发酵液中，发酵液中L-胱氨酸二盐酸盐浓度分别如表格所示。
对比例11与实验例2基本相同，不同点仅在于将CDM4PERMab培养基等比例替换为SIGMA公司的培养基Immediate advantage F#1。
对比例12与实验例2基本相同，不同点仅在于将CDM4PERMab培养基等比例替换为Invitrogen公司的CD Forti CHO。
对比例13与实验例2基本相同，不同点仅在于将实验例2中的CDM4PERMab培养基等比例替换为HYCLONE公司培养基Cell boost6。
实验例2中生产重组EGFR抗体活性分子的方法，按下述方法进行:
培养基准备：
第一培养基包括：CDM4PERMab,6mM/L的L-Gln,3g/L的Sheff-CHO PF ACF,0.2％的泊洛沙姆188，pH调整为7.2；
第二培养基组成为：高效补料培养基，50g/L的Sheff-CHO PF ACF；
其中高效补料培养基采用2*103A高效补料培养基；pH调整为7.2；
(1)接种培养：将用于生产重组EGFR抗体活性分子的复活CHO细胞株按照6*105cells/ml接种于第一培养基中，发酵培养；发酵培养的温度37℃，pH:7.00，DO:40％；搅拌：75rpm；空气(表通)：2.0LPM；空气(底通)：1.5LPM；
(2)补料发酵培养：
补料发酵：
补料发酵(1)：接种培养发酵72h后，补加5％初始培养体积的第二培养基，并添加L-胱氨酸二盐酸盐至发酵液中L-胱氨酸二盐酸盐终浓度为50mg/kg，继续发酵；
发酵液保持葡萄糖浓度为5g/L；
发酵72h和96h，测定活细胞密度为14×106cells/mL和17×106cells/mL。根据公式发酵温度＝40-N/2，其中N为大于等于8的整数，且发酵温度最低为30℃。发酵72h，调整发酵温度至33℃；发酵96h，调整发酵发酵温度为31.5℃。
补料发酵(2)：在发酵进行到120h时，即补料发酵(1)发酵48h后，补加6％初始培养体积的第二培养基，继续发酵；
发酵120h，测定活细胞密度为21.2×106cells/mL。根据公式发酵温度＝40-N/2，其中N为大于等于8的整数，且发酵温度最低为30℃。调整发酵温度为30℃，至发酵结束，温度保持不变。
发酵液保持葡萄糖浓度为5.5g/L；
补料发酵(3)：在发酵进行到168h、216h时，分别补加6％初始培养体积的第二培养基，继续发酵；
发酵液保持葡萄糖浓度为5.5g/L；
补料发酵(4)：在发酵进行到264h、312h时，分别补加3％初始培养体积的第二培养基，继续发酵；
发酵液保持葡萄糖浓度为3g/L；
补料发酵(5)：在发酵进行到360h、408h、456h时，分别补加1％初始培养体积的第二培养基，继续发酵；
发酵液保持葡萄糖浓度为3g/L；
补料发酵(1)和补料发酵(2)、补料发酵(3)、补料发酵(4)、补料发酵(5)均采用第二培养基，培养过程中工艺条件如下：pH:7.00，DO:40％，搅拌：78rpm，空气(表通)：2.0LPM，空气(底通)：1.5LPM，渗透压为400mOsm/kg。
(3)发酵至第20天，终止培养，收获发酵液。
实验例2-4和对比例1-10，除了表格所示培养基各组分含量不同外，其余工艺全部相同。
结果见图3-5，发酵培养20天，实验例2-4的细胞活率、活细胞密度和抗体表达量远远高于对比例1-10，并超过对比例11、对比例12和对比例13的培养基，对比例11、对比例12和对比例13的细胞活率、活细胞密度和抗体表达量均只有实验例2的65-86％。这说明运用本发明培养基组分、培养工艺发酵CHO为宿主细胞的抗体显示出了很好的优越性。
测试例3不同补料量和补料时间试验
在实验例2的基础上，其他工艺步骤和条件不变，按表格所列初始培养体积比列和补料时间分批补加第二培养基。
表4补加第二培养基所占初始培养体积比例和补料时间
Figure BDA0003190321730000141
Figure BDA0003190321730000151
实验结果
表5实验例2和实验例5-6对比例14发酵终止时细胞活率(％)、细胞密度(10^6cells/mL)和抗体表达量
Figure BDA0003190321730000152
由上表5可知，该方法每24h补料和每48h补料效果好于每72h补料。而加大补料比例，效果远远不如实验例2和实验例5-6。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 成都景泽生物制药有限公司；上海景泽生物技术有限公司；江苏璟泽生物医药有限公司
<120> 一种重组CHO细胞发酵培养生产重组EGFR抗体活性分子的方法
<130> P2021-2072
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65                  70                  75                  80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
            260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
    370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
                405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
            420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        435                 440                 445
Lys
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210

Claims (5)

1.一种重组CHO细胞发酵生产重组EGFR抗体活性分子的方法，包括下述步骤：
(1)接种培养：将用于生产重组EGFR抗体活性分子的CHO细胞株种子液接种于第一培养基中，得初始发酵液，并发酵培养；
(2)补料发酵：接种培养发酵48-96h后，每天或每隔1天或每隔2天补加1-8%初始发酵液体积的第二培养基，继续发酵；
(3)当细胞活率≤50%或培养14-20天后，终止培养，收获发酵液；
其中，所述第一培养基以CDM4PERMab为基质，且还添加有：4-8mM/L L-Gln(L-谷氨酰胺)和2-5g/L Sheff-CHO PF ACF；
所述第二培养基以高效补料培养基为基质，且还添加有：20-80g/L Sheff-CHO PFACF；
且补料发酵时，添加L-胱氨酸二盐酸盐，使得发酵液中含有40-80mg/L的L-胱氨酸二盐酸盐；且
发酵时，发酵液葡萄糖浓度为3-6 g/L;
所述高效补料培养基为2*103A高效补料培养基;
所述第一培养基还包括0.01-1wt%泊洛沙姆188；
步骤(1)中，所述发酵具有下组的技术特征：
(i)发酵培养的温度37±1℃；
(ii)pH为7.0-7.3;
(iii)DO:40±2%；
(iv)搅拌：75±10rpm；
(v)表通空气：2.0±0.2 LPM；和
(vi)底通空气：1.5±0.2 LPM；
步骤(2)中，所述发酵具有下组的技术特征：
(i)pH为7.0-7.3;
(ii)DO:40±2%；
(iii)搅拌：75±10rpm；
(iv)表通空气：2.0±0.2 LPM；和
(i)底通空气：1.5±0.2 LPM；
在步骤(2)中，所述补料发酵是在发酵72h-96h后，每天或每隔1天或每隔2天补加1-8%初始培养体积的第二培养基，继续发酵；
其中，所述补料发酵为梯度加料：
（a）第一阶段：在补料发酵的192-216h内，每隔1天或每隔2天补加5-6%初始培养体积的第二培养基，且保持发酵液葡萄糖浓度为5-6g/L；
（b）第二阶段：在第一阶段后的96-120h内，每隔1天或每隔2天补加2-4%初始培养体积的第二培养基，且保持发酵液葡萄糖浓度为2.5-3.5g/L；和
（c）第三阶段：在第二阶段后，每隔1天或每隔2天补加1-2%初始培养体积的第二培养基，且保持发酵液葡萄糖浓度为2.5-3.5g/L；
在步骤(2)补料发酵中，当活细胞密度达到N*106cells/ml，其中N为大于等于8的整数时，发酵温度以如下方式调整：发酵温度=40-N/2，且发酵温度最低为30℃；且
在步骤(2)补料发酵中，当N为大于或等于8时，按发酵液终浓度为0.4-0.6mM/L添加丁酸钠。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵中，保持发酵液中的葡萄糖浓度为1.5-6.5g/L。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在发酵中，保持发酵液中的葡萄糖浓度为2.0-5.5g/L。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在发酵中，保持发酵液中的葡萄糖浓度为4.5-5.5g/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养基中泊洛沙姆188为0.02-0.3wt%。
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