CN111454978B - 用于特异性吸附重金属铅的表面展示工程菌及构建方法和应用 - Google Patents

用于特异性吸附重金属铅的表面展示工程菌及构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于特异性吸附重金属铅的表面展示工程菌及构建方法和应用；以冰晶核蛋白N端序列为锚定载体，通过柔性连接肽将铅结合蛋白展示在大肠杆菌细胞外膜表面，构建特异性铅结合蛋白表面展示基因工程菌。包括PbrR表面展示工程菌BL21(pR‑FL)、PbrR691表面展示工程菌BL21(pR691‑FL)和PbrD表面展示工程菌BL21(pD‑FL)。本发明中提供的基因工程菌可以高效地吸附水环境中的铅离子，且在混合金属离子共存条件下也具有对铅离子绝对的选择特异性。这种表面展示细胞吸附剂培养简单，易于获得，吸附周期短，且安全有效，十分便捷，为未来重金属的去除与回收提供了新技术和新思路。

Description

用于特异性吸附重金属铅的表面展示工程菌及构建方法和应用
技术领域
本发明涉及用于特异性吸附重金属铅的表面展示工程菌及构建方法和应用；涉及一种特异性的铅结合蛋白表面展示工程菌的构建方法，并利用该方法构建的用于铅离子吸附的表面展示工程菌，提供工程菌在重金属吸附方面的应用，属于分子生物学及基因工程菌改造领域。
背景技术
如今世界经济的快速发展，使工业化进程推进过程中的排污问题越来越严重，也使重金属污染问题越来越受到全球关注。铅是一种天然存在于地壳中的剧毒重金属。铅污染对环境造成的危害巨大：首先，农作物在含铅土壤中生长可能会导致生长不良或大幅减产；其次，铅不可降解，具有神经毒性，是一种严重危害人体健康的重金属元素，在体内的量超过一定水平就会对健康引起损害。利用传统的物理化学方法治理重金属污染过程虽取得一定成效，但对设备的要求极高，造成的修复成本也高，且修复工艺复杂，还要求投入大量的人力和物力，对重金属的选择缺乏特异性。而生物修复兼具了去除效率高，价格低廉，操纵简单，吸附效率高，对环境影响作用小等优势，尤其是近年来表面展示技术的出现，通过基因工程手段将特定蛋白固定在细胞外膜上，实现某一种或某一类重金属离子在细胞外被结合并达到去除的目的，在重金属吸附与去除领域得到广泛应用。
经研究发现，耐金属贪铜菌CH34(Cupriavidus metallidurans CH34)是目前唯一一个已被证明含有特殊的铅离子调控机制的细菌，与铅离子结合有关的基因几乎全部位于pbr操纵子上，而且，操纵子内的全部相关基因(pbrTRABCD)的表达均受到一种来自MerR家族的PbrR蛋白的调控。虽然C.metallidurans CH34对铅离子具有特异性识别与富集能力，但该菌不易获得，对其基因组和蛋白组的信息研究有限，且细胞对Pb2+的吸附能力不高，铅离子需要跨过细胞膜进入胞内才能实现固定，对细胞损害大，不适宜在高浓度含铅环境下应用。
重组基因技术的不断进步促进了基因工程的发展，以基因工程的思想改造菌种成为一种达到定向目的的手段。大肠杆菌(Escherichia coli)作为典型的的实验室模式菌株，代谢途径清楚，无内生质粒，可用作基因工程改造的优良底盘细胞，构建表面展示工程化菌株，作为表面细胞吸附剂用于重金属铅的去除。有研究者将PbrR蛋白与LPP-OmpA的融合蛋白展示在大肠杆菌细胞表面，使工程菌富集铅离子的能力相较于出发菌株得到提高，但是吸附能力却十分有限，而且绝大多数对铅的特异性吸附都依赖于PbrR，蛋白可选择性单一。因此，现阶段需要扩大特异性铅离子结合蛋白研究库，提供更多具有特异性铅结合能力的基因工程菌，实现对环境中铅离子的更高容量吸附。
作为优选，本研究从耐金属贪铜菌中选出三种非膜蛋白PbrR，PbrR691及PbrD，以冰晶核蛋白INP的N端序列为锚定蛋白，通过柔性连接肽以融合蛋白的形式在E.coli BL21(DE3)中分别构建了三株用于特异性吸附重金属铅的表面展示工程菌，并具备优良的铅离子结合能力，既避免了铅离子进入细胞产生的毒害作用，又解决了在现有研究中铅结合蛋白选择单一，吸附效率不高等出现的瓶颈问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性铅结合蛋白表面展示工程化菌株的构建方法和应用方法，使得利用该方法构建的表面展示工程菌具备对铅离子的高容量吸附和特异性选择性能。以冰晶核蛋白N端序列为锚定载体，通过柔性连接肽将铅结合蛋白展示在大肠杆菌细胞外膜表面，构建特异性铅结合蛋白表面展示基因工程菌。工程菌株在含铅溶液中的应用方法，工程菌可在不同浓度的单一铅离子溶液中或混合金属离子溶液中发挥优良的吸附功效，表现出对Pb2+较高的吸附能力和良好的选择特异性。
本发明技术方案如下：
本发明的特异性铅结合蛋白表面展示工程化菌株的构建：
(1)通过聚合酶链式反应(PCR)分别扩增编码锚定蛋白INPN和铅结合蛋白的核苷酸序列，并在扩增时去除锚定蛋白INPN末端的终止密码子，引入柔性连接肽FL(GGGGS)，在铅结合蛋白编码序列的终止密码子前引入六聚组氨酸标签(His-Tag)；
(2)通过酶切连接的方式将锚定蛋白INPN与铅结合蛋白基因序列进行融合，构建融合蛋白模块；
(3)将融合蛋白模块克隆至pET-28a(+)质粒载体上；并将克隆后的质粒载体导入宿主底盘细胞BL21(DE3)中，通过菌落PCR筛选带有目的筛选质粒的阳性克隆菌株，即为特异性铅结合蛋白表面展示工程化菌株。
作为优选，所述步骤(1)中使用的铅结合蛋白选自耐金属贪铜菌CH34的三种非膜蛋白PbrR，PbrR691或PbrD；
所述步骤(2)的融合蛋白模块分别为PbrR融合模块INPN-FL-PbrR、PbrR691融合模块INPN-FL-PbrR691或PbrD融合模块INPN-FL-PbrD，如图1所示；
所述步骤(1)中编码冰核蛋白N端结构域INPN的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，铅结合蛋白PbrR、PbrR691、PbrD的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4所示；
所述步骤(3)中克隆载体pET28a(+)质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，目的筛选质粒分别为：含有PbrR融合模块的重组质粒pR-FL(核苷酸序列如SEQ ID No.6)，含有PbrR691融合模块的重组质粒pR691-FL(核苷酸序列如SEQ ID No.7)，含有PbrD融合模块的重组质粒pD-FL(核苷酸序列如SEQ ID No.8)。所有重组质粒图谱如图2所示。
所述的柔性连接肽FL由四个甘氨酸和一个丝氨酸残基伸展组成(GGGGS)。
通过上述步骤，本发明构建的用于特异性吸附重金属铅的表面展示工程菌，包括PbrR表面展示工程菌BL21(pR-FL)，所含重组质粒pR-FL核苷酸序列为SEQ ID No.6；PbrR691表面展示工程菌BL21(pR691-FL)，所含重组质粒pR691-FL核苷酸序列为SEQ IDNo.7；PbrD表面展示工程菌BL21(pD-FL)，所含重组质粒pD-FL核苷酸序列为SEQ ID No.8。
本发明还提供了所述表面展示工程菌在含铅环境中的应用，所述应用方法如下：
(1)菌株活化：挑取工程菌株BL21(pR-FL)、BL21(pR691-FL)或BL21(pD-FL)的单菌落接种至3-5ml LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床过夜培养以活化菌体；将上述活化后的种子培养液按照1％～3％的接种比例转接至含有100mL无抗液体培养基的摇瓶中；
(2)待培养液OD600＝0.6～0.8后，向各个摇瓶中分别添加终浓度为0.2-0.5mM的IPTG诱导剂，同时向各个摇瓶中添加终浓度为100-2000μM的重金属离子；并将添加完诱导剂和金属离子的培养液置于22-26℃，200-220rpm的恒温摇床中诱导蛋白表达；
(3)菌液培养12h后，在5000-8000rpm条件下离心5-10min收集全部菌体，用无菌去离子水至少洗涤三次，将菌体沉淀置于60-65℃烘箱中持续加热24h，充分烘干菌体并称量菌体干重(CDW)；
(4)金属含量测定：微波消解法硝化细菌，去除杂质，原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱法测定工程菌株吸附的金属含量；
菌株的金属吸附能力(μmol/g CDW)＝测定得到的金属总含量(μmol)/菌体干重(g)。
本发明中用于菌株培养的LB培养基成分为(以1L的培养基计)：10g NaCl、10g胰蛋白胨和5g酵母粉，全部溶解后调节培养基pH至7.2～7.4。并在121℃条件下高压蒸汽灭菌20min。
本发明的优点表现为：利用细胞表面展示技术，通过INPN将特异性铅结合蛋白展示在大肠杆菌细胞表面，提供了三株特异性铅结合蛋白表面展示工程菌，不仅具有极高的铅离子吸附性能，还能够在众多金属混合溶液中实现对铅离子的特异性选择，通过菌体去除即可实现溶液中重金属铅的去除。不仅解决了当前铅结合蛋白选择单一，吸附效率不高的问题，还能够避免铅离子进入细胞，缓解重金属对细胞生长造成的毒害，对重金属污染环境的原位修复具有重要意义。
本发明中提供的基因工程菌可以高效地吸附水环境中的铅离子，且在混合金属离子共存条件下也具有对铅离子绝对的选择特异性。这种表面展示细胞吸附剂培养简单，易于获得，吸附周期短，且安全有效，十分便捷，为未来重金属的去除与回收提供了新技术和新思路。
附图说明
图1为INPN-FL-PbrR、INPN-FL-PbrR691及INPN-FL-PbrR模块构建流程；
图2为重组质粒pR-FL/pR691-FL/pD-FL图谱
图3为工程菌细胞分级分离后的Western blot检测结果
图4为工程菌在不同浓度的单一铅离子溶液中的吸附效果
图5为工程菌在不同浓度的混合重金属溶液中的吸附效果
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
本发明的实施例中涉及的质粒提取、PCR产物纯化、琼脂糖凝胶回收等操作均按照博迈德生物技术有限公司提供的对应试剂盒进行；所有使用的限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自Thermo Fisher公司。
实施例1铅结合蛋白表面展示工程菌的构建
(1)PCR扩增基因片段：设计扩增片段的特异性引物，利用高保真聚合酶分别扩增得到SEQ ID No.1所示的冰晶核蛋白N端序列INPN(引物N-F和N-R)、SEQ ID No.2所示的PbrR编码序列(引物R-F和R-R)、SEQ ID No.3所示的PbrR691编码序列(引物R691-F和R691-R)及SEQ ID No.4所示的PbrD编码序列(引物D-F和D-R)。并去除INPN的终止密码子，在其后引入柔性连接肽FL(GGGGS)，并在序列上下游分别引入酶切位点NcoI和BamHI；分别在PbrR、PbrR691及PbrD的编码基因上游引入BamHI酶切位点，下游终止密码前引入六聚组氨酸标签(His-Tag)，终止密码子后引入EcoRI酶切位点。
目的片段扩增用到的引物序列如下所示，其中标有下划线的部分为酶切位点：
N-F：CATGCCATGGGCATGACCCTGGATAAAGCACTGG；
N-R：CGGGATCCGGAACCACCACCACCGGTCTGCAGATTCTGCGGTGTGG；
R-F：CGGGATCCATGAACATTCAGATTGGTGAACTGGC
R-R：CCGGAATTCTTAATGATGATGGTGATGATGATCGCTCGGATGTGCGGTGGTGCCAC
R691-F：CGGGATCCATGATGCGTATTGGTGAACTGGG
R691-R：CCGGAATTCTTAATGATGATGGTGATGATGTGCAGGTTCTGCCAGGCTATTCAG
D-F：CGGGATCCATGATGCCGGTTTATCTGGCCGATC
D-R：CCGGAATTCTTAATGATGATGGTGATGATGACGACATGCATAGGCACCATCATTAC
序列扩增的PCR体系为50μL，包括ddH20 18μL，2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTPMix1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶1μL，上游引物、下游引物及模板各1μL；
序列扩增的PCR条件为95℃预变性30s，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸60s，进行35个循环以后在72℃彻底延伸5min结束。
(2)融合蛋白模块的构建：以上PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，得到INPN-FL(552bp)，PbrR(435bp)，PbrR691(396bp)和PbrD(723bp)对应的凝胶条带，按照凝胶回收试剂盒说明对目的条带进行回收。之后将上述凝胶回收后的基因片段进行酶切：INPN-FL利用NcoI和BamHI双酶切，PbrR/PbrR691/PbrD分别用BamHI和EcoRI酶切。根据PCR产物纯化试剂盒说明书对消化产物进行纯化，测定各个DNA溶液的浓度，将INPN-FL基因序列分别与PbrR/PbrR691/PbrD蛋白编码序列按照1：1的比例配制T4连接酶连接体系。连接反应程序为：22℃，30min；70℃，5min。将所得DNA产物再次跑胶并回收融合基因片段，得到PbrR融合模块INPN-FL-PbrR，PbrR691融合模块INPN-FL-PbrR691，PbrD融合模块INPN-FL-PbrR，如附图1所示。
(3)将质粒pET-28a(+)与纯化回收后的融合基因片段通过限制性内切酶NcoI和EcoRI进行酶切，经PCR产物纯化回收后的线性质粒与融合基因按照1：5的比例配制T4连接酶连接体系进行连接。将连接产物转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)，通过菌落PCR筛选阳性克隆，提取重组质粒送至北京金唯智生物科技有限公司进行测序。得到无任何突变发生的铅结合蛋白重组质粒表达载体(图2)，包括含有PbrR融合模块的重组质粒pR-FL，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，含有PbrR691融合模块的重组质粒pR691-FL，核苷酸序列如SEQID No.7所示，含有PbrD融合模块的重组质粒pD-FL，核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。得到的阳性克隆菌株即为特异性铅结合蛋白表面展示工程菌，分别为含有重组质粒pR-FL的PbrR表面展示工程菌BL21(pR-FL)、含有重组质粒pR691-FL的PbrR691表面展示工程菌BL21(pR691-FL)、含有重组质粒pD-FL的PbrD表面展示工程菌BL21(pD-FL)。
实施例2融合蛋白的表达与定位
(1)菌株活化：挑取工程菌株BL21(pR-FL)、BL21(pR691-FL)或BL21(pD-FL)的单菌落接种至5ml LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床过夜培养以活化菌体；
(2)将上述活化后的种子培养液按照1％的接种比例转接至含有100mL无抗液体培养基的摇瓶中，待菌液OD600＝0.6～0.8，添加IPTG至终浓度为0.2mM，并设置摇床温度为22℃，诱导12h后，收集所有细胞沉淀物，用PBS溶液洗三次，然后用10mL PBS重悬；
(3)用超声波破碎仪破碎细胞10分钟(每超声波破碎5秒，间歇5秒)，然后以8000rpm离心10分钟以除去破碎不完全的细胞碎片。收集离心后的上清液，转移到贝克曼超速离心机的专用离心管中，以39000rpm的转速离心1h，细胞质组分存在于上清液中，而膜组分在沉淀部分。用含有0.01mM氯化镁(MgCl2)和2％TritonX-100的PBS缓冲液重新悬浮沉淀并加将其置于室温下孵育30min以使膜成分充分溶溶解，之后再次以39000rpm的转速离心1h。最终得到的沉淀部分即工程菌的细胞外膜成分，而上清液则是工程菌的细胞内膜内成分。
(4)通过Western bloting分析不同细胞成分。
PbrR，PbrR691及PbrD的预期分子量分别为16.4kD，15.2kD和26.7kD。加上INPN(19kD)，连接肽(G4S)和组氨酸标签(His)6-Tag，最终各个融合蛋白的预期分子量分别为36.6kD(INPN-FL-PbrR)，35.5kD(INPN-FL-PbrR691)，46.9kD(INPN-FL-PbrD)。
如附图3所示，细胞分级分离的结果表明，目标条带仅出现在外膜部分，而在内膜部分和细胞质部分均未出现靶蛋白条带，这证实了融合蛋白在细胞外膜上的具体定位。证明我们已经成功将用于铅吸附的目的蛋白PbrR，PbrR691或PbrD展示到了大肠杆菌的细胞外膜上。
实施例3表面展示基因工程菌对铅离子的吸附
(1)挑取工程菌株BL21(pR-FL)、BL21(pR691-FL)或BL21(pD-FL)的单菌落接种至3ml LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床过夜培养以活化菌体；将上述活化后的种子培养液按照2％的接种比例转接至含有100mL无抗液体培养基的摇瓶中。待培养液OD600＝0.6～0.8后，向各个摇瓶中分别添加终浓度为0.5mM的IPTG诱导剂和不同浓度的Pb2+，使其终浓度分别为100、300、500、1000、1500和2000μM；并将添加完诱导剂和金属离子的培养液置于26℃，200rpm的恒温摇床中诱导蛋白表达；
(2)菌液培养12h后，在5000rpm条件下离心10min收集全部菌体，用无菌去离子水洗涤三次，将菌体沉淀置于65℃烘箱中持续加热24h，充分烘干菌体并称量菌体干重(CDW)；
(3)金属含量测定：微波消解硝化细菌，去除杂质，原子吸收光谱法测定各个工程菌株吸附的金属含量；菌株的Pb2+吸附能力(μmol/g CDW)＝测定得到的金属总含量(μmol)/菌体干重(g)
吸附结果如附图4所示，所有重组菌株对铅离子的吸附能力均优于野生型出发菌株BL21。当铅离子浓度不高时，菌株的吸附能力与铅浓度的增加趋势相同。但过高的重金属浓度会抑制细菌的生长和蛋白质表达，从而使菌株吸附铅离子能力显著降低。当培养基中的Pb2+浓度为500μM时，菌株BL21(pR691-FL)的最大吸附值为732.8μmol/g CDW，达到对照组的2.5倍，BL21(pD-FL)的最大吸附值为710.1μmol/g CDW，达到对照组的2.42倍。而当铅浓度为1000μM时，工程菌BL21(pR-FL)达到最大铅离子吸附量为694.3μmol/g CDW，是野生型菌株BL21吸附量的1.7倍。证明本研究构建的三株铅结合蛋白表面展示工程菌对铅离子具有显著的吸附效果。
实施例4表面展示基因工程菌对铅离子的选择特异性吸附
(1)挑取工程菌株BL21(pR-FL)、BL21(pR691-FL)或BL21(pD-FL)的单菌落接种至4ml LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床过夜培养以活化菌体；将上述活化后的种子培养液按照2％的接种比例转接至含有100mL无抗液体培养基的摇瓶中。待培养液OD600＝0.6～0.8后，向各个摇瓶中分别添加终浓度为0.2mM的IPTG诱导剂，和终浓度为100、500和1000μM的混合金属离子，包含铅离子(Pb2+)、镉离子(Cd2+)、砷离子(As3+)和汞离子(Hg2+)。并将添加完诱导剂和金属离子的培养液置于22℃，210rpm的恒温摇床中诱导蛋白表达；
(2)菌液培养12h后，在7000rpm条件下离心8min收集全部菌体，用无菌去离子水洗涤三次，将菌体沉淀置于60℃烘箱中24h，充分烘干菌体并称量菌体干重(CDW)；
(3)金属含量测定：微波消解硝化细菌，去除杂质，电感耦合等离子体质谱法测定各个工程菌株吸附的金属含量；菌株的Pb2+吸附能力(μmol/g CDW)＝测定得到的金属总含量(μmol)/菌体干重(g)
吸附结果如附图5所示，在不同浓度的混合金属离子共存的溶液中，都只有显著量的Pb2+被工程菌所吸附，而其他金属离子的存在不影响三种靶蛋白表面展示工程菌对铅的吸附能力，这表明本研究构建的PbrR、PbrR691或PbrD表面展示工程菌对Pb2+都具备较高的选择特异性。当混合金属离子浓度为100μM时，BL21(pR-FL)对的Pb2+的吸附选择性分别是Cd2+和Hg2+的5.2倍和13倍；BL21(pR691-FL)对铅离子的吸附选择性分别是Cd2+和Hg2+的5.8倍和16.5倍；BL21(pD-FL)对铅离子的吸附选择性分别是Cd2+和Hg2+的5.7倍和12.4倍，但是工程菌不具有吸附As3+的能力。当混合金属离子的浓度增加到500μM时，所有工程菌的吸附能力随之增加；当混合金属离子的浓度达到1000μM时，三株工程菌对铅离子的吸附量都变化不大，这可能是因为目标蛋白已经达到了吸附饱和状态。三株工程菌BL21(pR-FL)，BL21(pR691-FL)或BL21(pD-FL)对Pb2+的最大结合能力分别为942.1，754.3，864.9μmol/g CDW，具有较高的Pb2+吸附能力和良好的选择特异性，具有很好的应用价值。
上述四组实施例应用试验结果表明，以本发明提供的构建方法得到的铅结合蛋白表面展示工程菌能够将目的蛋白以融合蛋白的形式锚定在大肠杆菌细胞外膜表面，并且于22-26℃诱导表达12h后，不论是在含有单一重金属离子Pb存在条件下还是在包含有其它重金属离子的混合溶液中，工程菌BL21(pR-FL)、BL21(pR691-FL)或BL21(pD-FL)对100-2000μM的Pb2+都具有较高的吸附能力和良好的选择特异性，具有很好的应用价值，为重金属污染环境的生物修复提供了新思路和新技术。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
                         序列表
<110>  天津大学
<120>  用于特异性吸附重金属铅的表面展示工程菌及构建方法和应用
<160>  8
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  537
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
atgactctcg acaaggcgtt ggtgctgcgt acctgtgcaa ataacatggc cgatcactgc  60
ggccttatat ggcccgcgtc cggcacggtg gaatccagat actggcagtc aaccaggcgg 120
catgagaatg gtctggtcgg tttactgtgg ggcgctggaa ccagcgcttt tctaagcgtg 180
catgccgatg ctcgatggat tgtctgtgaa gttgccgttg cagacatcat cagtctggaa 240
gagccgggaa tggtcaagtt tccgcgggcc gaggtggttc atgtcggcga caggatcagc 300
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acgtcaacgt taacgccaat gcctacggcc atacccacgc ccatgcctgc ggtagcaagt 420
gtcacgttac cggtggccga acaggcccgt catgaagtgt tcgatgtcgc gtcggtcagc 480
gcggctgccg ccccagtaaa caccctgccg gtgacgacgc cgcagaattt gcagacc    537
<210>  2
<211>  438
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  2
atgaatatcc agatcggcga gcttgccaag cgcaccgcat gcccggtggt gaccattcgc  60
ttctacgaac aagaagggct gttgccgccg ccgggccgca gccgggggaa ttttcgcctg 120
tatggcgagg agcacgtgga gcgcttgcag ttcattcgtc actgccggtc tctggatatg 180
ccgttgagcg acgtacggac cttattgagt taccggaagc ggcccgacca ggattgcggt 240
gaagtcaata tgctcttgga tgagcacatc cgtcaggtcg aatctcggat cggagctttg 300
ctcgaactga agcaccattt ggtggaactg cgcgaagcct gttctggtgc caggcccgcc 360
caatcgtgcg ggattctgca gggactgtcg gactgcgtgt gtgatacgcg ggggaccacc 420
gcccatccaa gcgactag                                               438
<210>  3
<211>  399
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  3
atgatgcgga tcggtgaact gggcaagaag gcagattgct tggtgcagac cgtgcgcttt  60
tacgagtcag aaggcttgct gcccgagcct gcacgtagcg agggcaactt caggctctat 120
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ctggatgaga tccgtcaact gctgaactta cgggatcggc cagagttggg ctgcggcgag 240
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<210>  4
<211>  726
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  4
atgatgccag tgtatttggc tgatttgcaa cgacgtctgg cgcgaggcgc cgccctacaa  60
cccaaaactt gcatgatttc gttggcaggc gacgcgcgac atcgggggcg aaaacggcac 120
ggaatggcgg ctttcatgcg agggagccag gggggcttct ggccgggaag cgaccttcgt 180
cacagcgcaa gtcccggtca tgctctcggt gtacgatgtg cggggagaac cgtccgagcg 240
ggacgagaca ttgtggaatc tcaaagtcca tgggggcagc tatggggttt tcttgccgaa 300
agtttctcat tgcccgtgac gatactctct ggcagctgcc aaccaccaaa ttccagcgga 360
tgttgcggga gccggccaac cactgcttgt ccacttttgc cgggcaacgc gcacgcatgg 420
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aacccgtcgt tgacgcgtcc gcgcgattca ttgcgcaagg gggccaatgg gttccgacac 660
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aggtag                                                            726
<210>  5
<211>  5369
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  5
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cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
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cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
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aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
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tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
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<400> 6
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cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
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acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
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actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
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catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
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tcgttgacgc gtccgcgcga ttcattgcgc aagggggcca atgggttccg acacgagctt 6300
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gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc cggat 6575

Claims (3)

1.一种用于特异性吸附重金属铅的表面展示工程菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)通过PCR反应分别扩增编码锚定蛋白INPN和铅结合蛋白的核苷酸序列，所述铅结合蛋白选自耐金属贪铜菌CH34的三种非膜蛋白PbrR，PbrR691或PbrD；并在扩增时去除锚定蛋白INPN末端的终止密码子，引入柔性连接肽FL，所述柔性连接肽FL的氨基酸序列为GGGGS，在铅结合蛋白编码序列的终止密码子前引入六聚组氨酸标签His-Tag；所述铅结合蛋白PbrR、PbrR691、PbrD的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示；所述INPN的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
(2)通过酶切连接的方式将锚定蛋白INPN与铅结合蛋白基因序列进行融合，构建融合蛋白模块，分别为PbrR融合模块INPN-FL-PbrR、PbrR691融合模块INPN-FL-PbrR691和PbrD融合模块INPN-FL-PbrD；
(3)将融合蛋白模块克隆至pET-28a(+)质粒载体上；并将克隆后的质粒载体导入宿主底盘细胞BL21(DE3)中，通过菌落PCR筛选带有目的筛选质粒的阳性克隆菌株，即为特异性铅结合蛋白表面展示工程化菌株。
2.如权利要求1所述方法构建的表面展示工程菌，其特征是包括PbrR的表面展示工程菌BL21(pR-FL)，所含重组质粒pR-FL核苷酸序列为SEQ ID No.6；包括PbrR691的表面展示工程菌BL21(pR691-FL)，所含重组质粒pR691-FL核苷酸序列为SEQ ID No.7；包括PbrD的表面展示工程菌BL21(pD-FL)，所含重组质粒pD-FL核苷酸序列为SEQ ID No.8。
3.如权利要求1所述的表面展示工程菌在铅离子污染环境原位修复中的应用。
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