CN114403146B - 普鲁兰多糖制备植物诱抗剂的应用、植物诱抗剂及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了普鲁兰多糖制备植物诱抗剂的应用、植物诱抗剂及方法，所述的植物诱抗剂的应用范围包含诱导植物抗病、诱导植物抗逆、抗病毒及抗真菌。本发明利用生物活性测定、生理生化测试等方法明确了普鲁兰多糖的诱导植物抗病活性和诱导植物抗逆活性，并制备了以普鲁兰多糖为活性成分的植物诱抗剂、生物刺激素、抗植物病毒剂和杀菌剂，并在田间应用。

Description

普鲁兰多糖制备植物诱抗剂的应用、植物诱抗剂及方法

技术领域

本发明属于农业领域，具体涉及普鲁兰多糖制备植物诱抗剂的应用、植物诱抗剂及方法。

背景技术

1905年Biffen首次发现小麦中存在抗病基因。1955年，Flor在研究亚麻锈菌小种特异性过程中提出了“基因对基因”假说，阐述了植物抗病基因与病原物无毒基因之间的不亲和关系，在此基础上，“植物免疫”的概念逐渐形成并完善。目前充分利用植物自身免疫防御功能进行植物保护的绿色手段在抗病育种和病害综合防控中发挥了积极作用，具有广阔的前景。植物免疫诱抗剂(植物免疫激活剂)正是这类本身或其代谢产物没有直接的杀菌或抗病毒活性，或活性很低，但本身或其代谢产物能刺激植物的免疫防御***，进而促使植物自身产生对病原物的***获得抗病性的物质。与传统农药比较，植物免疫诱抗剂具有广谱、低毒、无抗药性风险和滞后及长持效期、与其他杀菌剂混用具有协同或者增效作用等特点，促进了植物保护回归到植物自身本质特点的利用上，是真正意义上的“绿色生态农药”。

由于植物免疫诱抗剂本身不具备农药活性，但又可诱导植物抗病、抗虫，在我国农药管理中，植物免疫诱抗剂能够以多种农药类别登记。如氨基寡糖素、香菇多糖等先后被登记为杀菌剂、植物抗性诱导剂、植物诱抗剂；S-诱抗素被登记为植物生长调节剂；同时，植物免疫诱抗剂可以与多种农药复配，如氨基寡糖素与噻唑膦复配登记为杀线虫剂，与戊唑醇、盐酸吗啉胍、春雷霉素、肟菌酯等复配登记为杀菌剂，与24-表芸苔素内酯、28-高芸苔素内酯复配登记为植物生长调节剂。

植物免疫诱诱导子还可以作为生物刺激素使用。生物刺激素是可改善作物营养和健康状况，提高农药和肥料利用率，刺激作物自然生理过程，可作用于植物、种子或土壤，提高作物抗逆能力，最终提高作物产量和改善品质的一系列有机化合物、无机化合物或微生物产品。生物刺激素产品可分为微生物制剂及其提取物、蛋白质水解产物、腐植酸、海藻及植物提取物、无机及合成产品。在我国市场上，销售量比较大的生物刺激素产品主要为腐植酸类、氨基酸类、海藻酸类产品及微生物发酵产物。

普鲁兰多糖是Aureobasidium属真菌分泌的胞外多糖，其中研究最多的为出芽短梗霉(A.pullulans)。出芽短梗霉是一种多形态真菌，有多核菌丝体、厚垣孢子和小型椭圆类酵母细胞等多种形态。出芽短梗霉能产出多种代谢产物，主要有胞外多糖、单细胞蛋白、酶和抗生素等。其中，普鲁兰多糖是出芽短梗霉发酵产生的主要胞外多糖。该多糖是由α-1,4糖苷键连接的麦芽三糖重复单位经α-1,6糖苷键聚合而成的直链状多糖，分子量2万～200万，也被称为普鲁兰、茁霉多糖、普鲁兰糖、短梗霉多糖、出芽短梗孢糖、出芽短梗霉多糖。该多糖有两个重要的特性：结构上富有弹性，溶解度比较大。普鲁兰多糖的成膜性、阻气性、可塑性、粘性均较强，并且具有易溶于水、无毒无害、无色无味等优良特性，已广泛应用于医药、食品、轻工、化工和石油等领域。2006年5月19日，国家***发布了第8号公告，普鲁兰多糖为新增四种食品添加剂产品之一，可在糖果、巧克力包衣、膜片、复合调味科和果蔬汁饮料中用作被膜剂和增稠剂。

发明内容

本发明利用生物活性测定、生理生化测试等方法明确了普鲁兰多糖的诱导植物抗病活性和诱导植物抗逆活性，并制备了以普鲁兰多糖为活性成分的生物源农药和生物刺激素，并在田间应用。

本发明公开了利用普鲁兰多糖制备植物诱抗剂并在农业生产中应用。其应用范围包含诱导植物抗病活性和诱导植物抗逆活性。本发明提供的植物诱抗剂可以诱导提高植物对真菌病害、细菌病害、线虫病害、害虫、病毒病害以及高温、低温、干旱逆境的抗性。

本发明公开了普鲁兰多糖用于制备植物诱抗剂的应用，所述的植物诱抗剂的应用范围包含诱导植物抗病或诱导植物抗逆。

具体包括：

普鲁兰多糖用于制备植物诱抗剂的应用，所述的植物诱抗剂的应用范围包含诱导植物抗病或诱导植物抗逆。

可选的，所述的普鲁兰多糖为α-1,4糖苷键连接的麦芽三糖重复单位经α-1,6糖苷键聚合而成的直链状多糖，分子量2～200万道尔顿；所述的植物抗病包含植物病毒病、植物细菌病和植物真菌病；所述的植物抗逆包含抗寒和抗旱。

一种植物诱抗剂，其包含普鲁兰多糖并加入助剂加工而成，制剂形态是可溶性粉剂、水分散粒剂、可溶性液剂、水乳剂和微乳剂及农业上可以接受的所有制剂类型；按质量百分比计，其中普鲁兰多糖的含量为1％～100％。

一种植物诱抗剂，其包含普鲁兰多糖并加入助剂加工而成，制剂形态是可溶性粉剂、水分散粒剂、可溶性液剂、水乳剂和微乳剂及农业上可以接受的所有制剂类型；按质量百分比计，其中普鲁兰多糖的含量为0.1％～80％。

一种植物诱抗剂，其包含普鲁兰多糖并加入助剂加工而成，制剂形态是可溶性粉剂、水分散粒剂、可溶性液剂、水乳剂和微乳剂及农业上可以接受的所有制剂类型；按质量百分比计，其中普鲁兰多糖的含量为30％。

一种农药组合物，所述组合物包含普鲁兰多糖和另一种或两种以上商品化农药的混合物，按质量百分比计，其中普鲁兰多糖的含量为0.1％～99％；所述商品化农药包括植物诱抗剂、杀真菌剂、杀细菌剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、杀螨剂及其组合。

一种生物刺激素，其包含普鲁兰多糖；按质量百分比计，普鲁兰多糖的含量为0.1％～100％。

一种抗植物病毒剂，其包含普鲁兰多糖；按质量百分比计，普鲁兰多糖的含量为0.1％～100％。

一种杀菌剂，其包含普鲁兰多糖；按质量百分比计，普鲁兰多糖的含量为0.1％～100％。

一种提高植物免疫能力并保护植物免受有害生物的侵害的方法，所述方法包括以下步骤：将本发明所述的产品施用于植物邻近的区域、适于支持植物生长的土壤、植物的根以及叶中的至少一种。

本发明所提及的诱导植物抗病活性本质为提升植物自身的抗病能力，为广谱的抗病活性，可用于增强植物对细菌性、真菌性、病毒、卵菌及线虫侵染的抗病能力。本发明所提及的诱导植物抗逆活性本质为诱发植物的抗逆潜能，可用于增强植物在受病虫害、杂草等生物因素以及温度、水分、盐碱、化学因素和天气等理化因素的胁迫时的抗旱、抗寒、抗盐分、抗病等能力。本发明所述的植物诱抗剂为农药的一种，也可称为植物免疫激活剂等，其没有直接杀菌活性，但可通过诱导植物产生抗病活性或抗逆活性达到控制和预防植物上真菌、细菌、病毒以及线虫、昆虫等有害生物侵袭，具有病原菌不易产生抗性、防治谱相对较广、可与化学药剂混用等优势，是一种符合绿色防控要求的农药。本发明所提及的生物刺激素，其既不是农药，更不是传统肥料。生物刺激素的靶标是农作物本身，它可以改善植物的生理生化状态，提高农药效果和肥料的利用率，改善农作物抵抗逆境的水平，也改善农作物的最终产量和农产品品质。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是普鲁兰多糖核磁共振氢谱；

图2是普鲁兰多糖核磁共振碳谱；

图3是烟草叶片喷施普鲁兰多糖后抗病相关基因表达量的变化。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明首次发现，普鲁兰多糖具有显著的诱导植物抗病活性，可以被开发为新型的生物源农药和生物刺激素。作为一种无毒无害、资源广泛的天然多糖，该发明对于对普鲁兰多糖农药活性的开发利用和植物病虫害的绿色防控具有重要的价值和意义。

本公开的化合物普鲁兰多糖可以发酵获得，优选的，可发酵成产普鲁兰多糖的微生物为出芽短梗霉。本发明的实施例中生物活性测定结果和生理生化实验结果证明，普鲁兰多糖具有诱导植物抗病和诱导植物抗逆。实施例1为普鲁兰多糖的分离纯化和结构鉴定。实例2证明普鲁兰多糖对烟草花叶病毒具有显著抗病毒作用，主要作用方式为保护；实例3证明普鲁兰多糖对烟草花叶病毒具有显著诱导抗病活性，局部使用普鲁兰多糖可以诱导烟草未施药部位产生抗病性；实例4证明普鲁兰多糖处理后使烟草体内抗病基因表达水平提高，说明普鲁兰多糖处理诱导乐烟草抗病性；实例5、6、7分别制备了含普鲁兰多糖的抗病毒剂、杀真菌剂，结果显示普鲁兰多糖对烟草花叶病毒、草莓灰霉病、黄瓜白粉病均具有良好预防保护效果，表明普鲁兰多糖对病毒病以及真菌性病害具备广谱性；叶绿素含量和叶片电导率是评价植物生长状态的重要指标，实例8、9利用普鲁兰多糖处理辣椒后，能显著提高辣椒叶片叶绿素含量，并使叶片电导率下降；实施例10证明普鲁兰多糖可诱导辣椒抗低温胁迫。实例8、9、10说明普鲁兰多糖具有诱导植物抗逆活性和生物刺激作用。本领域技术人员将理解，生物活性测定结果和生理生化实验结果确立了普鲁兰多糖作为诱抗剂、杀菌剂和生物刺激素的一般效用。

本公开的普鲁兰多糖可以通过多种已知技术中的任一种，作为包含所述普鲁兰多糖的配制品来施用。例如，例如，可以在不损害植物的商业价值的情况下将化合物施用于植物的根或叶以诱导植物抗性或促进植物生长。可以以任何通常使用的配制品类型的形式来施用普鲁兰多糖，例如作为溶液、粉剂、悬浮液、可湿性粉剂、可溶性液剂、可流动浓缩物或可乳化浓缩物，具体包括但不局限于：种子处理乳剂、水乳剂、大粒剂、微乳剂、水溶性乳剂、可溶性乳剂、水分散性粒剂、毒谷、气雾剂、块状毒饵、缓释块、浓毒饵、胶囊粒剂、微胶囊悬浮剂、干拌种粉剂、乳油、静电喷雾剂、油包水乳剂、水包油乳剂、烟雾罐、细粒剂、烟雾烛、烟雾筒、烟雾棒、种子处理悬浮剂、烟雾片、烟雾丸、粒状毒饵、热雾剂、药漆、微粒剂、油悬剂、油分散性粉剂、片状毒饵、浓胶剂、泼浇剂、种衣剂、涂抹剂、悬浮乳剂、成膜油剂、可溶性粉剂、种子处理水溶性粉剂、超低容量悬浮剂、追踪粉剂、超低容量液剂、湿拌种水分散性粉剂中的任意一种。

优选地，本公开的普鲁兰多糖以配制品的形式施用，所述配制品包含普鲁兰多糖与植物学上可接受的载体。浓缩的配制品可以分散在水或其它液体中以用于施用，或者配制体可以是尘装或颗粒状。可以根据农业化学领域中常规的程序来制备配制品。本公开设想了可以通过其来配制包含普鲁兰多糖用于递送并用作诱抗剂的所有媒介物，包括所有植物学上可以接受的惰性载体、表面活性剂、乳化剂、有机溶剂或水等。

所述配制品可以任选的包括含有其它杀有害生物或其它具有诱抗活性化合物的组合。此类另外的杀有害生物化合物或其它具有诱抗活性化合物可以是在选择用于施用的介质中与普鲁兰多糖相容并不拮抗的杀真菌剂、杀虫剂、除草剂、杀线虫剂、杀螨剂、杀节肢动物剂、杀细菌剂、植物诱抗剂或其组合。因此，在这样的实施例中，另一种杀有害生物化合物或诱抗活性化合物被用作补充药剂。组合中普鲁兰多糖和另一种化合物通常可以以1：100至100：1的重量比存在。

本发明另一个实施例是利用普鲁兰多糖制备生物刺激素及其农业生产中应用。其本质也在于利用普鲁兰多糖的诱抗活性。

本发明的另一个实施例是施用普鲁兰多糖用于提高植物免疫能力并保护植物免受有害生物的侵染的方法，包括将普鲁兰多糖施用于植物、植物邻近的区域、适于支持植物的生长的土壤、植物的根、以及叶中的至少一种。

为了更好的理解发明的实质，下面用实施例来详细说明发明的技术内容，但发明并不局限于这些实施例。

实施例1：普鲁兰多糖的分离与结构鉴定

将10.0g普鲁兰多糖粗品稀释成2％的水溶液500mL，加入250mL氯仿/丁醇混合液(体积比4:1)，充分振荡使蛋白质析出，以4 000r/min离心30min，除去沉淀，得到脱去蛋白的上清液。上清液透析3d后，将其减压浓缩至200mL左右，加入2倍体积无水乙醇，充分搅拌，放置过夜，沉淀液以8000r/min离心30min，将沉淀用丙酮、***依次洗涤后干燥，得粗普鲁兰多糖粉末7.2g。将除蛋白的普鲁兰多糖粉末溶于30mL蒸馏水中，进行DEAE-纤维素柱层析，洗脱速度为1mL/min。用蒸馏水洗脱，分部收集(每管5mL)，用改良的苯酚-硫酸法比色鉴定多糖部分，收集多糖峰，减压浓缩、透析、冷冻干燥得粗普鲁兰多糖5.6g。粗普鲁兰多糖进一步进行Sephadex G-100柱层析，用蒸馏水进行洗脱，洗脱速度为4mL/h，用改良的苯酚-硫酸法比色鉴定多糖部分，收集洗脱峰后分别冷冻干燥得白色粉末4.7g，总收率47.0％。经核磁共振氢谱(附图1)和碳谱(附图2)鉴定，所得白色粉末为普鲁兰多糖纯品。

实施例2：普鲁兰多糖抗TMV活性测定

(1)保护活性

配制浓度为0.02mg/mL、0.1mg/mL和0.5mg/mL普鲁兰多糖溶液，选取长势一致、健康的5～6叶期心叶烟，在喷洒药剂48h后接种稀释2000倍的TMV溶液，空白对照为清水处理，阳性对照为0.1mg/mL的壳寡糖。每个处理接种3片叶子，重复3次，3d后统计枯斑数，计算抑制率。

(2)离体钝化活性

配制浓度为0.02mg/mL、0.1mg/mL和0.5mg/mL普鲁兰多糖溶液，与稀释1000倍的TMV溶液等体积混合。室温放置1h后接种于长势一致、健康的5～6叶期心叶烟。空白对照为清水处理，阳性对照为0.1mg/mL的壳寡糖。每个处理接种3片叶子，重复3次，3d后统计枯斑数，计算抑制率。

(3)治疗活性

配制备浓度为0.02mg/mL、0.1mg/mL和0.5mg/mL普鲁兰多糖溶液，选取长势一致、健康的5～6叶期心叶烟，在接种稀释2000倍的TMV溶液48h后喷洒药剂处理。空白对照为清水处理，阳性对照为0.1mg/mL的壳寡糖。每个处理接种3片叶子，重复3次，3d后统计枯斑数，计算抑制率。

抑制率(％)＝(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数×100

结果见表1。

表1：普鲁兰多糖对TMV的保护、钝化和治疗效果

注：数据为平均值±标准误，3种活性之间的显著性差异通过SPSS软件中Duncan多重范围检验(DMRT)，不同的字母表示数据之间在0.05水平上存在显著差异性。

由表1可知，普鲁兰多糖对TMV侵染植物具有良好的保护作用，说明提前施药可以使烟草具有一定的抗病效果。而普鲁兰多糖对TMV的钝化作用一般，说明普鲁兰多糖没有对TMV粒体造成直接损害或者损伤效果较弱，不及提前施药引起的抗病作用。

实施例3：普鲁兰多糖诱导烟草抗TMV活性测定

选取心叶烟进行诱导抗病活性测试，心叶烟可以形成病毒枯斑，普通烟上的症状是花叶，不同的症状用不同的方法统计抗病情况。将0.02mg/mL、0.1mg/mL和0.5mg/mL普鲁兰多糖喷洒到长势一致的6～7叶期的烟草下部三片叶片。在48h后接种TMV至未喷药的上部叶片。空白对照为清水处理，阳性对照为壳寡糖溶液。每株接种2～3个叶片，每个处理包括10株烟草，整个试验重复3次。3d后统计心叶烟枯斑数的病情指数，计算抑制率公式如上，计算防治效果公式如下。

病情指数＝∑(病级数×病株数)/(最高病级×各处理总株数)×100；

防治效果＝(对照病指—处理病指)/对照病指×100％；

结果见表2。

表2：普鲁兰多糖对TMV的诱导抗病效果

注：数据为平均值±标准误，3种活性之间的显著性差异通过SPSS软件中Duncan多重范围检验(DMRT)，不同的字母表示数据之间在0.05水平上存在显著差异性。

由表2可知，在心叶烟上，普鲁兰多糖展示了显著的诱导植物抵抗TMV的效果，说明局部使用普鲁兰多糖可以诱导烟草未施药部位产生抗病性。

实施例4：普鲁兰多糖引起烟草抗病相关基于表达量的变化

将4～6叶期烟草喷洒普鲁兰多糖水溶液，并在处理后1天采集样品。用液氮法提取烟草的总RNA，并通过实时荧光定量PCR，测定抗病相关基因NPR1，PR1和PR2基因的表达量变化。

结果如附图3所示，不同浓度的普鲁兰多糖均可以引起抗病相关基因PR蛋白的转录水平发生明显变化。在500mg/mL浓度下，NPR1，PR1，PR2的表达量相对于对照组分别增加了7.64，5.81，8.39倍。说明普鲁兰多糖诱导烟草体内发生了抗病防御行为。

实施例5：普鲁兰多糖制剂对烟草花叶病毒的田间小区防效

小区试验为随机排列，重复3次，小区面积等于60㎡，试验地选择要求肥力均匀、作物种植和管理水平一致，各处理间及试验区周围要设保护行。叶面常量喷雾，以阿泰灵500倍液为对照药剂进行叶面常量喷雾作为阳性药剂对照，并设清水对照。所有供试药剂必须进行二次稀释。自心叶烟4～5叶期喷药，后每隔4d喷1次，共3次。最后一次喷药2d后取顶部整叶摩擦接种TMV，每株接种3叶，每处理10株，重复三次，接病毒10d后调查各处理病情指数，计算防效。

病害分级标准按照中华人民共和国烟草行业标准一烟草花叶病毒严重度分级调查方法(YC/T 39—1996)：

0级：全株无病；

1级：心叶脉明或轻微花叶，或者上部1/3叶片花叶但不变形，植株无明显矮化；

2级：1/3至1/2叶片花叶，或者少数叶片变形；或者主脉变黑，植株矮化正常株高的2/3以上；

3级：1/2至2/3花时，或者变形或主侧脉变黑，植株矮化为正常株高1/2至2/3；

4级：全株叶片花叶，严重畸形或坏死，病株矮化为正常植株高度l/3至1/2。为细化调查结果，在以上严重度的分级基础上，对分级标准进行细化，在1、2级之间增加l+级，在2、3级之间加2+级，在3、4加之间增加3+级，级别记为1.5、2.5、3.5：

1+级：心叶脉明或轻微花叶，或上部1/3叶片花叶至轻微皱缩，植株无明显矮缩化；

2+级：l/3至1/2叶片花叶、叶片变形，或主脉变黑，植株矮化为正常植株的2/3以上；

3+级：1/2至2/3叶片花叶、或变形或主侧脉坏死，或植株矮化为正常株高的1/2。

根据严重度计算病情指数，以防治效果为衡量不同处理的效果。

病情指数＝∑[(感病植株数×严重度分级代表值)/(总调查株数×严重度最高级代表值)]×100％

防效％＝((对照平均病情指数-处理平均病情指数)/对照平均病情指数)×100％

结果见表3。

表3：普鲁兰多糖制剂防治烟草病毒病田间小区药效试验

供试药剂	稀释倍数/倍	防效(％)
			普鲁兰多糖可溶性液剂(30％含量)	200	66.06
普鲁兰多糖可溶性液剂(1％含量)	200	38.88
			普鲁兰多糖可溶性液剂(80％含量)	200	76.15
清水对照	-	0

从上表可知，普鲁兰多糖制剂对烟草花叶病毒具有良好的防控效果。

实施例6：普鲁兰多糖制剂对草莓灰霉病的田间小区药效试验

选取大棚草莓进行小区试验。大棚试验地一般肥力均匀，种植水平一致，病情发生及危害程度比较均匀，便于控制管理。各处理间及试验区周围要设保护行，小区面60㎡，试验重复3次。用液量为10kg/60m²。以清水和阿泰灵500倍液分别为阴性和阳性对照进行叶面喷雾。所有供试药剂必须进行二次稀释。自草莓长至2月龄期，封棚后第1天开始喷药，后每隔5d喷1次，共3次。最后一次喷药后15d调查病叶发病率和统计病情指数，计算防效。病情分级标准如下：

0级：无病斑；

1级：病斑面积5％以下；

3级：病斑面积6％～10％；

5级：病斑面积11％～20％；

7级：病斑面积21％～50％；

9级：病斑面积50％以上。

病情指数及防治效果用以下公式计算。

病情指数＝∑[(每级病叶数×相对级数)/(总调查株数×9)]×100％

防效％＝[(对照平均病情指数-处理平均病情指数)/对照平均病情指数]×100％

结果见表4。

表4：普鲁兰多糖制剂及含普鲁兰多糖的精油和提取物的制剂防治草莓灰霉病田间药效试验

供试药剂	稀释倍数/倍	防效(％)
			普鲁兰多糖可溶性液剂(30％含量)	200	58.02
普鲁兰多糖可溶性液剂(1％含量)	200	22.3
			普鲁兰多糖可溶性液剂(80％含量)	200	75.9
清水对照	-	0

从上表可知，普鲁兰多糖制剂对草莓灰霉病具有良好的预防保护效果。

实施例7：普鲁兰多糖制剂对黄瓜白粉病的田间小区药效试验

小区试验为随机排列，重复3次，小区面积等于60㎡，试验地选择要求肥力均匀、作物种植和管理水平一致，各处理间及试验区周围要设保护行。叶面常量喷雾，以清水和阿泰灵500倍液分别为阴性和阳性对照进行叶面喷雾。所有供试药剂必须进行二次稀释。黄瓜定植后5～6片真叶时喷药，喷液量以均匀喷湿叶面，药液开始下滴为止。每隔7d喷1次，共3次。最后一次喷药15d后调查病情指数，计算防效。每小区随机取5点调查，每点调查5株，，每株按上、中、下部分别调查5片叶片。病情分级标准如下：

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；

3级：病斑面积占整个叶面积的6％～10％；

5级：病斑面积占整个叶面积的11％～25％；

7级：病斑面积占整个叶面积的26％～50％；

9级：病斑面积占整个叶面积的50％以上。

病情指数＝∑[(每级病叶数×相对级数)/(总调查株数×9)]×100％

防效％＝((对照平均病情指数-处理平均病情指数)/对照平均病情指数)×100％

结果见表5。

表5：普鲁兰多糖制剂防治黄瓜白粉的田间防效

供试药剂	稀释倍数/倍	防效(％)
			普鲁兰多糖可溶性液剂(30％含量)	200	44.1
普鲁兰多糖可溶性液剂(1％含量)	200	18.16
			普鲁兰多糖可溶性液剂(80％含量)	200	63.62
清水对照	-	0

从上表可知，普鲁兰多糖制剂对黄瓜白粉病具有良好的预防效果。

实施例8：普鲁兰多糖处理对辣椒叶绿素含量的影响

每小区随机挑选生长势一致的10株辣椒，摘取上部的功能叶片用于测定，每处理重复三次。取新鲜擦净的辣椒叶片，去掉中脉剪碎并混匀用于测定。根据公式计算出辣椒叶片的叶绿素a、b的浓度，换算成叶片中总叶绿素质量。

C_a+b＝C_a+C_b＝8.05OD₆₆₃+20.29OD₆₄₅

结果见表6。

表6：普鲁兰多糖处理对叶绿素含量的影响

从上表可知，不同浓度的普鲁兰多糖处理对叶绿素含量有一定的影响，其中，0.02mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL的普鲁兰多糖处理下叶绿素含量较空白对照分别提高了7.05％、16.4％和22.82％。可见，普鲁兰多糖处理可显著提高辣椒叶片中叶绿素含量，从而促进植物的生长。

实施例9：普鲁兰多糖对辣椒细胞膜相对透性影响的测定

通过测定叶片细胞膜通透性，来间接反映药剂处理后植株的抗逆活性。将叶片清洗干净，打孔器打孔。称取0.3g打孔叶片放入干净100mL烧杯中，用去离子水80mL淋洗3次后，加入去离子水50mL，静置3h，用电导仪测定电导率。测定后沸水浴15min，冷却后立即测定其电导率。计算如下：电导率(％)＝(处理电导率/煮沸电导率)×100

结果见表7。

表7：普鲁兰多糖处理对辣椒叶片电导率的影响

由上述可知，普鲁兰多糖处理后的叶片电导率随浓度的升高有所下降，使植株对环境的适应能力随之提高。

实施例10：普鲁兰多糖对辣椒抗低温胁迫的影响

辣椒种子用5％次氯酸钠溶液消毒后在清水中浸泡24h，之后用纱布包住放置在培养箱中(30℃黑暗恒温)催芽，每隔8h再以无菌水反复淘洗。待种子露白后，单粒播种在育苗穴盘(32孔)中，并放于温室(RH＝70％-80％，T＝25±5℃)继续培养。当辣椒幼苗长至5-6片真叶时，选取生长一致的幼苗进行试验。在人工气候培养箱内和固定培养条件下(RH＝60％-70％；L：D＝16h/8h，光照强度：4000lxs)设置不同低温处理中度低温胁迫：12.5℃(16h L)/7.5℃(8h D)。辣椒置于低温胁迫环境后每隔5天施药1次，施药浓度为0.5mg/mL，在15d后测定形态指标，并按以下公式计算壮苗指数：壮苗指数＝(茎粗/株高+根干质量/地上部干质量)×全株干质量。以清水对照作为空白组，每个处理9个重复。

表8普鲁兰多糖(0.5mg/mL)处理诱导辣椒抗低温胁迫

处理	株高(cm)	茎粗(mm)	根冠比	壮苗指数
					处理组	12.37±0.12	2.28±0.03	0.23±0.01	0.38±0.02
普鲁兰多糖	12.98±0.17	2.34±0.01	0.24±0.02	0.45±0.02

由表8可见，在低温胁迫条件下，普鲁兰多糖处理的辣椒生长状况优于空白对照，表明普鲁兰多糖具有诱导辣椒抗低温胁迫活性。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (1)

1.普鲁兰多糖用于制备植物诱抗剂的应用，所述的植物诱抗剂的应用范围为诱导烟草抗烟草花叶病毒病；

所述的普鲁兰多糖为α-1,4糖苷键连接的麦芽三糖重复单位经α-1,6糖苷键聚合而成的直链状多糖，分子量2～200万道尔顿；

所述的普鲁兰多糖的含量为0.02 ～0.5mg/mL。