CN114438104B

CN114438104B - 一种调控番茄果实糖含量的SlGRAS9基因及在培育高糖含量番茄中的应用

Info

Publication number: CN114438104B
Application number: CN202210281557.1A
Authority: CN
Inventors: 李正国; 时源; 刘豫东; 梁琴; 成玉林
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2022-03-21
Filing date: 2022-03-21
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2042-03-21
Also published as: CN114438104A

Abstract

本发明公开了一种调控番茄果实糖含量的SlGRAS9基因及在培育高糖含量番茄中的应用。该SlGRAS9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过CRISPR/cas9基因编辑技术，将番茄的内源基因SlGRAS9在番茄中敲除，敲除后的番茄果实中葡萄糖、果糖和蔗糖含量显著增加，苹果酸和柠檬酸含量显著降低。

Description

一种调控番茄果实糖含量的SlGRAS9基因及在培育高糖含量番茄中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种调控番茄果实糖含量的SlGRAS9基因及其在培育高糖含量番茄中的应用。

背景技术

果蔬作为膳食平衡的重要组成部分，富含多种有益人类健康的营养物质，包括糖类，维生素，矿物质和抗氧化物等。果蔬的品质与其经济价值密切相关，主要包括外观、口感、风味、营养成分以及质地等方面，因此致力于果蔬品质改良的研究具有重要的应用价值。

糖类化合物是重要的能量源物质，是一切生物体维持生命活动所需热能的主要来源，膳食中糖类供给的能量约占人体总需热能的60％-70％。糖类化合物是影响果蔬风味以及营养价值的主要因素，是衡量果蔬品质和经济价值的重要指标之一。

番茄是重要的经济作物，因其果实肉质鲜美、营养丰富、风味独特而深受消费者青睐，作为鲜食果蔬在世界范围内广泛栽种。番茄果实的品质主要分为外观品质和内在风味两个方面。外观品质包括果形、大小、颜色等，而内在风味主要由果实的甜度、酸度、果肉硬度和果汁含量决定。糖分及有机酸类组分的含量与番茄果实的风味品质密切相关，适宜的糖酸比值，造就了番茄果实独特的风味。对于番茄育种者而言，提升番茄果实风味的关键在于如何増加果实口感上的甜味。目前，传统育种方法耗时长且效果不稳定，往往存在很大的盲目性和不可预测性。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种调控番茄果实糖含量的SlGRAS9基因及其在培育高糖含量番茄中的应用，通过CRISPR/cas9基因编辑技术，将番茄的内源基因SlGRAS9在番茄中敲除，获得了高糖含量的番茄果实，果实的风味显著提高，极大地提升了番茄果实品质和经济价值。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种调控番茄果实糖含量的SlGRAS9基因，该SlGRAS9基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

进一步地，SlGRAS9基因还可以是与如SEQ ID NO.1所示序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

上述SlGRAS9基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种CRISPR/cas9碱基编辑器，其包括载体以及可识别SlGRAS9基因靶序列的sgRNA。

进一步地，载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一种重组农杆菌，包括上述CRISPR/cas9碱基编辑器。

一种提升番茄果实糖含量的制剂，制剂包括可以抑制SlGRAS9基因的活性成分。

上述SlGRAS9基因、碱基编辑器或重组农杆菌在提升番茄果实糖含量中的应用。

上述SlGRAS9基因、碱基编辑器或重组农杆菌在培育果实高糖含量番茄品种或番茄种质资源改良中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过CRISPR/cas9基因编辑技术，将番茄的内源基因SlGRAS9在番茄中敲除，敲除后的番茄果实中葡萄糖、果糖和蔗糖含量显著增加，苹果酸和柠檬酸含量显著降低。此外，本发明采用CRISPR/cas9基因编辑技术，高效并可稳定遗传地提高了番茄果实中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量，极大地增强了番茄果实口感上的甜味，从而提高果实品质。为番茄种质资源创新提供基因资源和策略，旨在更好的满足消费者的需求。

附图说明

图1为构建的Cas9/pORE CRISPR/cas9表达载体；

图2为SlGRAS9基因CRISPR/cas9基因敲除植株阳性鉴定结果；

图3为SlGRAS9基因敲除株系编辑情况；

图4为野生型番茄与SlGRAS9基因敲除株系番茄红熟期果实中蔗糖、果糖、葡萄糖、苹果酸和柠檬酸含量的检测结果；

图5为野生型番茄与SlGRAS9基因敲除株系番茄红熟期果实中可溶性固形物含量、酸度及糖酸比检测结果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1构建SlGRAS9基因CRISPR/cas9基因敲除***

1、设计SlGRAS9基因的靶序列

利用http://cas9.cbi.pku.edu.cn/index.jsp网站进行靶位点设计。在靶点设计的结果中可评估所有候选靶点的序列、位置、GC含量、潜在的脱靶位等点等相关信息，选择GC含量在45％～70％范围内，位置在基因CDS的前2/3区域(ATG之后，但不要在最后一个外显子上)，与基因组中其他任意位置至少有三个碱基不匹配的的靶点。

2、构建SlGRAS9基因的sgRNA表达盒

(1)利用Overlapping PCR法获得SlGRAS9基因sgRNA表达盒。首先进行第一轮PCR，以gRNA表达载体U26为模板，使用PrimerSTAR高保真酶和利用引物对1：U26-HindIII-F：

和U26-target-R1：

(下划线部分为载体接头序列)以及引物对2：U26-target-F2：

和U26-NheI-R：/>

(下划线部分为载体接头序列)进行PCR扩增将靶点序列引入到U6-26启动子下游和sgRNA序列的上游，其扩增体系如表1所示。

表1第一轮PCR扩增体系

其扩增程序为：98℃预变性1min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。

(2)然后进行第二轮PCR，以第一轮的两个PCR产物为模板，利用U26-HindIII-F和U26-target-R1扩增得到包含启动子、靶点和sgRNA的完整的sgRNA表达盒。

第二轮PCR以第一轮的两个PCR产物为模板，使用PrimerSTAR高保真酶和U26-HindIII-F和U26-target-R1扩增引物进行PCR扩增，反应体系如表2所示：

表2第二轮PCR扩增体系

其PCR扩增程序为：98℃预变性1min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。

3、将sgRNA表达盒克隆到Cas9/pORE载体

利用HindIII和NheI双酶切Cas9/pORE载体，然后采用同源重组技术将sgRNA表达盒连接到Cas9/pORE终载体上，其中Cas9/pORE终载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，构建得到的载体图谱如图1所示。

实施例2敲除SlGRAS9基因后对番茄果实中糖含量的影响

1、工程菌的筛选

(1)将实施例1构建的SlGRAS9基因CRISPR/cas9敲除***转化至大肠杆菌DH5α中，并在含有50μg/mL卡纳霉素的平板上进行筛选，挑选单克隆菌株，然后对其菌落进行PCR扩增鉴定，测序筛选阳性菌株；

(2)将阳性菌株摇菌抽提质粒，转化根癌农杆菌GV3101，并在含有50μg/mL卡纳霉素和100μg/mL利福平的平板培养基上筛选，挑选单克隆进行菌落PCR验证，验证成功后的菌株即为所述重组表达载体的工程菌。

2、用含有重组质粒的农杆菌通过叶盘法转化番茄外植体

(1)种子消毒

野生型番茄种子放入无菌器皿中，倒入适量体积百分比70％的乙醇水溶液浸泡30s对种子表面进行消毒；倒出乙醇水溶液然后用无菌水冲洗种子两次，倒入有效氯5％的次氯酸钠溶液浸泡15min，期间不断摇晃，确保每一粒种子消毒充分；无菌水洗涤3-4次后倒净种子中的水，将种子转移到种子培养基上，放入光照培养箱中，培养条件为：光照14小时，温度25℃；黑暗10小时，温度20℃；光照强度，250μmol·m^-2·s^-1；相对湿度，80％；培养8-10天。

(2)外植体预培养

种子萌发约9-10天后，番茄幼苗的真叶即将长出时为获得外植体的最佳时期，将幼苗放于无菌滤纸上，用灭菌后的手术刀片将子叶和下胚轴进行切段，用无菌镊子小心的转移到KCMS预培养基上暗培养一天。

(3)农杆菌侵染外植体

在20mL LB(含有20μL 50μg/mL卡那霉素和40μL 100μg/mL利福平)中加入100μL保存的农杆菌甘油菌，28℃，230rpm培养过夜，直到吸光值OD₆₀₀约0.8-1.0。吸取1mL菌液，5000rpm离心5min后弃上清，用KCMS液体培养基洗涤沉淀一次，再用KCMS液体培养基将菌液稀释至OD₆₀₀约为0.1。使用移液枪在外植体的伤口处滴加一滴农杆菌稀释液，菌液无需吸出，将平皿封好后置于KCMS预培养基上暗培养2天。

(4)外植体的分化与生根

外植体与农杆菌共培养2天后，用无菌镊子小心将外植体从KCMS预培养基转移至初筛2Z培养基上培养，每15天更换一次初筛培养基。待有分化的芽点从外植体中长出时，将外植体转移至1Z培养基上培养，每15天更换一次培养基。在1Z培养基上培养两次后，分化的愈伤组织长出具有独立主茎的芽体，切下并***生根培养基ENR中，待生根后进行移栽。

(5)转基因阳性植株的鉴定

转基因T0代幼苗利用CRISPR/Cas9载体检测引物Cas9-F/Cas-R确认是否为转基因阳性植株(Cas9-F:5’-TTAGGTTTACCCGCCAATA-3’；Cas-R:5’-GAGTAGACAAGTGTGTCGTGCT-3’)，检测结果如图2所示。

如图2所示，以T0代幼苗的基因组DNA为模板进行PCR扩增，电泳检测出500bp大小的片段确定为转基因阳性植株。随后以T0代幼苗的基因组DNA为模板，设计包含靶位点的检测引物进行PCR扩增(GRAS9-Cas9check-F:5’-CTGAATCATTTTATTAATGCCT-3’；GRAS9-Cas9check-R:5’-GATAAAACCCCGTTCGTG-3’)，经琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带，纯化的PCR产物构建到pEASY-Blunt-Zero克隆载体上进行单克隆测序，对应的每株转基因阳性植株进行20个单克隆测序，测序结果与野生型序列进行比对得出T0代植株的编辑情况。

测序为杂合的T0代种子经卡那霉素筛选后继续播种，分析T1代植株的编辑情况(与T0代植株编辑检测方法相同)，选取不同编辑形式的2-3个纯合株系收取种子经卡那霉素筛选后播种至T2代用于后续研究，所选株系的突变方式分别为缺失四个碱基和***一个碱基，如图3所示。

3、SlGRAS9基因敲除植株果实糖和有机酸含量测定

获得纯合突变体后，收集野生型和基因敲除植株红熟期果实样品进行糖含量测定。称取0.1g果实样品，以色谱纯(Ar)甲醇为提取剂提取番茄果实可溶性糖和有机酸，设置3个生物学重复。

具体过程为：使用甲氧胺盐酸盐和BSTFA对样品进行衍生化。使用岛津GC 2010pro进行测定。色谱参数为SPL温度250℃，分流比10：1；色谱柱流量1mL/min，升温程序为初始温度130℃，以5℃/min升至185℃，以0.5℃/min升至190℃，以8℃/min升至300℃，保持10min。检测器温度为320℃，氢气流量40mL/min，干燥空气流量400mL/min，氮气流量40mL/min。葡萄糖、果糖、蔗糖、苹果酸和柠檬酸含量测定结果如图4所示。

图4中，WT为野生型番茄，CR#1和CR#2为两个SlGRAS9基因敲除系番茄。根据图4的检测结果可知，在敲除SlGRAS9基因后，番茄果实中的蔗糖(Sucrose)、果糖(Fructose)和葡萄糖(Glucose)含量显著提升，而苹果酸(Malic acid)和柠檬酸(Citric acid)含量则是显著降低。

4、SlGRAS9敲除果实的可溶性固形物含量测定

摘取野生型和SlGRAS9敲除植株的红熟期果实，设置3个生物学重复，用蒸馏水清洗果实表面，擦干后将番茄果实放入纱布中用力挤压，将果汁挤出到干净的烧杯中，即为可溶性固形物的粗提液，使用手持式折射仪对粗提液进行测定，可溶性固形物含量、酸度和糖酸比测定结果如图5所示。

图5中，WT为野生型番茄，CR#1为SlGRAS9基因敲除系番茄。如图5所示，SlGRAS9基因敲除系番茄果实的可溶性固形物含量(Total soluble solid)显著升高，酸度(Acid)则是有所降低，而糖酸比(Ratio)则是显著升高。

综上，表明利用基因编辑技术敲除番茄中的SlGRAS9基因能够显著提升番茄果实的糖含量，也能降低番茄果实的酸度，极大地增强了番茄果实口感上的甜味，从而提高果实品质。为番茄种质资源创新提供了良好的参考和借鉴，旨在更好地满足消费者的需求。

序列表

<110> 重庆大学

<120> 一种调控番茄果实糖含量的SlGRAS9基因及在培育高糖含量番茄中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1797

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcctcgg atttctccgg cggagttcca gactttcacg gcggcgccgg tagatccagc 60

ttgattccga tgaacaactc ccagccacaa attcaattaa cccaacgccc tgacggagtt 120

tctcagaatc tccaccggag acctatgttc atcgggaaac ggtcactcgc agcctttcaa 180

cagcagcaac agtttcagtt tctacaacaa caacagcagc aacaaggttt gggattttat 240

ctacgtaacg tgaagcctag aaattaccag caggcatctc caatttctcc tctagattac 300

tctgtttctt cctcgttgat ttcatctgaa ttttctccga tgactccacg ccatcctctc 360

ccgatttcca cggcgaacac gaacggggtt ttatcttctg gtaacccgaa ttgttcagca 420

gttgcttctt acctaaatca ggtacagaac agtttatacc aggaatcaga ggaaaaaatg 480

atgaatcgac tgcatgagtt agagaaacag ctcctagaag acaacaatga ggaggaagaa 540

gatacagtct ctgttgtgac taacaacgac gagtggtcgg aaacaataaa gaatctgatt 600

actccgacta gtaaccactt atccccggca tcatctacgt cttcatgttc ttcttctatg 660

gaatctccgc cagtatcttc tcccaggcag tctattgtcg aagctgctac cgcaataatc 720

gacggaaaaa ccaatgttgc agtacagatc ctcacgcgcc tcgcacaggt agctgatgtt 780

agagggtctt ccgaacagcg gctgacggcg tacatggttt cagcactccg atcgcgcgtg 840

aactccacgg agtacccacc gcccgtgatg gagctgcgta gcaaagagca cgcagtttca 900

gctcaaaacc tctacgagat atccccgtgt ttcaagctag gatttatggc agctaatttc 960

gccattgttg aagctgtagc tgatcatccc tcaaacaaaa ttcacgtcat tgatttcgac 1020

ataggacaag gtggacaata cttgcattta ctacacgcgc tagcttccaa gaaaacagat 1080

tatcccatca gcttaagaat cacggcgatc acaacagagt tcacggtcag agctgatcac 1140

agtttaaaat ccattgaaga tgatctgaga agtctagcaa acaaaatcgg tatttccttg 1200

attttcaaag taatttcacg tacaatcacc gatttgagta ggggaaaatt agggattgaa 1260

cacgacgaag ctttagcagt gaatttcgca tacagattat atagattacc cgacgagagc 1320

gtaacaacag agaatctaag agacgagctt ctccggcgag tgaaggggtt atcaccaaag 1380

gtggtgacat tagtagagca agagttgaac gggaacacgg cggcgtttgt ggcgcgtgta 1440

aacgaggcgt gtggatatta cggagcattg ttggattcac tggatgcaac tgtatcaaga 1500

gaggaaacgg gtcgggtcaa gatcgaagaa gggctgagtc gtaaattaac aaactcggta 1560

gcgtgtgaag gtagggatcg tttggagaga tgcgaggtgt ttggtaaatg gagggcccga 1620

atgagtatgg ctgggttcgg gccgaggccc atgagtcaac aaattgctga ttcactgctt 1680

aagaggctta actcgggccc acgtggcaat ccaggattca atgtgaatga acaaagtggg 1740

ggtattaggt ttggatggat gggaaaaacc ctcaccgttg cttctgcttg gtgttaa 1797

<210> 2

<211> 598

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Ser Asp Phe Ser Gly Gly Val Pro Asp Phe His Gly Gly Ala

1 5 10 15

Gly Arg Ser Ser Leu Ile Pro Met Asn Asn Ser Gln Pro Gln Ile Gln

20 25 30

Leu Thr Gln Arg Pro Asp Gly Val Ser Gln Asn Leu His Arg Arg Pro

35 40 45

Met Phe Ile Gly Lys Arg Ser Leu Ala Ala Phe Gln Gln Gln Gln Gln

50 55 60

Phe Gln Phe Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Leu Gly Phe Tyr

65 70 75 80

Leu Arg Asn Val Lys Pro Arg Asn Tyr Gln Gln Ala Ser Pro Ile Ser

85 90 95

Pro Leu Asp Tyr Ser Val Ser Ser Ser Leu Ile Ser Ser Glu Phe Ser

100 105 110

Pro Met Thr Pro Arg His Pro Leu Pro Ile Ser Thr Ala Asn Thr Asn

115 120 125

Gly Val Leu Ser Ser Gly Asn Pro Asn Cys Ser Ala Val Ala Ser Tyr

130 135 140

Leu Asn Gln Val Gln Asn Ser Leu Tyr Gln Glu Ser Glu Glu Lys Met

145 150 155 160

Met Asn Arg Leu His Glu Leu Glu Lys Gln Leu Leu Glu Asp Asn Asn

165 170 175

Glu Glu Glu Glu Asp Thr Val Ser Val Val Thr Asn Asn Asp Glu Trp

180 185 190

Ser Glu Thr Ile Lys Asn Leu Ile Thr Pro Thr Ser Asn His Leu Ser

195 200 205

Pro Ala Ser Ser Thr Ser Ser Cys Ser Ser Ser Met Glu Ser Pro Pro

210 215 220

Val Ser Ser Pro Arg Gln Ser Ile Val Glu Ala Ala Thr Ala Ile Ile

225 230 235 240

Asp Gly Lys Thr Asn Val Ala Val Gln Ile Leu Thr Arg Leu Ala Gln

245 250 255

Val Ala Asp Val Arg Gly Ser Ser Glu Gln Arg Leu Thr Ala Tyr Met

260 265 270

Val Ser Ala Leu Arg Ser Arg Val Asn Ser Thr Glu Tyr Pro Pro Pro

275 280 285

Val Met Glu Leu Arg Ser Lys Glu His Ala Val Ser Ala Gln Asn Leu

290 295 300

Tyr Glu Ile Ser Pro Cys Phe Lys Leu Gly Phe Met Ala Ala Asn Phe

305 310 315 320

Ala Ile Val Glu Ala Val Ala Asp His Pro Ser Asn Lys Ile His Val

325 330 335

Ile Asp Phe Asp Ile Gly Gln Gly Gly Gln Tyr Leu His Leu Leu His

340 345 350

Ala Leu Ala Ser Lys Lys Thr Asp Tyr Pro Ile Ser Leu Arg Ile Thr

355 360 365

Ala Ile Thr Thr Glu Phe Thr Val Arg Ala Asp His Ser Leu Lys Ser

370 375 380

Ile Glu Asp Asp Leu Arg Ser Leu Ala Asn Lys Ile Gly Ile Ser Leu

385 390 395 400

Ile Phe Lys Val Ile Ser Arg Thr Ile Thr Asp Leu Ser Arg Gly Lys

405 410 415

Leu Gly Ile Glu His Asp Glu Ala Leu Ala Val Asn Phe Ala Tyr Arg

420 425 430

Leu Tyr Arg Leu Pro Asp Glu Ser Val Thr Thr Glu Asn Leu Arg Asp

435 440 445

Glu Leu Leu Arg Arg Val Lys Gly Leu Ser Pro Lys Val Val Thr Leu

450 455 460

Val Glu Gln Glu Leu Asn Gly Asn Thr Ala Ala Phe Val Ala Arg Val

465 470 475 480

Asn Glu Ala Cys Gly Tyr Tyr Gly Ala Leu Leu Asp Ser Leu Asp Ala

485 490 495

Thr Val Ser Arg Glu Glu Thr Gly Arg Val Lys Ile Glu Glu Gly Leu

500 505 510

Ser Arg Lys Leu Thr Asn Ser Val Ala Cys Glu Gly Arg Asp Arg Leu

515 520 525

Glu Arg Cys Glu Val Phe Gly Lys Trp Arg Ala Arg Met Ser Met Ala

530 535 540

Gly Phe Gly Pro Arg Pro Met Ser Gln Gln Ile Ala Asp Ser Leu Leu

545 550 555 560

Lys Arg Leu Asn Ser Gly Pro Arg Gly Asn Pro Gly Phe Asn Val Asn

565 570 575

Glu Gln Ser Gly Gly Ile Arg Phe Gly Trp Met Gly Lys Thr Leu Thr

580 585 590

Val Ala Ser Ala Trp Cys

595

<210> 3

<211> 11649

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atccctaggg aagttcctat tccgaagttc ctattctctg aaaagtatag 300

gaacttcttt gcgtattggg cgctcttggc ctttttggcc accggtcgta cggttaaaac 360

caccccagta cattaaaaac gtccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt 420

ttacaccaca atatatcctg ccaccagcca gccaacagct ccccgaccgg cagctcggca 480

caaaatcacc actcgataca ggcagcccat cagtccacta gacgctcacc gggctggttg 540

ccctcgccgc tgggctggcg gccgtctatg gccctgcaaa cgcgccagaa acgccgtcga 600

agccgtgtgc gagacaccgc agccgccggc gttgtggata cctcgcggaa aacttggccc 660

tcactgacag atgaggggcg gacgttgaca cttgaggggc cgactcaccc ggcgcggcgt 720

tgacagatga ggggcaggct cgatttcggc cggcgacgtg gagctggcca gcctcgcaaa 780

tcggcgaaaa cgcctgattt tacgcgagtt tcccacagat gatgtggaca agcctgggga 840

taagtgccct gcggtattga cacttgaggg gcgcgactac tgacagatga ggggcgcgat 900

ccttgacact tgaggggcag agtgctgaca gatgaggggc gcacctattg acatttgagg 960

ggctgtccac aggcagaaaa tccagcattt gcaagggttt ccgcccgttt ttcggccacc 1020

gctaacctgt cttttaacct gcttttaaac caatatttat aaaccttgtt tttaaccagg 1080

gctgcgccct gtgcgcgtga ccgcgcacgc cgaagggggg tgccccccct tctcgaaccc 1140

tcccggcccg ctctcgcgtt ggcagcatca cccataattg tggtttcaaa atcggctccg 1200

tcgatactat gttatacgcc aactttgaaa acaactttga aaaagctgtt ttctggtatt 1260

taaggtttta gaatgcaagg aacagtgaat tggagttcgt cttgttataa ttagcttctt 1320

ggggtatctt taaatactgt agaaaagagg aaggaaataa taaatggcta aaatgagaat 1380

atcaccggaa ttgaaaaaac tgatcgaaaa ataccgctgc gtaaaagata cggaaggaat 1440

gtctcctgct aaggtatata agctggtggg agaaaatgaa aacctatatt taaaaatgac 1500

ggacagccgg tataaaggga ccacctatga tgtggaacgg gaaaaggaca tgatgctatg 1560

gctggaagga aagctgcctg ttccaaaggt cctgcacttt gaacggcatg atggctggag 1620

caatctgctc atgagtgagg ccgatggcgt cctttgctcg gaagagtatg aagatgaaca 1680

aagccctgaa aagattatcg agctgtatgc ggagtgcatc aggctctttc actccatcga 1740

catatcggat tgtccctata cgaatagctt agacagccgc ttagccgaat tggattactt 1800

actgaataac gatctggccg atgtggattg cgaaaactgg gaagaagaca ctccatttaa 1860

agatccgcgc gagctgtatg attttttaaa gacggaaaag cccgaagagg aacttgtctt 1920

ttcccacggc gacctgggag acagcaacat ctttgtgaaa gatggcaaag taagtggctt 1980

tattgatctt gggagaagcg gcagggcgga caagtggtat gacattgcct tctgcgtccg 2040

gtcgatcagg gaggatattg gggaagaaca gtatgtcgag ctattttttg acttactggg 2100

gatcaagcct gattgggaga aaataaaata ttatatttta ctggatgaat tgttttagta 2160

cctagatgtg gcgcaacgat gccggcgaca agcaggagcg caccgacttc ttccgcatca 2220

agtgttttgg ctctcaggcc gaggcccacg gcaagtattt gggcaagggg tcgctggtat 2280

tcgtgcaggg caagattcgg aataccaagt acgagaagga cggccagacg gtctacggga 2340

ccgacttcat tgccgataag gtggattatc tggacaccaa ggcaccaggc gggtcaaatc 2400

aggaataagg gcacattgcc ccggcgtgag tcggggcaat cccgcaagga gggtgaatga 2460

atcggacgtt tgaccggaag gcatacaggc aagaactgat cgacgcgggg ttttccgccg 2520

aggatgccga aaccatcgca agccgcaccg tcatgcgtgc gccccgcgaa accttccagt 2580

ccgtcggctc gatggtccag caagctacgg ccaagatcga gcgcgacagc gtgcaactgg 2640

ctccccctgc cctgcccgcg ccatcggccg ccgtggagcg ttcgcgtcgt ctcgaacagg 2700

aggcggcagg tttggcgaag tcgatgacca tcgacacgcg aggaactatg acgaccaaga 2760

agcgaaaaac cgccggcgag gacctggcaa aacaggtcag cgaggccaag caagccgcgt 2820

tgctgaaaca cacgaagcag cagatcaagg aaatgcagct ttccttgttc gatattgcgc 2880

cgtggccgga cacgatgcga gcgatgccaa acgacacggc ccgctctgcc ctgttcacca 2940

cgcgcaacaa gaaaatcccg cgcgaggcgc tgcaaaacaa ggtcattttc cacgtcaaca 3000

aggacgtgaa gatcacctac accggcgtcg agctgcgggc cgacgatgac gaactggtgt 3060

ggcagcaggt gttggagtac gcgaagcgca cccctatcgg cgagccgatc accttcacgt 3120

tctacgagct ttgccaggac ctgggctggt cgatcaatgg ccggtattac acgaaggccg 3180

aggaatgcct gtcgcgccta caggcgacgg cgatgggctt cacgtccgac cgcgttgggc 3240

acctggaatc ggtgtcgctg ctgcaccgct tccgcgtcct ggaccgtggc aagaaaacgt 3300

cccgttgcca ggtcctgatc gacgaggaaa tcgtcgtgct gtttgctggc gaccactaca 3360

cgaaattcat atgggagaag taccgcaagc tgtcgccgac ggcccgacgg atgttcgact 3420

atttcagctc gcaccgggag ccgtacccgc tcaagctgga aaccttccgc ctcatgtgcg 3480

gatcggattc cacccgcgtg aagaagtggc gcgagcaggt cggcgaagcc tgcgaagagt 3540

tgcgaggcag cggcctggtg gaacacgcct gggtcaatga tgacctggtg cattgcaaac 3600

gctagggcct tgtggggtca gttccggctg ggggttcagc agccagcgct ttactgagat 3660

cctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 3720

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 3780

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 3840

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 3900

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 3960

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 4020

gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 4080

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 4140

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 4200

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 4260

ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 4320

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 4380

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 4440

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 4500

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttggatctc ctgtggttgg 4560

catgcacata caaatggacg aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgatta 4620

ttctaataaa cgctcttttc tcttaggttt acccgccaat atatcctgtc aaacactgat 4680

agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc tgctagtgga tctcccagtc acgacgttgt 4740

aaaacgggcg ccccgcggaa agcttgtaat acgactcact atagggagac ccaagctggc 4800

tagcgtttaa acttaagctg atccactagt cctgcaggtc aacatggtgg agcacgacac 4860

acttgtctac tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac 4920

ttttcaacaa agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca 4980

ctttattgtg aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa 5040

aggaaaggcc atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc 5100

cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg 5160

atgtgataac atggtggagc acgacacact tgtctactcc aaaaatatca aagatacagt 5220

ctcagaagac caaagggcaa ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg gaaacctcct 5280

cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa aggaaggtgg 5340

ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg cctctgccga 5400

cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc 5460

aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc 5520

acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga 5580

gaggacctcg acctcaacac aacatataca aaacaaacga atctcaagca atcaagcatt 5640

ctacttctat tgcagcaatt taaatcattt cttttaaagc aaaagcaatt ttctgaaaat 5700

tttcaccatt tacgaacgat agaattcgcc atggccccaa agaaaaagag aaaggttgat 5760

tacaaagacc acgacggaga ctacaaagac cacgacattg attataaaga tgatgatgat 5820

aaaggaacga tggacaaaaa gtatagcatc ggtctggata ttggaactaa ctccgtcggc 5880

tgggctgtaa tcaccgacga atacaaggtc ccgtcaaaaa agttcaaggt attgggtaac 5940

acagatcgtc actctatcaa aaagaatctc attggagctc tgttgttcga cagcggcgaa 6000

acagctgagg ccactagact gaagcgcacc gccagacgcc gttacacgag gagaaagaac 6060

agaatctgct acttgcaaga aatattctca aacgagatgg ccaaagtgga cgattcgttc 6120

tttcataggt tagaagagag tttccttgtt gaagaggata aaaagcacga aagacatccg 6180

atatttggaa acatcgtgga cgaagttgct tatcacgaga agtaccccac gatctatcat 6240

ctgcgtaaaa agttggtgga ctcgacagat aaggccgacc tcaggttaat ataccttgca 6300

ctggcgcaca tgatcaaatt cagaggccat tttctgattg aaggtgacct gaaccctgac 6360

aatagtgatg tggacaaact cttcattcaa ttagttcaga cctacaatca actgtttgaa 6420

gagaacccta tcaacgcttc aggagttgac gctaaggcca tccttagtgc gagactgagc 6480

aaatcccgcc gtctcgaaaa cttaatcgca cagttgcctg gagagaaaaa gaacggtttg 6540

ttcggaaatc tcattgcgtt gtcactcgga ctcacgccaa acttcaagtc taacttcgat 6600

ttggcagaag acgcgaaact gcaactgagc aaagacacat atgacgatga cctcgataac 6660

ctcttagctc agatcggcga tcaatacgcc gacttgttcc tcgctgccaa aaatctgtcg 6720

gacgctatac ttctgagtga tatcttgcgc gtcaacacag aaattactaa ggctcctctg 6780

tcggccagta tgataaaacg ctatgacgaa caccatcagg atttgacatt gctcaaagcc 6840

ctcgtgcgtc aacagctccc agaaaagtac aaggagattt tctttgatca gtccaagaat 6900

ggctacgcag gttatataga cggtggagcg tcgcaagaag agttctacaa gttcatcaag 6960

ccaatattag aaaagatgga cggcacggaa gagttacttg ttaagctgaa tcgtgaggac 7020

ctgttgcgta aacagaggac attcgataac ggatcaattc cgcaccaaat acatcttggc 7080

gaactgcacg ctatcctcag gagacaagag gacttctacc cctttttaaa ggataaccgt 7140

gaaaagatcg agaaaatcct gactttcagg attccttact atgtcggccc actggctcgt 7200

ggtaatagca ggtttgcctg gatgaccagg aagtccgaag agacaattac tccgtggaac 7260

ttcgaagagg tggttgataa aggagcatca gcgcagtctt tcatagaacg catgacaaat 7320

tttgacaaga acttaccgaa tgagaaggtc cttcccaaac actcactcct ctacgaatac 7380

ttcacagtat acaacgagct cactaaagtc aagtacgtaa ccgagggtat gcgcaaaccc 7440

gctttcctgt ctggagagca gaaaaaggcc atcgtggacc ttctgttcaa gacaaaccgt 7500

aaggtcactg taaagcaact caaggaagac tacttcaaaa agatagagtg tttcgattca 7560

gtggaaatct ctggcgttga ggacagattt aacgcttcct tgggtactta ccacgatttg 7620

ctcaagatca ttaaagataa ggacttcctc gacaacgaag agaacgaaga tatcttagag 7680

gacatagttc tcacccttac gctgtttgaa gatagagaga tgattgaaga gcgcctgaag 7740

acttatgctc atttgttcga tgacaaagtc atgaagcaac tgaaacgccg taggtacacc 7800

ggctggggta gattatcgcg caaacttatt aatggtataa gggacaagca gtcgggaaaa 7860

acgatattgg actttctcaa gagtgatggt ttcgccaaca gaaattttat gcaactcata 7920

cacgatgaca gcttaacatt caaggaagat atccaaaaag cacaggtgtc gggacagggc 7980

gacagtttgc acgaacatat tgctaacctc gccggctccc cggcgataaa aaagggtatc 8040

cttcagactg tgaaagtcgt agatgaactg gtgaaggtta tgggtcgtca taaacccgag 8100

aacatagtta tcgaaatggc tagggagaat caaacaactc agaagggaca gaaaaactca 8160

agagaacgca tgaagcgcat tgaagagggt atcaaagagc ttggcagtca aatcctgaag 8220

gaacaccctg tcgagaacac gcaacttcag aacgaaaaat tgtacctcta ctatctgcag 8280

aatggtagag atatgtacgt agaccaagaa ttggatatta accgcctctc agattacgac 8340

gtggatcata tagttccgca gtcattcttg aaggatgact ctatcgacaa caaagtcctc 8400

acaagatcag acaagaaccg cggaaaatca gataatgtac cctctgaaga ggtggttaaa 8460

aagatgaaaa actactggag acagttactt aacgctaagt tgatcacgca aagaaagttc 8520

gataacctca caaaggctga acgcggcggt ttaagcgagc ttgacaaggc cggtttcata 8580

aaacgtcagt tagtcgaaac caggcaaatt acgaaacacg tagcccaaat attggattcc 8640

cgcatgaaca ctaaatacga tgaaaatgac aagctcatcc gtgaggtcaa agtaattacc 8700

ctgaaaagca agttggtgtc cgacttcaga aaggatttcc agttctacaa agttcgcgaa 8760

atcaacaact accaccatgc acatgacgct tacctgaacg cagtcgtagg cactgcgtta 8820

attaaaaagt accctaaact ggaatctgag ttcgtgtacg gtgactataa agtgtacgat 8880

gttagaaaga tgatcgctaa aagcgaacag gagattggaa aggctaccgc caagtatttc 8940

ttttactcca acatcatgaa tttctttaag accgaaatca cgttagcaaa tggcgagata 9000

cgtaaaaggc cacttatcga aacaaacgga gaaactggcg agatagtgtg ggacaagggt 9060

agagattttg ccactgtccg caaagtactg tcgatgccgc aagtgaatat cgttaaaaag 9120

accgaagttc aaacgggagg cttcagcaaa gagtccatcc tgcccaagcg taacagtgat 9180

aaattgatag ctaggaaaaa ggactgggat cctaaaaagt atggtggatt cgacagccca 9240

actgtcgcat actccgtatt ggtggttgcg aaagtcgaaa aaggaaagag caaaaagctc 9300

aagtccgtaa aagagctgtt gggcattacc ataatggaaa gatcatcttt cgagaagaat 9360

cctatcgatt ttctggaagc caagggatat aaagaggtca aaaaggacct cataatcaag 9420

ttaccaaaat acagtctgtt cgaattggag aacggcagaa aacgcatgct tgcatcagcg 9480

ggtgaactgc aaaagggaaa tgagttagca cttccttcta aatacgtcaa cttcctgtat 9540

ttggcgtcac actacgaaaa actgaagggc tctccagaag ataacgagca aaagcagtta 9600

tttgtggaac agcacaaaca ttaccttgac gaaattatag agcaaatctc ggagttcagt 9660

aagagagtga ttttggctga cgccaatctt gataaagttc tgtctgctta caacaagcac 9720

cgtgataaac cgattaggga acaggccgag aacatcatac atctcttcac actcactaac 9780

cttggtgcac ccgcagcgtt caaatatttt gacaccacga tagatcgtaa gaggtacacc 9840

agcacgaaag aagttttgga cgcgacactc atccatcaat caatcacggg cctgtacgag 9900

accagaatcg acctgtccca gctcggtggc gactagcggc cgcatcgata ctgcaggagc 9960

tcggtacctt ttactagtga tatccctgtg tgaaattgtt atccgctacg cgtgatcgtt 10020

caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta 10080

tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt 10140

tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag 10200

aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac 10260

tagatcccat gggaagttcc tattccgaag ttcctattct ctgaaaagta taggaacttc 10320

agcgatcgca gacgtcggga tcttctgcaa gcatctctat ttcctgaagg tctaacctcg 10380

aagatttaag atttaattac gtttataatt acaaaattga ttctagtatc tttaatttaa 10440

tgcttataca ttattaatta atttagtact ttcaatttgt tttcagaaat tattttacta 10500

ttttttataa aataaaaggg agaaaatggc tatttaaata ctagcctatt ttatttcaat 10560

tttagcttaa aatcagcccc aattagcccc aatttcaaat tcaaatggtc cagcccaatt 10620

cctaaataac ccacccctaa cccgcccggt ttcccctttt gatccatgca gtcaacgccc 10680

agaatttccc tatataattt tttaattccc aaacacccct aactctatcc catttctcac 10740

caaccgccac atagatctat cctcttatct ctcaaactct ctcgaacctt cccctaaccc 10800

tagcagcctc tcatcatcct cacctcaaaa cccaccgggg ccggccatga ttgaacaaga 10860

tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc 10920

acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggaggcc 10980

ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaacttcaag acgaggcagc 11040

gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac 11100

tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc 11160

tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac 11220

gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg 11280

tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct 11340

cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt 11400

cgtgactcat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg 11460

attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac 11520

ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg 11580

tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg 11640

aggcgcgcc 11649

Claims

1.SlGRAS9基因在调控番茄果实糖含量中的应用，所述SlGRAS9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种提升番茄果实糖含量的制剂，其特征在于，所述制剂包括可以抑制SlGRAS9基因表达的活性成分，所述SlGRAS9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1中所述的SlGRAS9基因敲除在提升番茄果实糖含量的中的应用。

4.权利要求1中所述的SlGRAS9基因敲除在培育高糖含量番茄果实品种或番茄种质资源改良中的应用。