CN114478359B - 氨基甲酸酯类trpv1拮抗/faah抑制双靶点药物及其制备方法和应用 - Google Patents

氨基甲酸酯类trpv1拮抗/faah抑制双靶点药物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氨基甲酸酯类TRPV1拮抗/FAAH抑制双靶点药物及其制备方法和应用。尤其涉及如下通式(Ⅰ)和通式(Ⅱ)中化合物及其药学上可接受的盐，可以用于治疗与TRPV1和/或FAAH活性相关的疾病，如慢性疼痛、神经退行性疾病等。本发明通式(Ⅰ)和通式(Ⅱ)化合物分别对TRPV1和FAAH展现出了较强的拮抗/抑制作用以及动物镇痛活性。

Description

氨基甲酸酯类TRPV1拮抗/FAAH抑制双靶点药物及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一类氨基甲酸酯类TRPV1拮抗/FAAH抑制双靶点药物，本发明还公开了药物的制备方法、以该类化合物为活性成分的药物制剂，以及它们作为TRPV1拮抗剂/FAAH抑制剂或在制备镇痛药物以治疗临床中的疼痛中的应用。
背景技术
慢性疼痛极大降低人们的生活质量，是临床急需解决的一大难题。目前临床上治疗慢性痛主要是以非甾体抗炎药为代表的解热镇痛药和麻醉性镇痛药，虽然可以短暂的缓解疼痛，但长期服用多伴随胃肠道刺激和依赖性等明显的副作用。近年来关于慢性痛的研究，主要围绕外周伤害性感受器和脊髓水平进行展开，然而实践表明，仅靶向外周和/或脊髓水平且收效良好的镇痛药物寥寥无几。因此，针对新发现的镇痛靶点，进而研究具有良好慢性疼痛治疗效果的药物具有重要意义。
瞬时受体电位香草亚型1(TRPV1)通道由于其分布和功能，是开发新型炎性疼痛镇痛药的最受关注的靶点之一。但是之后的研究发现，不同化学结构类型的TRPV1拮抗剂会引起不同程度的体温升高。研究表明，TRPV1与CB1共同定位于外周和中枢神经组织，通过共同的激动剂N-花生四烯酸乙醇胺(AEA)与内源性***素***相互作用，影响疼痛传递。在中枢，TRPV1的激发依赖于AEA水平的升高，在神经病理条件下对这种介质会表现出更高的敏感性，在组织炎症或神经损伤的情况下，还会在局部炎症介质的刺激下发生功能敏化，进而导致人体疼痛阈值降低。
AEA是迄今为止研究最多的内源性***素，也是一种高亲和力的***素受体激动剂，存在于中枢不同的疼痛调节区域，现已证实其在疼痛调节局部区域的含量水平是其镇痛作用发挥的先决条件。AEA主要由脂肪酰胺水解酶(FAAH)分解代谢，抑制FAAH可以提高AEA的局部含量水平，从而发挥镇痛作用，是神经性和炎症性疼痛研究中的一个特别有前途的靶点。
在中枢，AEA具有双重作用，当AEA含量较低时，会优先作用于其高亲和力的CB1受体，抑制焦虑等的表达，没有改变痛觉感知，但与FAAH抑制剂合用可产生镇痛作用；当AEA水平进一步升高时，则可引起TRPV1的激活。抑制FAAH的同时拮抗TRPV1，可以抑制FAAH升高内源性***素产生镇痛作用的同时不会激活TRPV1，这种协同作用可以产生更强的镇痛作用。因此，同时抑制FAAH和阻断TRPV1的双靶点单一药物可能是开发治疗慢性疼痛的新策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型TRPV1拮抗/FAAH抑制双靶点药物，该类化合物具有氨基甲酸酯和酰胺结构，具有成为新型镇痛药物的潜力。
本发明还提供了上述新型氨基甲酸酯类TRPV1拮抗/FAAH抑制双靶点药物的合成方法、以及它们作为TRPV1拮抗/FAAH抑制双靶点药物在制备镇痛药物中的应用
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
氨基甲酸酯类TRPV1拮抗/FAAH抑制双靶点药物或其药学上可接受的盐结构通式如下：
式中，左侧R为等；右侧Ar为苯环、取代苯环、联苯、取代联苯等。
式中，左侧R为等；Ar为苯环、取代苯环、联苯、取代联苯等，X为N，C。
具体来讲，本发明所述药学上可接受的盐是与下列酸形成的盐：硫酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、三氟乙酸、醋酸、柠檬酸、丙酮酸、乳酸、马来酸、酒石酸、苯磺酸或琥珀酸等以及与类似的已知常用的酸所成的盐。
具体来讲，本发明TRPV1拮抗/FAAH抑制双靶点药物或其药学上常使用的盐，具体为下述化合物：
苯基(4-(4-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪-1-基)-4-氧丁基)氨基甲酸酯、
苯基-(3-氧代-3-(2-(4-苯基噻唑-2-基)吡咯烷-1-基)丙基)氨基甲酸酯、
苯基(4-(4-氯嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-4-氧丁基)氨基甲酸酯、
[1,1'-联苯]-3-基(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)-4-氧丁基)氨基甲酸酯、
苯基(4-氧基-4-(1,3,4,9-四氢-2H-吡啶基[3,4-b]吲哚-2-基)丁基)氨基甲酸酯、
苯基(4-((2-(4-甲基哌啶-1-基)-6-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲基)氨基)-4-氧丁基)氨基甲酸酯、
苯基4-(2-(1,3,4,9-四氢-2H-吡啶[3,4-b]吲哚-2-基)乙基)哌嗪-1-羧酸酯。
本发明芳基(胺基-1-基)-4-氧丁或丙基)氨基甲酸酯类化合物的制备方法如下面路线A所示
(1)中间体(i)的合成
室温条件下，向100mL单口茄形烧瓶中依次加入Boc-4-氨基丁酸或Boc-β-丙氨酸(2.50mmol)、1-羟基苯并***一水合物(HOBt·H2O)(3.125mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(3.125mmol)、三乙胺(7.50mmol)，加入10mL二氯甲烷，室温搅拌0.5h后，加入胺类化合物(2.50mmol)，在室温下继续反应8h，反应结束后反应液依次用10％柠檬酸溶液(10mL×3)，饱和食盐水溶液(10mL×3)洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到中间体(ⅰ)。
(2)中间体(ⅱ)的合成
向100mL单口茄形烧瓶中加入中间体(i)(2.10mmol)，加入10mL二氯甲烷溶解，置于冰浴条件下，待体系内温降至0℃时，缓慢滴加1mL三氟乙酸，之后让体系逐渐升温到室温，继续反应4h。反应结束后，用三乙胺调节pH至8，加5mL蒸馏水萃取有机相，再用(二氯甲烷：甲醇＝10:1)(5mL×3)反萃水相；合并有机相，在减压条件下旋干后得中间体(ⅱ)。
(3)目标化合物(ⅲ)的合成
向100mL单口茄形烧瓶中加入中间体(ⅱ)(1.20mmol)、三乙胺(1.80mmol)，加入5mL二氯甲烷，置于冰浴条件下，待体系降至0℃时，缓慢滴加氯甲酸芳香酯(1.20mmol)，之后让体系逐渐升温到室温，继续反应3h。反应结束后，加5mL蒸馏水淬灭反应，再用二氯甲烷(10mL×3)反萃水相；合并有机相，在减压条件下旋干溶剂后，柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)，得到目标化合物(ⅲ)。
本发明芳基4-(2-(胺类)乙基)哌嗪或哌啶-1-羧酸酯类化合物的制备方法如下面路线B所示
(1)中间体(i)的合成
冰浴条件下，向100mL单口茄形烧瓶中依次加入1-(2-羟乙基)哌嗪或1-(2-羟乙基)哌啶(2.60mmol)、三乙胺(3.25mmol)，加入二氯甲烷(20mL)，室温搅拌15min后，缓慢加入氯甲酸芳香脂(2.60mmol)，在冰浴条件下继续反应2h，加入H2O(10mL)淬灭反应，二氯甲烷(20mL×2)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到中间体(ⅰ)。
(2)中间体(ⅱ)的合成
向100mL单口茄形烧瓶中加入中间体(ⅰ)(4.60mmol)，再加入二氯亚砜(20mL)，于85℃条件下回流反应4h，减压条件下旋干二氯亚砜，得到中间体(ⅱ)。
(3)目标化合物(ⅲ)的合成
向100mL单口茄形烧瓶中加入胺类化合物(3.20mmol)、K2CO3(4.80mmol)、KI(4.80mmol)，加入DMF(20mL)，搅拌10分钟后，加入得到中间体(ⅱ)，于60℃条件下反应5h，加入H2O(10mL)淬灭反应，二氯甲烷(20mL×2)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到目标化合物(ⅲ)。
本发明提供了一种药物制剂，其包括上述通式(Ⅰ)或通式(Ⅱ)新型氨基甲酸酯类TRPV1拮抗/FAAH抑制双靶点药物或其药学上可接受的盐、以及药学上可接受的药物载体。药学上可接受的药物载体是指药学领域常规的药物载体，可以是一种或几种惰性的、非毒性的固体或液体填充物、稀释剂、助剂等，它们不会与活性化合物或病人发生作用、无刺激性、具有符合要求的黏度、渗透性、亲水性、溶解性。
详细的，本发明所述药物制剂的剂型包括胶囊、片剂、栓剂、软胶囊、口服液、丸剂、混悬剂或注射液等药剂学上常用的剂型。口服用药片和胶囊使用的是常规的赋形剂如黏合剂、填充剂、崩解剂和润滑剂。发明药物制剂的各种剂型可以按照药学领域中常规的方法进行制备。上述通式(Ⅰ)或通式(Ⅱ)所示活性成分的剂量将因配方而异。
本发明还进一步提供了剂型为片剂的药物制剂，其各原料配比如下：
含活性剂1的片剂：每片含(mg)
本发明还提供了上述新型氨基甲酸酯类TRPV1拮抗/FAAH抑制双靶点药物及其药学上可接受的盐作为TRPV1拮抗/FAAH抑制剂在制备镇痛药物中的运用。
和现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明设计合成的药物相对于单靶点药物可以同时作用于慢性疼痛产生的多个病理环节而产生协同作用，可以更好平衡慢性疼痛的多个病理因素之间的关系，产生的总效应会大于单种效益之和；还可以消除单靶点药物产生的副作用，增大治疗窗，减少药物的不良反应；相较单靶点药物不易产生耐药性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。需要申明的是，下述实施例仅用于说明，而并非用于局限本发明。本领域研究技术人员根据本发明的指导所做的改变均应在本申请权利要求所要求的保护范围之内。
实施例1：苯基(4-(4-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪-1-基)-4-氧丁基)氨基甲酸酯的合成
(1)叔丁基(4-(4-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪-1-基)-4-氧丁基)氨基甲酸酯的合成
室温条件下，向100mL单口茄形烧瓶中依次加入Boc-4-氨基丁酸(2.50mmol)、1-羟基苯并***一水合物(HOBt·H2O)(3.125mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(3.125mmol)、三乙胺(7.50mmol)，再加入10mL二氯甲烷作为溶剂，室温搅拌0.5h后,加入1-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪(2.50mmol)，在室温下继续反应8h，反应结束后反应液依次用10％柠檬酸溶液(10mL×3)，饱和食盐水溶液(10mL×3)洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到叔丁基(4-(4-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪-1-基)-4-氧丁基)氨基甲酸酯。
(2)4-氨基-1-(4-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪-1-基)丁酮的合成
向100mL单口茄形烧瓶中加入1-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪(2.10mmol)，加入10mL二氯甲烷溶解，置于冰浴条件下，待体系内温降至0℃时，缓慢滴加1mL三氟乙酸，之后让体系逐渐升温到室温，继续反应4h。反应结束后，用三乙胺调节pH至8，加5mL水，再用(二氯甲烷：甲醇＝10:1)(20mL×3)反萃水相；合并有机相，在减压条件下旋干后得4-氨基-1-(4-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪-1-基)丁酮。
(3)苯基(4-(4-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪-1-基)-4-氧丁基)氨基甲酸酯的合成
向100mL单口茄形烧瓶中加入4-氨基-1-(4-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪-1-基)丁酮(1.20mmol)、三乙胺(1.80mmol)，置于冰浴条件下，待体系降至0℃时，缓慢滴加氯甲酸苯酯(1.20mmol)，之后让体系逐渐升温到室温，继续反应3h。反应结束后，加5mL蒸馏水淬灭反应，再用二氯甲烷(5mL×3)反萃水相；合并有机相，在减压条件下旋干后，柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯体积比＝1:1)，得到淡黄色油，苯基(4-(4-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪-1-基)-4-氧丁基)氨基甲酸酯,产率63.3％。实验数据如下：
C28H38N4O3,light yellow oil,(63.3％,yield),1H NMR(DMSO,300MHz)δppm 7.77(t,J＝5.6Hz,1H,NH),7.43-7.32(m,3H,Ar-H),7.20(m,2H,Ar-H),7.13-6.98(m,4H,Ar-H),3.54-3.38(m,6H,piperazine and CH2),3.15-3.01(m,4H,piperidine),2.66-2.52(m,2H,CH2),2.37(dd,J＝13.0,5.7Hz,6H,piperazine and CH2),1.70(m,4H,piperidine),1.45(m,1H,piperidine),1.29(m,2H,CH2),0.96(d,J＝6.3Hz,3H,CH3)。
实施例2：苯基-(3-氧代-3-(2-(4-苯基噻唑-2-基)吡咯烷-1-基)丙基)氨基甲酸酯的合成
用(S)-4-苯基-2-(吡咯烷-2-基)噻唑替换实施例1中的1-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪，用Boc-β-丙氨酸替换实施例1中的Boc-4-氨基丁酸，其它参照实施例1中的制备方法，得到化合物2，淡黄色油，产率76.6％。实验数据如下：
C23H23N3O3S,light yellow oil,(76.6％,yield),1H NMR(CDCl3,300MHz)δppm7.92(m,2H,Ar-H),7.48-7.33(m,7H,Ar-H and thiazole),7.24-7.13(m,3H,Ar-H andNH),5.69-5.24(m,1H,pyrrolidine),3.90-3.65(m,2H,pyrrolidine),3.63-3.46(m,2H,CH2),2.77-2.59(m,2H,CH2),2.51-2.31(m,2H,pyrrolidine),2.29(s,2H,pyrrolidine).
实施例3：苯基(4-(4-氯嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-4-氧丁基)氨基甲酸酯的合成
用4-氯-2-(哌嗪-1-基)嘧啶替换实施例1中的1-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪,得到化合物3，白色膏体，产率63.3％。实验数据如下：
C17H18ClN5O3,white paste,(63.3％,yield),1H NMR(DMSO,300MHz)δppm 8.11(d,J＝6.2Hz,1H,Ar-H),7.83-7.73(t,1H,NH),7.37(t,J＝7.8Hz,2H,Ar-H),7.19(t,J＝7.4Hz,1H,Ar-H),7.14-7.06(m,2H,Ar-H),6.85(d,J＝6.2Hz,1H,Ar-H),3.70-3.51(m,8H,piperazine),3.11(q,J＝6.6Hz,2H,CH2),2.41(q,J＝8.2,7.8Hz,2H,CH2),1.73(t,J＝7.2Hz,2H,CH2).
实施例4：[1,1'-联苯]-3-基(4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)-4-氧丁基)氨基甲酸酯的合成
用色胺替换实施例1中的1-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪，用[1,1'-联苯]-3-基(4-硝基苯基)碳酸酯替换实施例1中的氯甲酸苯脂，其它参照实施例1中的制备方法，得到化合物4，灰白色固体，产率65.3％。实验数据如下：
C27H27N3O3,off-white solid(65.3％,yield),1H NMR(DMSO,300MHz)δppm 10.81(s,1H,indole NH),7.98(t,J＝5.8Hz,1H,ethyl NH),7.90-7.78(m,1H,butyl NH),7.73-7.61(m,2H,Ar-H),7.56-7.49(m,2H,Ar-H),7.45(dd,J＝7.9,2.2Hz,2H,Ar-H)),7.40-7.30(m,3H,Ar-H),7.13(dd,J＝7.7,2.3Hz,2H,Ar-H),7.11-7.02(m,2H,Ar-H),6.98(t,J＝7.3Hz,1H,Ar-H),3.37-3.25(m,2H,CH2),3.07(q,J＝6.5Hz,2H,CH2),2.82(t,J＝7.5Hz,2H,CH2),2.19-2.10(m,2H,CH2),1.72(q,J＝6.7Hz,2H,CH2)
实施例5：苯基(4-氧基-4-(1,3,4,9-四氢-2H-吡啶基[3,4-b]吲哚-2-基)丁基)氨基甲酸酯的合成
用1,3,4,9-四氢-2H-吡啶基[3,4-b]吲哚替换实施例1中的1-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪，其它参照实施例1中的制备方法，得到化合物5，灰白色固体，产率66.3％。实验数据如下：
C22H23N3O3,off-white solid(66.3％,yield),1H NMR(DMSO,300MHz)δppm 10.88(s,1H,indol NH),7.81(q,J＝5.5Hz,1H,butyl NH),7.42-7.30(m,4H,Ar-H),7.19(t,J＝7.6Hz,1H,Ar-H),7.13-7.02(m,3H,Ar-H),7.01-6.91(m,1H,Ar-H),4.70(s,2H,pyridine),3.79(q,J＝6.5,5.6Hz,2H,pyridine),3.14(q,J＝6.5Hz,2H,CH2),2.75(d,J＝12.8Hz,2H,pyridine),2.55(d,J＝7.3Hz,2H,CH2),1.77(m,2H,CH2).
实施例6：苯基(4-((2-(4-甲基哌啶-1-基)-6-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲基)氨基)-4-氧丁基)氨基甲酸酯的合成
用(2-(4-甲基哌啶-1-基)-6-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲胺替换实施例1中的1-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪，其它参照实施例1中的制备方法，得到化合物6，淡黄色固体，产率69.2％。实验数据如下：
C24H29F3N4O3,light yellow solid(65.1％,yield),1H NMR(CDCl3,300MHz)δppm8.45(d,J＝5.1Hz,1H,pyridine),7.37(t,J＝7.8Hz,2H,Ar-H),7.28-7.17(m,2H,Ar-H),7.13(dd,J＝7.5,1.6Hz,2H,Ar-H and pyridine),6.87(s,1H,NH),5.59(s,1H,NH),4.73(d,J＝5.0Hz,2H,CH2),3.46-3.28(m,4H,piperidine and CH2),2.90(td,J＝12.2,2.4Hz,2H,piperidine),2.32(t,J＝7.0Hz,2H,CH2),1.96(q,J＝6.8Hz,2H,piperidine),1.79(d,J＝3.4Hz,2H,piperidine),1.59(m,1H,piperidine),1.45(dd,J＝12.3,3.7Hz,2H,piperidine),1.38(d,J＝6.5Hz,2H,CH2),1.04(d,J＝6.4Hz,3H,CH3).
实施例7：苯基4-(2-(1,3,4,9-四氢-2H-吡啶[3,4-b]吲哚-2-基)乙基)哌嗪-1-羧酸酯的合成
(1)苯基4-(2-羟乙基)哌嗪-1-氨基甲酸酯的合成
冰浴条件下，向100mL单口茄形烧瓶中依次加入1-(2-羟乙基)哌嗪(2.60mmol)、三乙胺(3.25mmol)，再加入二氯甲烷(20mL)，室温搅拌15min后，缓慢加入氯甲酸苯脂(2.60mmol)，在冰浴条件下继续反应2h，加入H2O(10mL)淬灭反应，二氯甲烷(20mL×2)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到苯基4-(2-羟乙基)哌嗪-1-氨基甲酸酯。
(2)4-苯基4-(2-氯乙基)哌嗪-1-氨基甲酸酯的合成
向100mL单口茄形烧瓶中加入苯基4-(2-羟乙基)哌嗪-1-氨基甲酸酯(4.60mmol)，再加入二氯亚砜(20mL)，于85℃条件下回流反应4h，减压条件下旋干二氯亚砜，得到4-苯基4-(2-氯乙基)哌嗪-1-氨基甲酸酯。
(3)苯基4-(2-(1,3,4,9-四氢-2H-吡啶[3,4-b]吲哚-2-基)乙基)哌嗪-1-羧酸酯的合成
向100mL单口茄形烧瓶中加入2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚(3.20mmol)、K2CO3(4.80mmol)、KI(4.80mmol)，DMF(20mL)，搅拌十分钟后，加入中间体(ⅱ)，于60℃条件下反应5h，加入H2O(20mL)淬灭反应，二氯甲烷(20mL×2)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到化合物7，红色固体，产率75.2％。实验数据如下：
C24H28N4O2,red solid(75.2％,yield),1H NMR(CDCl3,300MHz)δppm 8.11(s,1H,indol NH),7.49-7.42(m,1H,Ar-H),7.40-7.26(m,3H,Ar-H),7.22-7.14(m,1H,Ar-H),7.10(m,4H,Ar-H),3.79(s,2H,pyridine),3.64(d,J＝28.1Hz,4H,pyridine),2.97(t,J＝5.7Hz,2H,CH2),2.91-2.75(m,4H,piperazine),2.68(dd,J＝7.8,5.6Hz,2H,CH2),2.55(q,J＝11.5,8.3Hz,4H,piperazine).
下面是本发明的七个化合物的药理学实验数据：
1、对TRPV1受体的体外活性筛选
使用的检测手段是水母发光蛋白报告基因检测技术，细胞株稳定共表达水母发光蛋白和TRPV1受体。原理是：当受体受到刺激时，细胞内的Ca2+会增加，在Ca2+的参与下，腔肠素会将发光蛋白进行重构，然后在469nm处会产生生物发光效应。通过对受刺激的细胞胞内钙的释放导致产生的快速化学发光信号的强度进行测量，就可以筛选出对TRPV1受体有作用的样品。
TRPV1拮抗活性筛选实验操作步骤为：先将待测化合物和辣椒碱用DMSO配成10mM初始浓度，然后用台氏液将待测化合物稀释成0.1mM测试浓度，辣椒碱稀释成250nM。钙离子荧光探针初始浓度为5mM，用每毫升含有33mg Pluronic F-127的HBSS稀释成浓度成0.05mM。向约含有10000个HEK-293-TRPV1细胞孔中各加10微升0.05mM浓度的钙离子荧光探针，37摄氏度温孵，20分钟后，再加30微升含有1％FBS的HBSS，继续孵育40分钟，40分钟后，将细胞孔中的液体全部吸出，并用台氏液清洗细胞孔，然后每孔细胞加40微升浓度为0.1mM的待测化合物。每个化合物配3个复孔，其中有3个细胞孔只加台氏液做空白对照，在37摄氏度下孵育30分钟后，在激发波长488nm和发射波长526nm下测量荧光强度。然后在每孔中加10微升浓度为250nM的辣椒碱，37度孵育30分钟后，在激发波长488nm和发射波长526nm下测量荧光强度。通过计算各组加辣椒碱前后的荧光强度差值可以推算出胞内钙离子相对浓度，进而检测出化合物对辣椒碱的拮抗程度，从而检测化合物对TRPV1受体的拮抗活性程度。部分化合物在10-5mol用量下对TRPV1受体的拮抗活性，结果见表1。
2、FAAH抑制活性的测定
使用液质联用色谱仪检测目标化合物在体外对FAAH的抑制活性。
FAAH酶反应：先配制好50mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲液(pH 7.4)；0.05％牛血清白蛋白；1mmol·L-1的AEA底物；100μmol·L-1目标化合物的DMSO溶液；1μg·μL-1人重组FAAH酶溶液。首先依次将上述试剂加入到缓冲液中，配成10μmol/L待测化合物的溶液，然后放入37℃恒温摇床中，摇晃反应30min，加入200μL含有1nmol·L-1脂肪酸(17∶0)作为内标的甲醇溶液终止反应。
FAAH的水解产物检测条件：液相色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×50mm，1.8mm)；柱温保持在40℃；进样量5μL；流动相A：水(含0.25％醋酸和5mmol·L-1醋酸铵)，流动相B：甲醇(含0.25％醋酸和5mmol·L-1醋酸铵)，流速0.6mL·min-1，95％B洗脱4min；质谱为ESI负离子源；干燥气为N2；温度350℃；帘气137.9kPa；扫描质量范围50～400。对FAAH水解产物花生四烯酸[M-H]-m/z＝303进行定量分析。
抑制率检测方法：FAAH可以催化AEA水解产生花生四烯酸的反应，加入抑制剂后，这个反应将受到抑制。首先，利用质谱测得不加入抑制剂时水解产生的花生四烯酸峰的丰度；在加入抑制剂后，再次检测水解产生的花生四烯酸峰的丰度，利用加入抑制剂前后花生四烯酸的丰度比来检测合成的抑制剂对FAAH催化AEA反应的抑制率。初始速率以相对于未受抑制的对照反应相对于抑制剂浓度的抑制百分比来表示。结果见表1。
表1
化合物 TRPV1抑制率(％) FAAH抑制率(％)
空白对照 NE NE
实施例1 77.64 62.68
实施例2 78.46 68.98
实施例3 71.87 69.56
实施例4 72.36 87.86
实施例5 76.56 65.65
实施例6 81.78 65.67
实施例7 74.65 66.77
注：抑制率＝(空白组差值-实验组差值)/空白组差值*100％
抑制率＝花生四烯酸峰的丰度/抑制后花生四烯酸峰的丰度*100％
空白组差值＝空白组加辣椒碱后荧光强度-空白组加辣椒碱前荧光强度
实验组差值＝实验组加辣椒碱后荧光强度-实验组加辣椒碱前荧光强度
NE：空白对照组抑制率为0。
测试结果表明，被测化合物对TRPV1抑制率以及FAAH抑制率均大于50％，说明受试化合物具有TRPV1/FAAH抑制活性。
3、本发明部分化合物对小鼠疼痛模型的影响
***诱导的舔足行为
小鼠按体重随机分组，每组8只。测试前半小时口服灌胃给药，剂量均为5mg/kg，空白组给予等容积的0.5％CMC-Na。给药容积为20mL/kg。测试时将由生理盐水配置的浓度为5％***溶液注射到后爪，然后在60分钟内记录小鼠***的次数。评估分为两个阶段，第一个阶段(0-10min)为急性痛，第二阶段(15-60min)为慢性痛。结果展示于下表2中。
表2
注：t检验，与空白组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
测试结果表明，在***诱导的疼痛模型中，被测化合物与空白组相比有显著差异，在第一阶段急性疼痛和第二阶段慢性疼痛中均表现出较强的镇痛作用。
以上药理学数据显示：本发明通式(Ⅰ)和通式(Ⅱ)化合物分别对TRPV1和FAAH展现出了较强的拮抗/抑制作用以及动物镇痛活性。

Claims (9)

1.氨基甲酸酯类TRPV1拮抗/FAAH抑制双靶点药物，其特征在于具体为下述化合物：
苯基(4-(4-(2-(4-甲基哌啶-1-基)苄基)哌嗪-1-基)-4-氧丁基)氨基甲酸酯(1)、
苯基-(3-氧代-3-(2-(4-苯基噻唑-2-基)吡咯烷-1-基)丙基)氨基甲酸酯(2)、
苯基(4-(4-氯嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-4-氧丁基)氨基甲酸酯(3)、
苯基(4-氧基-4-(1,3,4,9-四氢-2H-吡啶基[3,4-b]吲哚-2-基)丁基)氨基甲酸酯(5)、
苯基(4-((2-(4-甲基哌啶-1-基)-6-(三氟甲基)吡啶-3-基)甲基)氨基)-4-氧丁基)氨基甲酸酯(6)、
苯基4-(2-(1,3,4,9-四氢-2H-吡啶[3,4-b]吲哚-2-基)乙基)哌嗪-1-羧酸酯(7)。
2.药学上可接受的盐，其特征在于，如权利要求1所述的氨基甲酸酯类TRPV1拮抗/FAAH抑制双靶点药物，与以下酸形成的盐：硫酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、三氟乙酸、醋酸、柠檬酸、丙酮酸、乳酸、马来酸、酒石酸、苯磺酸或琥珀酸。
3.如权利要求1所述的氨基甲酸酯类TRPV1拮抗/FAAH抑制双靶点药物的制备方法，其特征在于：
(一)芳基(胺基-1-基)-4-氧丁或丙基)氨基甲酸酯类化合物的制备方法如路线A所示：
其中，R为
具体包括以下步骤：
(1)中间体(i)的合成
室温条件下，向烧瓶中依次加入Boc-4-氨基丁酸或Boc-β-丙氨酸、1-羟基苯并***一水合物HOBt·H2O、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、三乙胺，然后加入二氯甲烷，室温搅拌后，加入R-H，在室温下继续反应，反应结束后反应液洗涤、干燥、过滤、减压浓缩，得到中间体(ⅰ)；
(2)中间体(ⅱ)的合成
向烧瓶中加入中间体(i)，并加入二氯甲烷溶解，置于冰浴条件下，待体系内温降至0℃时，缓慢滴加三氟乙酸，之后让体系逐渐升温到室温，继续反应，反应结束后，用三乙胺调节pH至8，蒸馏水萃取有机相，再反萃水相；合并有机相，在减压条件下旋干后得中间体(ⅱ)；
(3)目标化合物(ⅲ)的合成
向形烧瓶中加入中间体(ⅱ)、三乙胺，并加入二氯甲烷，置于冰浴条件下，待体系降至0℃时，缓慢滴加氯甲酸芳香酯，之后让体系逐渐升温到室温，继续反应，反应结束后，加蒸馏水淬灭反应，再用二氯甲烷反萃水相；合并有机相，在减压条件下旋干溶剂后，柱层析纯化，得到目标化合物(ⅲ)；
(二)芳基4-(2-(胺类)乙基)哌嗪或哌啶-1-羧酸酯类化合物的制备方法如路线B所示：
其中，X为N，Ar为苯环，R为
具体包括以下步骤：
(1)中间体(i)的合成
冰浴条件下，向烧瓶中依次加入1-(2-羟乙基)哌嗪、三乙胺，并加入二氯甲烷，室温搅拌后，缓慢加入氯甲酸苯脂，在冰浴条件下继续反应2h，加入H2O淬灭反应，二氯甲烷洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到中间体(ⅰ)；
(2)中间体(ⅱ)的合成
向烧瓶中加入中间体(ⅰ)，再加入二氯亚砜，于85℃条件下回流反应4h，减压条件下旋干二氯亚砜，得到中间体(ⅱ)；
(3)目标化合物(ⅲ)的合成
向烧瓶中加入R-H、K2CO3、KI和DMF，搅拌10分钟后，加入得到中间体(ⅱ)，于60℃条件下反应5h，加入H2O淬灭反应，二氯甲烷洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到目标化合物(ⅲ)。
4.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包括权利要求1所述氨基甲酸酯类TRPV1拮抗/FAAH抑制双靶点药物或权利要求2所述药学上可接受的盐、以及与药学上可接受的药物载体。
5.如权利要求4所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型为片剂、胶囊、丸剂、栓剂、软胶囊、口服液、混悬剂或注射液。
6.如权利要求4所述的药物制剂，其特征在于，该药物制剂为片剂，各原料配比如下：
7.权利要求1所述TRPV1拮抗/FAAH抑制双靶点药物在制备镇痛药物中的应用。
8.权利要求2所述药学上可接受的盐在制备镇痛药物中的应用。
9.权利要求4所述药物制剂在制备镇痛药物中的应用。
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