CN110724685A - 转基因耐盐耐除草剂玉米sr801外源***旁侧序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转基因耐盐耐除草剂玉米SR801外源***片段旁侧序列及其应用。本发明中转基因耐盐耐除草剂玉米SR801经重测序和特异性PCR技术鉴定了一个***位点，以SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼序列，以SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼序列。本发明提供了用于检测该旁侧序列的引物对，引物序列分别如SEQ ID No：6‑7和SEQ ID No：8‑9所示的核苷酸序列。本发明的耐盐耐除草剂转基因玉米SR801外源***片段旁侧序列的鉴定适用于对转基因玉米SR801包括亲本、杂种F1和后代，及其植株、组织、种子及其制品的检测。

Description

转基因耐盐耐除草剂玉米SR801外源***旁侧序列及其应用

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，具体涉及一种转基因耐盐耐除草剂玉米SR801外源***旁侧序列及其应用。

背景技术

土壤盐碱化是世界性的一个问题，现今，世界上约有20％的可耕地和40％的灌溉地不同程度的受到盐渍化影响。我国盐渍总面积为9.91×10⁷亿hm²，虽然实行灌溉、排水工程等可达到改良盐碱地的目的，但因其成本高、时效性短，所以难以长期开展。中国是农业大国，从2014年开始中国已是全球种植玉米面积最大的国家，且玉米的产量已占全国粗粮总产量的90%。玉米的重要性已毋庸置疑，然而，许多重要的玉米种植区存在土壤盐渍化和次生盐渍化问题，这种情况在世界上也很普遍。玉米对盐逆境响应是由多基因控制的性状，多年来各国科学家通过传统育种、分子标记辅助技术和转基因途径等尝试培育耐盐优良玉米品种，取得了一些进展。但是，玉米中关于高盐胁迫响应的关键基因鉴定，以及耐盐玉米株系的培育工作远远落后于抗旱、耐低温胁迫等研究。

NF-Y是一种真核生物中广泛存在的转录因子，能够特异性结合CCAAT-box，而CCAAT-box作为一种顺式元件存在于大约1/4的真核生物基因启动子中。NF-Y是一个三聚体，它包括NF-YA（CBF-B或HAP2），NF-YB（CBF-A或HAP3），NF-YC（CBF-C或HAP5）。在哺乳动物中，NF-YB和NF-YC通过一个组蛋白折叠域紧紧的结合 在一起，然后在核中与NF-YA结合形成最终的三聚体转录因子，NF-YA可以在染色质上滑动寻找25bp的CCAAT-box元件，一旦找到NF-YA就会与之结合并***DNA双螺旋的小沟中，使得DNA双螺旋处于一个松弛的状态，从而更有利的募集RNA聚合酶或者其他的转录因子，进而对其下游的靶基因进行正向或负向调控。NF-Y作为保守的转录因子在植物生长发育和对逆境胁迫响应中扮演着重要的角色。

经对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何关于耐盐耐除草剂的转基因玉米事件SR801外源***载体旁侧序列和利用此序列建立事件特异性定性、定量PCR检测的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种转基因玉米SR801外源***片段旁侧序列及其应用。

本发明另一目的在于提供一种转基因玉米SR801的PCR检测方法及试剂盒。

本发明的转基因玉米SR801培育方法包括如下步骤：将目的玉米基因组第5号染色体的第21908318-21913504位之间的碱基替换为外源DNA片段，得到转基因玉米；

所述外源DNA片段含有包括ZmNF-YA14和Bar两个基因的表达盒，约5186bp；

所述转基因玉米的耐盐胁迫能力高于所述目的玉米，和/或所述转基因玉米的耐草铵膦的能力高于所述目的玉米。

上述方法中，所述玉米ZmNF-YA14基因如SEQ ID NO：3所示，基因全长906bp，编码301个氨基酸，蛋白分子量约32.8kDa，ZmNF-YA14基因的表达能够激活包括抗氧化酶基因在内的一系列抗逆相关基因的表达，显著降低体内活性氧含量，大幅度提高转基因植物对高盐和干旱的综合耐受性。

所述耐草铵膦基因Bar为来自吸水链霉菌的耐草铵膦基因，其核苷酸序列如SEQID NO：4所示，基因全长552bp，编码183个氨基酸，蛋白分子量约23kDa，它可使除草剂草铵膦乙酰化，抑制草铵膦的活性，最终达到耐草铵膦的效果。

进一步的，所述外源DNA片段依次由所述玉米转录因子ZmNF-YA14表达盒、所述耐草铵膦基因bar表达盒组成。

所述玉米转录因子ZmNF-YA14表达盒依次由玉米ZmUbi启动子、玉米转录因子ZmNF-YA14和NOS终止子构成。其中玉米ZmUbi启动子大小为2001bp，是组成型启动子，可驱动目的基因在玉米所有组织中表达。NOS终止子大小为253bp，来自根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区胭脂碱合成酶基因终止子，终止ZmNF-YA14基因转录。

所述耐草铵膦基因Bar表达盒依次由CaMV35S启动子、耐草铵膦基因Bar和CaMVpolyA终止子构成。其中CaMV35S启动子大小为781bp，来自花椰菜花叶病毒CaMV，负责启动植物耐草铵膦基因Bar的表达。CaMV polyA终止子大小为185bp，终止Bar基因转录。

更进一步的，所述外源DNA片段的核苷酸序列具体如SEQ ID NO：5所示。利用上述方法获得玉米转化事件SR801为将SEQ ID NO：5所示的外源DNA片段***目的玉米基因组第5号染色体的第21908318-21913504位间，替换掉第5号染色体的第21908318—21908371位间53bp的碱基序列后得到的转基因玉米。且自第21908318位上游且紧邻第21908318位核苷酸的上游侧翼片段的核苷酸序列(左侧翼序列)如SEQ ID NO：1所示，自第21908371位下游且紧邻第21908371位核苷酸的下游侧翼片段的核苷酸序列(右侧翼序列)如SEQ ID NO：2所示。

本发明所述玉米转化事件SR801是利用农杆菌介导法，将ZmNF-YA14基因连接入经过改造的pCAMbia3301载体（CAMV 35S promoter +GUS替换为了Ubi promoter），和Bar基因的表达盒在同一个T-border内，侵染玉米幼胚，以BASTA 作为选择压力，对被转化的材料进行筛选培养从而获得转基因幼苗。ZmNF-YA14由玉米泛素基因启动子Ubi驱动，由胭脂碱合成酶基因NOS终止子终止，可以在玉米中组成型高效表达，筛选获得了优良转基因品系SR801。通过分子生物学分析，ZmNF-YA14基因分子水平及转录水平鉴定为阳性，进一步通过自交得到了转基因纯系种子，转基因植株在水培情况下表现出了较强的耐盐性。

上述方法中，所述目的玉米可为玉米B104。

本发明提供的用于检测或辅助检测待测植物样品是否为上述方法获得的转基因玉米或其后代的方法包括如下步骤：检测所述待测植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A，所述DNA片段A依次由左侧翼序列、上述外源DNA片段和右侧翼序列组成；

若所述待测植物样品的基因组DNA含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因玉米或其后代；

若所述待测植物样品的基因组DNA不含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因玉米或其后代；

上述用于检测或辅助检测待测植物样品是否为上述方法获得的转基因玉米或其后代的方法为如下1)或2)：

1)直接测序；

2)用引物对甲和/或引物对乙对待测植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增产物大小，若引物对甲扩增得到大小为899bp的条带和/或引物对乙扩增得到大小为1046bp的条带，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因玉米或其后代；否则，所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因玉米或其后代；

所述引物对甲由SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的单链DNA分子组成；

所述引物对乙由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的单链DNA分子组成。

本发明提供的用于检测或辅助检测待测植物样品是否为上述方法获得的转基因玉米或其后代的试剂盒其包括由上述引物对甲和引物对乙组成的成套引物对和/或由上述探针甲和探针乙组成的成套探针。

与现有技术相比，本发明的优异效果主要体现在：本发明提供了优良的转化事件SR801，所述转化事件可实现将外源基因特异性引入到玉米品系中，赋予受体玉米具有耐盐胁迫以及耐除草剂草铵膦的能力；耐盐胁迫基因及耐草铵膦基因在受体玉米中能够稳定遗传；耐盐胁迫基因的表达可提高耐盐能力且与野生型玉米农艺性状无明显差异。本发明通过重测序方法得到了耐盐耐除草剂转基因玉米事件SR801的两端旁侧序列，根据这两个旁侧序列的序列信息，设计了两对特异性PCR引物并建立针对转基因玉米SR801或其后代的检测方法。本发明提供了旁侧序列和特异性引物对适用于对转基因玉米SR801或其后代的检测。

附图说明

图1 载体pCAMbia-Ubi-NFYA14的构建图谱。

图2 为实验室条件下转pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米植株的耐盐性鉴定。

图3 为大田种植下转基因玉米SR801各世代植株的株高。

图4 为大田种植下转基因玉米SR801各世代植株的穗位高。

图5 为大田种植下转基因玉米SR801各世代植株的百粒重。

图6 为大田种植下转基因玉米SR801各世代植株的散粉时间。

图7 为大田种植下转基因玉米SR801各世代植株的散粉吐丝间隔期。

图8 转基因SR801的T4-T6 Bar基因启动子和部分Bar基因检测结果M：Marker；泳道1：野生型品系植株；泳道2：质粒；泳道3：T4世代的转基因品系植株；泳道4：T5世代的转基因品系植株；泳道5：T6世代的转基因品系植株；泳道6：无菌ddH₂O；上样量：M：5uL泳道1-6：样品5uL+Loading 5uL。

图9 转基因SR801的T4-T6 Bar基因终止子和部分Bar基因检测结果M：Marker；泳道1：野生型品系植株；泳道2：T4世代的转基因品系植株；泳道3：T5世代的转基因品系植株；泳道4：T6世代的转基因品系植株；泳道5：质粒；泳道6：无菌ddH₂O；上样量：M：5uL；泳道1-6：样品5uL+Loading 5uL。

图10 转基因SR801的UBI启动子PCR检测结果M：Marker；泳道1：野生型品系植株；泳道2：质粒；泳道3：T4世代的转基因品系植株；泳道4：T5世代的转基因品系植株；泳道5：T6世代的转基因品系植株；泳道6：无菌ddH2O；上样量：M：5uL；泳道1-6：样品5uL+Loading5uL。

图11 转基因SR801的NOS终止子PCR检测结果M：Marker；泳道1：野生型品系植株；泳道2：质粒；泳道3：T4世代的转基因品系植株；泳道4：T5世代的转基因品系植株；泳道5：T6世代的转基因品系植株；泳道6：无菌ddH2O；上样量：M：5uL；泳道1-6：样品5uL+Loading5uL。

图12 转基因SR801特异性PCR检测结果M：Marker；1, 6：阳性对照（T1代）；2, 7：SR801 F1玉米株系; 3, 8:SR801 BC1F1玉米株系；4, 9:SR801 BC2F1玉米株系；5, 10：阴性对照；上样量：M：5uL；泳道1-10：样品5uL+Loading 5uL。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；pCAMBIA3301-Ubi载体是在pCAMBIA3301质粒基础上进行改造后得到的载体；pCAMBIA3301-Ubi载体含有一个目的基因插盒(Pubi－多克隆酶切位点－Tnos)和一个来自吸水链霉菌的耐除草剂草铵膦基因Bar表达盒(CaMV35S启动子-Bar基因-TCaMV)；pCAMBIA3301质粒为澳大利亚CAMBIA (Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriculture)的产品；YEP固体培养基配方如下：NaCl 10g/L、酵母粉5g/L、蛋白胨10g/ L；选择培养基S1配方如下：N6 1L、头孢250mg/L、脯氨酸700mg/L、双丙氨膦1.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L；筛选培养基S2配方如下：N6 1L、头孢250mg/L、脯氨酸700mg/L、双丙氨膦3 .0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L。

实施例1转pCAMBIA3301-Ubi-NFYA14玉米的获得、耐盐性鉴定及农艺性状分析

一、转pCAMBIA3301-Ubi-NFYA14玉米的获得

1、含有外源基因的质粒载体的获得

构建流程如下：EcoRI和PmlI 双切pCAMBIA3301，获得线性化的载体骨架。设计带有与载体骨架同源的序列的引物，以玉米基因组DNA为模板PCR扩增Pubi，通过PCR将UBI启动子加上同源序列。然后通过无缝克隆技术将Ubi启动子重组到3301骨架上，得到带有Ubi启动子的3301载体—3301Ubi-new载体。用PmlI单切此载体，作为骨架，以玉米基因组cDNA为模板，PCR把ZmNF-YA14基因加上同源序列，与载体进行重组，获得 pCAMBIA3301-Ubi-NFYA14植物表达载体。pCAMBIA3301-Ubi-NFYA14载体图谱如图1所示。

本发明用于玉米转化的质粒载体pCAMBIA3301-Ubi-NFYA14的具体组成元件名称、位置如表1所示。其中T-DNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。SEQ ID NO：5包含完整的耐盐胁迫基因ZmNF-YA14表达框和耐除草剂草铵膦基因bar表达框。

耐盐胁迫基因ZmNF-YA14表达框具体由以下部分组成：玉米ZmUbi启动子、耐盐胁迫基因ZmNF-YA14和nos终止子。其中，ZmUbi启动子大小为2001bp，是组成型启动子，可驱动目的基因在玉米所有组织中表达。耐盐胁迫基因ZmNF-YA14全长1048bp，核苷酸序列如SEQID NO：3所示。NOS终止子大小为269bp，来自根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区胭脂碱合成酶基因终止子，终止ZmNF-YA14基因转录。

耐除草剂草铵膦基因Bar表达框具体由以下部分组成：CaMV35S启动子、耐除草剂草铵膦基因Bar和CaMV polyA终止子。其中，CaMV35S启动子大小为781bp，来自花椰菜花叶病毒CaMV，负责启动植物耐草铵膦基因Bar的表达。耐除草剂草铵膦基因Bar全长552bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。CaMV polyA终止子大小为1bp，终止Bar基因转录。

2、重组菌的获得

将步骤1获得的重组载体pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14导入农杆菌EHA105中，得到重组菌。

3、转pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米的获得

采用农杆菌介导的方法将步骤2获得的重组菌转化玉米B104幼穗，得到T0代转pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米，具体步骤如下：

(1)将步骤2获得的重组菌(含有pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14的农杆菌EHA105)在YEP固体培养基上涂布，28℃下暗培养1～3天。将培养好的农杆菌从平板上刮下重悬，调OD550至0.3，制成侵染液备用；

(2)取授粉后9～12天的玉米B104幼穗，剥去苞叶，75％酒精消毒10min，剥取幼胚于装有2mL重悬液的离心管中，每管100个幼胚，备用；

(3)侵染时弃尽重悬液，加入2mL侵染液，温和颠倒离心管数次混匀，室温暗处静止5min。侵染结束后，幼胚盾片朝上接种于共培养基中，20℃暗培养3天。转至静息培养基中，28℃暗培养7天。再转至含有1.5mg/L双丙氨膦的选择培养基S1中，28℃暗培养2周。如已得到初始愈伤组织，将其转至含有3mg/L双丙氨膦的筛选培养基S2中，以后每两周更换一次S2培养基；

(4)当筛选得到的抗性愈伤组织增殖至直径为2cm左右时，将其转至暗分化培养基上，25℃暗培养2～3周。将分化得到的胚芽鞘转至光分化培养基上，25℃光下培养2周。待胚芽鞘形成完整的幼苗和根，将幼苗转入培养瓶中促根壮苗。10天后将幼苗移栽入营养钵，室内温室中培养。待幼苗长出1～2片新叶后移入大花盆，转移至大型温室，以后按照常规方法进行日常管理即可。待雄穗散粉后，自交授粉。

通过农杆菌介导法获得了100多个T0代转pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米株系，经过PCR鉴定，筛选阳性植株，将PCR鉴定阳性的T1代转pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米收种子，在温室种植并鉴定后得到T2代转pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米株系。如此重复，直至得到阳性T3、T4、T5、T6代转pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米株系。

将T6代转pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米株系与郑58杂交，得到F1代pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米株系。随后，经过2代与郑58的回交，得到pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米株系的BC2代回交群体。

表1 pCAMBIA3301-Ubi-NFYA14 载体各元件信息表

二、转pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米的耐盐性鉴定

对T4、T5、T6代转pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米株系在实验室条件下以100mmol/L盐溶液处理24天，同时以野生型玉米B104为对照，观察转pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米植株的耐盐性状况。

结果如图2所示。T4、T5、T6代转pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米株系对比野生型玉米B104植株的耐盐能力明显增加。

三、转pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米的转化事件SR801的获得及农艺性状分析

通过实验室室内环境培育T4、T5、T6代阳性转pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米株系，对其进行盐处理，同时以野生型玉米B104为对照，最终筛选得到一个耐盐能力强的T6代转pCAMBIA3301-pUbi-NFYA14玉米株系，将其命名为转化事件SR801。通过大田种植观察转化事件SR801与野生型玉米B104对比农艺性状变化情况。

指标测定方法具体如下：

1、株高

植株处于抽雄开花期时，每小区选取3株长势大致相同的玉米，用尺测量从地面到植株最高点的距离。

结果如图3所示。结果表明：从连续三代(T4、T5、T6)来看，转化事件SR801与野生型玉米B104对比株高无明显差异。

2、穗位高

每小区选取3株长势大致相同的玉米，用尺测量从地面到植株果穗柄着生节的高度。

结果如图4所示。结果表明：从连续三代(T4、T5、T6)来看，转化事件SR801与野生型玉米B104对比穗位高无明显差异。

3、百粒重

随机取长势大致相同的玉米穗子的相同位置100粒籽粒称重，重复取样3次，取相近两个数的平均数。

结果如图5所示。结果表明：从连续三代(T4、T5、T6)来看，转化事件SR801与野生型玉米B104对比百粒重无明显差异。

4、散粉时间

从开始播种计算，统计每小区3株长势大致相同的玉米开始散粉的天数。

结果如图6所示。结果表明：从连续三代(T4、T5、T6)来看，转化事件SR801与野生型玉米B104对比散粉时间开始无明显差异。

5、散粉吐丝间隔期

每小区选取3株长势大致相同的玉米，观察统计散粉吐丝间隔期天数。

结果如图7所示。结果表明：从连续三代(T4、T5、T6)来看，转化事件SR801与野生型玉米B104对比散粉吐丝间隔期无明显差异。

6、目的基因Bar的性状鉴定

对转基因玉米SR801在不同世代的耐草铵膦能力进行了评估。具体评估方法如下：在6-8叶期时分别对转基因玉米SR801及其对照喷施4倍浓度的草铵膦除草剂，统计转基因玉米SR801及对照的死亡率。

结果如表2所示。结果表明：不同世代的转基因玉米SR801的耐草铵膦能力显著高于对照材料，而且能力稳定，说明转基因玉米中Bar基因目标性状表现稳定。

表2不同世代转基因玉米耐草铵膦能力试验

玉米材料	T4代	T5代	T6代
				SR801	没有明显药害	没有明显药害	没有明显药害
对照	全部死亡	全部死亡	全部死亡

实施例2转化事件SR801的遗传稳定性检测

一、Bar基因遗传稳定性PCR结果与分析

T4-T6世代的转基因品系植株的Bar基因启动子和部分Bar基因以及终止子和部分Bar基因检测结果与分析。

表3引物序列

引物名称	上游引物序列5'-3'	下游引物序列5'-3'	产物大小
				Bar2F/2R	cttcagcaggtgggtgtaga	atttggagaggacacgctga	394bp
Bar1F/1R	ccctaattcccttatctgggaac	accactacatcgagacaagc	562bp

表4 PCR反应体系

组分	用量
		10×PCR Buffer(with MgCl2)	1ul
dNTP(2 .5mM)	0.2ul
		Left primer(10uM)	0.2ul
Right primer(10uM)	0.2ul
		Taq polymerase(5U/ul)	0.1ul
DNA(50ng/ul)	1ul
		ddH2O	7.3ul
Total	10ul

表5 PCR反应条件

	循环数	时间	温度
				变性	1	5min	95°
变性	35	30s	95°
				退火	35	40s	56°
延伸	35	45s	72°
				延伸	1	10min	72°
保存	-	-	4°

PCR反应结束后，制作1％的琼脂糖凝胶，将PCR产物点样电泳25min，用凝胶成像***观察结果并拍照。

本实施例采用PCR技术来检测转基因品系植株的遗传稳定性。在引物设计方面并没有采用传统方法将启动子、终止子以及Bar基因别设计引物，而是将启动子与部分Bar基因和终止子与部分Bar基因进行捆绑设计引物。从图8以及图9中PCR检测结果可以证明启动子、终止子以及Bar基因相互具有联系性，同时检测结果均具有明亮且对应正确Marker条带的位置。此结果可以说明Bar基因稳定整合在SR801的T4-T6世代的转基因品系植株中，并可以稳定遗传。

二、 ZmNF-YA14基因遗传稳定性PCR结果与分析

对T4-T6世代的转基因品系植株进行PCR检测，T4-T6代UBI启动子及ZmNF-YA14的PCR检测，将正向引物设定在UBI启动子上，反向引物设定在ZmNF-YA14基因上。对T4-T6代NOS终止子及ZmNF-YA14的PCR检测，将正向引物设定在ZmNF-YA14启动子上，反向引物设定在NOS基因上。

表6引物序列

引物名称	上游引物序列	下游引物序列	产物大小
				UBI-F/R	gcggtcgttcatacgttcta	tcctgacaaggaaccatggt	501bp
NOS-F/R	cagcgtgtttccaccataag	atgacaccgcgcgcgataat	368bp

表7 PCR反应体系

组分	用量
		10×PCR Buffer(with MgCl2)	1ul
dNTP(2 .5mM)	0.2ul
		Left primer(10uM)	0.2ul
Right primer(10uM)	0.2ul
		Taq polymerase(5U/ul)	0.1ul
DNA(50ng/ul)	1ul
		ddH2O	7.3ul
Total	10ul

表8 PCR反应条件

	循环数	时间	温度
				变性	1	3min	95°
变性	35	30s	95°
				退火	35	40s	56°
延伸	35	40s	72°
				延伸	1	10min	72°
保存	-	-	4°

PCR反应结束后，制作1％的琼脂糖凝胶，将PCR产物点样电泳25min，用凝胶成像***观察结果并拍照。结果如图10和图11所示。

如图10所示结果，阳性质粒对照的PCR扩增产物大小为501bp，阴性对照且存在较暗条带，目的片段扩增大小与阳性质粒对照的PCR大小一致，符合预期，表明驱动ZmNF-YA14基因的UBI启动子稳定整合到玉米基因组中。

如图11所示结果，阳性质粒对照PCR扩增产物大小为368bp，阴性对照没有条带，目的片段扩增大小与阳性质粒对照的PCR大小一致，符合预期，表明NOS终止子稳定整合到玉米基因组中。

通过对T4-T6世代的转基因品系植株进行PCR检测确定转基因品系SR801主要元件在不同世代整合稳定，可连续多代遗传。

实施例3耐盐耐草铵膦玉米品种培育

1、以转化事件SR801的T6代自交系为供体亲本，以玉米自交系郑58为受体亲本进行一次杂交，得到杂交子代，将杂交子代与郑58回交，在回交过程中使用草铵膦清除每代中不含有SR801转基因复合结构的分离株系，连续回交6次，得到BC6代株系。

2、从BC6代株系叶片组织中提取DNA，采用实施例2中的玉米转化事件SR801特异性PCR鉴定的引物PR1和PR2进行PCR扩增，扩增出外源***基因及其侧翼的DNA片段，并对其进行测序验证。经测序分析证实，与供体亲本的转基因结构序列一致，说明SR801转化事件稳定转育到新的受体材料中。

3、以BC6代株系为母本，以昌7-2为父本进行杂交，得到杂交种，采用实施例2中的玉米转化事件SR801特异性PCR鉴定的引物PR1和PR2对该杂交种进行外源***基因及其侧翼DNA序列进行分析和测序。结果显示：该杂交种含有转化事件SR801。

4、对步骤3获得的杂交种进行田间抗性试验。苗期喷施0.18％浓度的草铵膦，统计死亡株数及存活指数，计算杂交种的死亡率，以此反映其耐除草剂草铵膦的能力。对步骤3获得的杂交种进行实验室抗性试验。在苗期进行175mmol/L盐溶液处理，观察植株的生长状况，统计死亡株数及存活指数，计算杂交种的死亡率，以此反映其耐盐胁迫能力。结果显示，该杂交种具有良好的耐盐除草剂草铵膦的能力。

实施例4转化事件SR801的侧翼序列分析及特异性PCR检测

本项目在实验研究中利用重测序方法和PCR 技术检测外源目的基因在玉米基因组中的整合，发现***序列整合在玉米染色体上。3代（T4、T5和T6）中均可检测到目的基因，说明***序列是以整合形式存在。通过全基因组重测序方法初步确认SR801的外源基因***玉米基因组Chr5: 21,908,318—21,913,504。

在中间试验阶段通过高通量重测序方法和PCR结合测序方法确定了目标基因在基因组中的整合位置，经PCR测序SR801事件的侧翼序列如下，所述玉米ZmNF-YA14基因如SEQID NO：3所示，其左侧翼序列如SEQ ID NO：1所示，其右侧翼序列如SEQ ID NO：2所示，特异性PCR检测的引物对甲由SEQ ID NO：6所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：7所示的单链DNA分子组成，特异性PCR检测的引物对乙由SEQ ID NO：8所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：9所示的单链DNA分子组成。

表9引物序列

引物名称	上游引物序列	下游引物序列	产物大小
				引物对甲	gacgtccacatccacttcac	gtttcgctcatgtgttgagc	899bp
引物对乙	aggtgaccagctcgaatttc	ccctctcact gtataagacg	1046bp

表10 PCR反应体系

组分	用量
		10×PCR Buffer(with MgCl<sub>2</sub>)	1ul
dNTP(2 .5mM)	0.2ul
		Left primer(10uM)	0.2ul
Right primer(10uM)	0.2ul
		Taq polymerase(5U/ul)	0.1ul
DNA(50ng/ul)	1ul
		ddH<sub>2</sub>O	7.3ul
Total	10ul

表11 PCR反应条件

	循环数	时间	温度
				变性	1	3min	94°
变性	35	30s	94°
				退火	35	40s	58°
延伸	35	40s	72°
				延伸	1	10min	72°
保存	-	-	4°

PCR反应结束后，制作1％的琼脂糖凝胶，将PCR产物点样电泳25min，用凝胶成像***观察结果并拍照。结果如图12所示。

利用设计的特异性PCR检测引物，以转基因玉米SR801、阳性对照、阴性对照为模板，进行一次扩增，3次重复PCR结果一致，结果表明该引物能特异性检测转基因玉米SR801及其后代。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 转基因耐盐耐除草剂玉米SR801外源***旁侧序列及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1029

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 1

ctgctgtacg gcgctcccgg cacgggcaag tccacgttcg ccgccgcgat ggcgaggttc 60

ctggggtacg acgtctacga cgtggacctg tcccgcggcg gctgcgacga cctccgcgcc 120

ctgctcctgg acaccgcccc gcggtcgctc atcctcgtgg aggacctcga ccgctacctg 180

cgcggcgggg acggcgagac ggcggcggcg aggaccgcgc gcgtgctcgg cttcatggac 240

gggctctcct cgtcatgcgg cgaggagcgc gtgatggtgt tcaccatgag cgggggcaag 300

gacggcgtgg acccggccgt gctgcggccc ggccggctcg acgtccacat ccacttcacr 360

catgtgcgac ttcgagggat tcaaggctcr tggcgagcaa ctacctgggg ctcaaggacc 420

acaagctgta cccgcaggtg gaggaggggt tccacgccgg cgcccgcctc agccccgccg 480

agctcggcga gatcatgctc gccaaccgcg ggtccgcgag ccgcgcgctc cgcaccgtca 540

tcagcgcgct gcagcacgtg gccccgtcac cgcctccgca gcggaccgtc accgcggcgc 600

ggccgccgag gctgacatcg agatggtccg ggcacctcga cgaggccagc gtcgcgaccg 660

cgacgtccga ggccagcgcg gcggggcagt cgccgcgggg cgggggaggt ttcgccaagg 720

acgcgccgat cagggagatc aagaagctct acggtctgat caagtacagg agccgcaagg 780

acgccggcgt cgtgccggtg gatgacagcg cggcatcgcc ggacgggcgg gacagcgacg 840

ttagccccga gaaggaccgg tgattagtta tctgtgtttt cttttttttt ttcgttttca 900

cttttgataa tgggttctaa agtagtagta caaattactg tttattcgaa acgtgggtgg 960

atgtacattc tgcactgtaa atctttgtag cactagaggc tttctcatta ctcgagaaaa 1020

aaacgtgtt 1029

<210> 2

<211> 900

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 2

tggtaaccgc ttcttcgcag tttggcacgc aaaatcgcgg tcaatgagcc caattgacat 60

tctggtgaca ccttatgcga aatactcagg tgcaatagaa tagcaaattc tcaacaacga 120

ctaacaacca ggactctgta tgtttgttag tttgaagttg aagtagtcaa agatcttatt 180

cttgtttgcc aaaagaacag aaatctgaca ttagtttcca aacaccgtga tttgcgcgct 240

ttgtaccaat ctctgtcacc gagctagcac tgccactaat cctgtcctgg accaccgtcg 300

ctggtccgtc ctagtcccct cgcgggagcc ggcggcttgg ggacaatcgt cgccgattcc 360

tttgcccacc atactgcgat ttgatgaagc gccgggctgg ctgcggttgc cacatcgcca 420

taacaccgct ttcaggtgtt agctcgcgtc tgtttcggct ctgccttgcg cttaactgtc 480

ttttcgtttg gttcctatag tatttttgtc cttataaatt acagctgcag caatcaaaca 540

gcccacttta attcgaaaca aacaaccgac ttttaaatag tattgtacaa tatatacttc 600

atctgtccta taatataatg tataaccatt tttatttttg tcctataata taagacatgt 660

tatctttaaa cacacgtaca tcgatgcaat agcatagata aaattaaata tatttattgg 720

cttttgaact agagtagagt tagttacgtc ttatacagtg agagggagta atatatactg 780

tatagtacat atactgtaca gtagcaaagg acacgcgtgg ttacgaggtg ctagacaatg 840

agatgaagca aagacgccca ttattattgc acttagaggc tggcgatgat gattaggggc 900

<210> 3

<211> 1048

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtgccttt tacgggaaat ggaggatcat tatgtccatc ccaagtctaa gtctaaccat 60

ggctccttgt caggaaatgg ttatgagatg aaaaatccag gccatgaagt ttgtgatagg 120

gattcatcat cagagtctga tcgatctcac ccagaagcat cagcagtgag tgaaagcagt 180

ctagatgaac acacatcaac tcaatcagac aatgatgaag atcatgggaa ggataatcag 240

gacacattga agccagtatt gtccttgggg aaggaagggt ctgccttttt ggccccaaaa 300

atagattaca acccatcttt tgcttatatt ccttatactg ctgatgctta ctatggtggc 360

gttggggtct tgacaggata tgctccacat accattgtcc atccccagca aaatgataca 420

acaaatagtc cggttatgtt gcctgcggaa cctgcagaag aagaaccaat atatgtcaat 480

gcaaaacaat accatgcaat ccttaggagg aggcagacac gtgctaaact ggaggcgcag 540

aacaagatgg tgaaaggccg gaagccatac cttcatgagt ctcgacaccg tcatgccatg 600

aagcgggccc gtggctcagg agggcggttc ctcaacacaa agcagcagcc ccaggagcag 660

aaccagcagt accaggcgtc gagtggttca atgtgctcaa agaccattgg caacagcgta 720

atctcccaaa gtggccccat ttgcacgccc tcttctgacg ctgcaggtgc ttcagcagcc 780

agccaggacc gcggctgctt gccctcggtg ggcttccgcc ccacagccaa cttcagtgag 840

caaggtggag gcggctcgaa gctggtcgtg aacggcatgc agcagcgtgt ttccaccata 900

aggtgaagag aagtgggcac gacaccattc ccaggcgcgc actgcctgtg gcaactcatc 960

cttggctttt gaaactatgg atatgcaatg gacatgtagc ttcgagttcc tcagaataac 1020

caaacgtgaa gaatatgcaa agtccttt 1048

<210> 4

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagcccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg 60

gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg 120

caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta tccctggctc 180

gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg gaaggcacgc 240

aacgcctacg actggacggc cgagtcaacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg 300

ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag 360

agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca cgaggcgctc 420

ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa ctggcatgac 480

gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc cccgtccggt cctgcccgtc 540

accgagatgt ga 552

<210> 5

<211> 11417

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aattcaagct tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt 60

gcatgtctaa gttataaaaa attaccacat attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca 120

gtttatctat ctttatacat atatttaaac tttactctac gaataatata atctatagta 180

ctacaataat atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag 240

gacaattgag tattttgaca acaggactct acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt 300

ctcctttttt tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt attagtacat 360

ccatttaggg tttagggtta atggttttta tagactaatt tttttagtac atctatttta 420

ttctatttta gcctctaaat taagaaaact aaaactctat tttagttttt ttatttaata 480

atttagatat aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga 540

aattaaaaaa actaaggaaa catttttctt gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa 600

cgccgtcgac gagtctaacg gacaccaacc agcgagccag cagcgtcgcg tcgggccaag 660

cgaagcagac ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac ccctctcgag agttccgctc 720

caccgttgga cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg 780

agccggcacg gcaggcggcc tcctcctcct ctcacggcac cggcagctac gggggattcc 840

tttcccaccg ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc 900

acaccctctt tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc 960

ccaaatccac ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc 1020

ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta gttctacttc 1080

tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac 1140

ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt tctctttggg 1200

gaatcctggg atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt 1260

tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt 1320

tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg 1380

cggtcgttct agatcggagt agaattaatt ctgtttcaaa ctacctggtg gatttattaa 1440

ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta cgaattgaag atgatggatg 1500

gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg catatacaga 1560

gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg ttcatacgtt 1620

ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt ttggaactgt 1680

atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat atcgatctag 1740

gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc atatgcagca 1800

tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt atgttttata 1860

attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat gtggattttt 1920

ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt cgatactcac 1980

cctgttgttt ggtgttactt ctgcagtaga cgcgtggatc cgagctcaca tgtgcctttt 2040

acgggaaatg gaggatcatt ctgtccatcc aaagtctaag tctaaccatg gttccttgtc 2100

aggaaatggt tatgagatga aaaatccagg ccatgaagtt tgtgataggg attcatcatc 2160

agagtctgat cgatctcacc cagaagcatc agcagtgagt gaaagcagtc tagatgaaca 2220

cacatcaact caatcagaca atgatgaaga tcatgggaag gataatcagg acacattgaa 2280

gccagtattg tccttgggga aggaagggtc tgcctttttg gccccaaaaa tagattacaa 2340

cccgtctttt ccttatattc cttatactgc tgacgcttac tatggtggcg ttggggtctt 2400

gacaggatat gctccgcatg ccattgtcca tccccagcaa aatgatacaa caaatagtcc 2460

ggttatgttg cctgcggaac ctgcagaaga agaaccaata tatgtcaatg caaaacaata 2520

ccatgcgatc cttaggagga ggcagacacg tgctaaactg gaggcgcaga acaagatggt 2580

gaaaggtcgg aagccatacc ttcatgagtc tcgacaccgt catgccatga agcgggcccg 2640

tggctcagga gggcggttcc tcaacacaaa gcagcagctc caggagcaga accagcagta 2700

ccaggcgtcg agtggttcaa tgtgctcaaa gaccattggc gacagcgtaa tctcccaaag 2760

tggccccatt tgcacgccct cttctgacgc tgcaggtgct tcagcagcca gccaggaccg 2820

cggctgcttg ccctcggttg gcttccgccc cacagccaac ttcagtgagc aaggtggagg 2880

cggctcgaag ctggtcgtga acggcatgca gcagcgtgtt tccaccataa gggtgtgaat 2940

tacaggtgac cagctcgaat ttccccgatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa 3000

gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta 3060

agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta 3120

gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg 3180

ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcg ggaattaaac tatcagtgtt 3240

tgacaggata tattggcggg taaacctaag agaaaagagc gtttattaga ataacggata 3300

tttaaaaggg cgtgaaaagg tttatccgtt cgtccatttg tatgtgcatg ccaaccacag 3360

ggttcccctc gggatcaaag tactttgatc caacccctcc gctgctatag tgcagtcggc 3420

ttctgacgtt cagtgcagcc gtcttctgaa aacgacatgt cgcacaagtc ctaagttacg 3480

cgacaggctg ccgccctgcc cttttcctgg cgttttcttg tcgcgtgttt tagtcgcata 3540

aagtagaata cttgcgacta gaaccggaga cattacgcca tgaacaagag cgccgccgct 3600

ggcctgctgg gctatgcccg cgtcagcacc gacgaccagg acttgaccaa ccaacgggcc 3660

gaactgcacg cggccggctg caccaagctg ttttccgaga agatcaccgg caccaggcgc 3720

gaccgcccgg agctggccag gatgcttgac cacctacgcc ctggcgacgt tgtgacagtg 3780

accaggctag accgcctggc ccgcagcacc cgcgacctac tggacattgc cgagcgcatc 3840

caggaggccg gcgcgggcct gcgtagcctg gcagagccgt gggccgacac caccacgccg 3900

gccggccgca tggtgttgac cgtgttcgcc ggcattgccg agttcgagcg ttccctaatc 3960

atcgaccgca cccggagcgg gcgcgaggcc gccaaggccc gaggcgtgaa gtttggcccc 4020

cgccctaccc tcaccccggc acagatcgcg cacgcccgcg agctgatcga ccaggaaggc 4080

cgcaccgtga aagaggcggc tgcactgctt ggcgtgcatc gctcgaccct gtaccgcgca 4140

cttgagcgca gcgaggaagt gacgcccacc gaggccaggc ggcgcggtgc cttccgtgag 4200

gacgcattga ccgaggccga cgccctggcg gccgccgaga atgaacgcca agaggaacaa 4260

gcatgaaacc gcaccaggac ggccaggacg aaccgttttt cattaccgaa gagatcgagg 4320

cggagatgat cgcggccggg tacgtgttcg agccgcccgc gcacgtctca accgtgcggc 4380

tgcatgaaat cctggccggt ttgtctgatg ccaagctggc ggcctggccg gccagcttgg 4440

ccgctgaaga aaccgagcgc cgccgtctaa aaaggtgatg tgtatttgag taaaacagct 4500

tgcgtcatgc ggtcgctgcg tatatgatgc gatgagtaaa taaacaaata cgcaagggga 4560

acgcatgaag gttatcgctg tacttaacca gaaaggcggg tcaggcaaga cgaccatcgc 4620

aacccatcta gcccgcgccc tgcaactcgc cggggccgat gttctgttag tcgattccga 4680

tccccagggc agtgcccgcg attgggcggc cgtgcgggaa gatcaaccgc taaccgttgt 4740

cggcatcgac cgcccgacga ttgaccgcga cgtgaaggcc atcggccggc gcgacttcgt 4800

agtgatcgac ggagcgcccc aggcggcgga cttggctgtg tccgcgatca aggcagccga 4860

cttcgtgctg attccggtgc agccaagccc ttacgacata tgggccaccg ccgacctggt 4920

ggagctggtt aagcagcgca ttgaggtcac ggatggaagg ctacaagcgg cctttgtcgt 4980

gtcgcgggcg atcaaaggca cgcgcatcgg cggtgaggtt gccgaggcgc tggccgggta 5040

cgagctgccc attcttgagt cccgtatcac gcagcgcgtg agctacccag gcactgccgc 5100

cgccggcaca accgttcttg aatcagaacc cgagggcgac gctgcccgcg aggtccaggc 5160

gctggccgct gaaattaaat caaaactcat ttgagttaat gaggtaaaga gaaaatgagc 5220

aaaagcacaa acacgctaag tgccggccgt ccgagcgcac gcagcagcaa ggctgcaacg 5280

ttggccagcc tggcagacac gccagccatg aagcgggtca actttcagtt gccggcggag 5340

gatcacacca agctgaagat gtacgcggta cgccaaggca agaccattac cgagctgcta 5400

tctgaataca tcgcgcagct accagagtaa atgagcaaat gaataaatga gtagatgaat 5460

tttagcggct aaaggaggcg gcatggaaaa tcaagaacaa ccaggcaccg acgccgtgga 5520

atgccccatg tgtggaggaa cgggcggttg gccaggcgta agcggctggg ttgtctgccg 5580

gccctgcaat ggcactggaa cccccaagcc cgaggaatcg gcgtgacggt cgcaaaccat 5640

ccggcccggt acaaatcggc gcggcgctgg gtgatgacct ggtggagaag ttgaaggccg 5700

cgcaggccgc ccagcggcaa cgcatcgagg cagaagcacg ccccggtgaa tcgtggcaag 5760

cggccgctga tcgaatccgc aaagaatccc ggcaaccgcc ggcagccggt gcgccgtcga 5820

ttaggaagcc gcccaagggc gacgagcaac cagatttttt cgttccgatg ctctatgacg 5880

tgggcacccg cgatagtcgc agcatcatgg acgtggccgt tttccgtctg tcgaagcgtg 5940

accgacgagc tggcgaggtg atccgctacg agcttccaga cgggcacgta gaggtttccg 6000

cagggccggc cggcatggcc agtgtgtggg attacgacct ggtactgatg gcggtttccc 6060

atctaaccga atccatgaac cgataccggg aagggaaggg agacaagccc ggccgcgtgt 6120

tccgtccaca cgttgcggac gtactcaagt tctgccggcg agccgatggc ggaaagcaga 6180

aagacgacct ggtagaaacc tgcattcggt taaacaccac gcacgttgcc atgcagcgta 6240

cgaagaaggc caagaacggc cgcctggtga cggtatccga gggtgaagcc ttgattagcc 6300

gctacaagat cgtaaagagc gaaaccgggc ggccggagta catcgagatc gagctagctg 6360

attggatgta ccgcgagatc acagaaggca agaacccgga cgtgctgacg gttcaccccg 6420

attacttttt gatcgatccc ggcatcggcc gttttctcta ccgcctggca cgccgcgccg 6480

caggcaaggc agaagccaga tggttgttca agacgatcta cgaacgcagt ggcagcgccg 6540

gagagttcaa gaagttctgt ttcaccgtgc gcaagctgat cgggtcaaat gacctgccgg 6600

agtacgattt gaaggaggag gcggggcagg ctggcccgat cctagtcatg cgctaccgca 6660

acctgatcga gggcgaagca tccgccggtt cctaatgtac ggagcagatg ctagggcaaa 6720

ttgccctagc aggggaaaaa ggtcgaaaag gtctctttcc tgtggatagc acgtacattg 6780

ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccgga acccgtacat tgggaaccca aagccgtaca 6840

ttgggaaccg gtcacacatg taagtgactg atataaaaga gaaaaaaggc gatttttccg 6900

cctaaaactc tttaaaactt attaaaactc ttaaaacccg cctggcctgt gcataactgt 6960

ctggccagcg cacagccgaa gagctgcaaa aagcgcctac ccttcggtcg ctgcgctccc 7020

tacgccccgc cgcttcgcgt cggcctatcg cggccgctgg ccgctcaaaa atggctggcc 7080

tacggccagg caatctacca gggcgcggac aagccgcgcc gtcgccactc gaccgccggc 7140

gcccacatca aggcaccctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 7200

atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 7260

cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt 7320

agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag 7380

tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc 7440

gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 7500

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 7560

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 7620

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 7680

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 7740

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 7800

gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 7860

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 7920

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 7980

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 8040

ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 8100

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 8160

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 8220

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 8280

tggtcatgca ttctaggtac taaaacaatt catccagtaa aatataatat tttattttct 8340

cccaatcagg cttgatcccc agtaagtcaa aaaatagctc gacatactgt tcttccccga 8400

tatcctccct gatcgaccgg acgcagaagg caatgtcata ccacttgtcc gccctgccgc 8460

ttctcccaag atcaataaag ccacttactt tgccatcttt cacaaagatg ttgctgtctc 8520

ccaggtcgcc gtgggaaaag acaagttcct cttcgggctt ttccgtcttt aaaaaatcat 8580

acagctcgcg cggatcttta aatggagtgt cttcttccca gttttcgcaa tccacatcgg 8640

ccagatcgtt attcagtaag taatccaatt cggctaagcg gctgtctaag ctattcgtat 8700

agggacaatc cgatatgtcg atggagtgaa agagcctgat gcactccgca tacagctcga 8760

taatcttttc agggctttgt tcatcttcat actcttccga gcaaaggacg ccatcggcct 8820

cactcatgag cagattgctc cagccatcat gccgttcaaa gtgcaggacc tttggaacag 8880

gcagctttcc ttccagccat agcatcatgt ccttttcccg ttccacatca taggtggtcc 8940

ctttataccg gctgtccgtc atttttaaat ataggttttc attttctccc accagcttat 9000

ataccttagc aggagacatt ccttccgtat cttttacgca gcggtatttt tcgatcagtt 9060

ttttcaattc cggtgatatt ctcattttag ccatttatta tttccttcct cttttctaca 9120

gtatttaaag ataccccaag aagctaatta taacaagacg aactccaatt cactgttcct 9180

tgcattctaa aaccttaaat accagaaaac agctttttca aagttgtttt caaagttggc 9240

gtataacata gtatcgacgg agccgatttt gaaaccgcgg tgatcacagg cagcaacgct 9300

ctgtcatcgt tacaatcaac atgctaccct ccgcgagatc atccgtgttt caaacccggc 9360

agcttagttg ccgttcttcc gaatagcatc ggtaacatga gcaaagtctg ccgccttaca 9420

acggctctcc cgctgacgcc gtcccggact gatgggctgc ctgtatcgag tggtgatttt 9480

gtgccgagct gccggtcggg gagctgttgg ctggctggtg gcaggatata ttgtggtgta 9540

aacaaattga cgcttagaca acttaataac acattgcgga cgtttttaat gtactgaatt 9600

aacgccgaat taattcgggg gatctggatt ttagtactgg attttggttt taggaattag 9660

aaattttatt gatagaagta ttttacaaat acaaatacat actaagggtt tcttatatgc 9720

tcaacacatg agcgaaaccc tataggaacc ctaattccct tatctgggaa ctactcacac 9780

attattatgg agaaactcga gcttgtcgat cgacagatcc ggtcggcatc tacttcacat 9840

ctcggtgacg ggcaggaccg gacggggcgg taccggcagg ctgaagtcca gctgccagaa 9900

acccacgtca tgccagttcc cgtgcttgaa gccggccgcc cgcagcatgc cgcggggggc 9960

atatccgagc gcctcgtgca tgcgcacgct cgggtcgttg ggcagcccga tgacagcgac 10020

cacgctcttg aagccctgtg cctccaggga cttcagcagg tgggtgtaga gcgtggagcc 10080

cagtcccgtc cgctggtggc ggggggagac gtacacggtt gactcggccg tccagtcgta 10140

ggcgttgcgt gccttccagg ggcccgcgta ggcgatgccg gcgacctcgc cgtccacctc 10200

ggcgacgagc cagggatagc gctcccgcag acggacgagg tcgtccgtcc actcctgcgg 10260

ttcctgcggc tcggtacgga agttgaccgt gcttgtctcg atgtagtggt tgacgatggt 10320

gcagaccgcc ggcatgtccg cctcggtggc acggcggatg tcggccgggc gtcgttctgg 10380

gctcatctcg agagagatag atttgtagag agagactggt gatttcagcg tgtcctctcc 10440

aaatgaaatg aacttcctta tatagaggaa ggtcttgcga aggatagtgg gattgtgcgt 10500

catcccttac gtcagtggag atatcacatc aatccacttg ctttgaagac gtggttggaa 10560

cgtcttcttt ttccacgatg ctcctcgtgg gtgggggtcc atctttggga ccactgtcgg 10620

cagaggcatc ttgaacgata gcctttcctt tatcgcaatg atggcatttg taggtgccac 10680

cttccttttc tactgtcctt ttgatgaagt gacagatagc tgggcaatgg aatccgagga 10740

ggtttcccga tattaccctt tgttgaaaag tctcaatagc cctttggtct tctgagactg 10800

tatctttgat attcttggag tagacgagag tgtcgtgctc caccatgtta tcacatcaat 10860

ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgctc ctcgtgggtg 10920

ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttg aacgatagcc tttcctttat 10980

cgcaatgatg gcatttgtag gtgccacctt ccttttctac tgtccttttg atgaagtgac 11040

agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat taccctttgt tgaaaagtct 11100

caatagccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt cttggagtag acgagagtgt 11160

cgtgctccac catgttggca agctgctcta gccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 11220

ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 11280

gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 11340

gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 11400

ctatgaccat gattacg 11417

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gacgtccaca tccacttcac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtttcgctca tgtgttgagc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggtgaccag ctcgaatttc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccctctcact gtataagacg 20

Claims (7)

1.一种转基因耐盐耐除草剂玉米SR801外源***旁侧序列，其特征在于，所述旁侧序列的两侧翼序列的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的DNA转基因耐盐耐除草剂玉米SR801外源***旁侧序列，其特征在于，所述外源***片段中包括玉米ZmNF-YA14基因和耐草铵膦Bar基因，所述玉米ZmNF-YA14基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述耐草铵膦Bar基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。

3.权利要求1-2任一所述的转基因耐盐耐除草剂玉米SR801外源***旁侧序列在检测转基因玉米SR801中的应用。

4.用于检测耐盐耐除草剂转基因玉米SR801的特异性引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：6-7或SEQ ID NO：8-9所示。

5.用于检测转基因玉米SR801的试剂盒，其特征在于，含有权利要求4所述的特异性引物对。

6.权利要求4所述的特异性引物对在检测转基因玉米SR801亲本、后代、杂种F1，及其植株、组织、种子或其制品中的应用。

7.一种检测耐盐耐除草剂转基因玉米SR801的方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求书4所述的特异性引物对进行PCR反应，根据PCR产物的电泳片段判断结果；

当采用核苷酸序列如SEQ ID NO：6-7所示的特异性引物对对样品DNA进行PCR扩增时，若扩增产物条带大小为899bp，则待测样品含有SR801来源的成分；

若采用核苷酸序列如SEQ ID NO：8-9所示的特异性引物对对样品DNA进行PCR扩增时，若扩增产物条带大小为1046bp，则待测样品含有SR801来源的成分。

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