CN106942301A - 一种防控水稻稻瘟病的植物源农药制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种防控水稻稻瘟病的植物源农药制剂及其制备方法。本发明所述植物源农药制剂由抗稻瘟病菌的放线菌的孢子悬浮液和所述中药提取液组成。所述中药提取液为黄连、知母、牡丹皮、川桂皮、前胡、猫爪草、刺五加混合后的提取物。本发明提供了一种可增强抗稻瘟病菌的放线菌防效的中药提取液，其和抗稻瘟病菌的放线菌相配合协同防控稻瘟病菌，不仅弥补了拮抗放线菌防效上的不足，而且避免使用化学农药，依然保证了对环境友好，无毒副作用，相比放线菌更加不易使病原菌产生抗药性。

Description

一种防控水稻稻瘟病的植物源农药制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体的说是涉及一种防控水稻稻瘟病的植物源农药制剂及其制备方法。
背景技术
水稻稻瘟病(Blast Fungus)是全世界稻区危害最严重的水稻病害之一，又名稻热病，俗称火烧瘟、吊头瘟、掐颈瘟等。该病一年四季均可对水稻造成危害，其危害遍及水稻的各个部位，有苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等。一般造成水稻减产10％～20％。以我国为例，20世纪90年代以来，该病的年发生面积均在380万公顷hm2以上，年损失稻谷达数亿公斤。
目前,化学农药是防治稻瘟病的一种主要措施，但是大量和长期使用化学农药，既增加生产成本，也易导致病原菌产生抗药性而降低防治效果，同时造成环境污染和破坏生态平衡，给人类健康及环境安全带来严重隐患。而由于稻瘟病病原菌遗传复杂、致病多样和极易变异等特点，新培育的抗病品种需辛苦培育，且常在推广数年内失去抗性，降低了该方法控制稻瘟病的效果。为此，发展安全、无毒副作用、不污染环境、不易使病原菌产生抗药性的微生物农药至关重要。
内生菌是一种能够在植物体内存活而不对寄主植物具有明显危害的微生物，且由于田间操作、气候变化等因素对其生长、繁殖和防治效果的影响较小，是一种天然的微生物活体农药。目前所分离得到的抗病性内生菌大多是易培养的细菌和真菌类群，而作为难分离的内生放线菌则报道较少。放线菌又是抗生素的主要来源，目前已经发现的抗生素有近6000种，其中4000多种由放线菌产生。作为一类能产生多种有益代谢产物的微生物，放线菌显然具有很高的经济价值。
中国专利CN104195064A公开了一种体外高效拮抗稻瘟病菌的水稻内生放线菌，其从籼稻谷梅4号中筛选获得一株水稻内生放线菌，其能够对至少5种不同生理小种的梨孢霉菌(稻瘟病的致病真菌)有拮抗作用；中国专利CN105567596A公开了一种放线菌及其应用，其公开了一种富阳链霉菌，通过平板对峙试验检测出该菌株对稻瘟病菌的抑制率为48.6％；文献《稻瘟病生防放线菌A11菌株的发酵条件研究》(张宇等，中国农学通报，第21卷第5期，2005年5月)也公开了放线菌A11对稻瘟病菌的拮抗能力，在特定条件下抑菌率平均达到57.4％。
以抗稻瘟病菌的放线菌活体作为农药制剂，虽然能以其更安全的生物代谢物避免化学农药产生的隐患，还可以利用不同放线菌与病原菌之间的拮抗对应关系，减少稻瘟病病菌多样、易变异带来的影响，但是筛选出来的放线菌本身能力高低不一，且单一使用仍有所欠缺，在防效上还需要进一步加强。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于防控水稻稻瘟病植物源农药制剂的中药提取液，使得所述中药提取液能够显著提高植物源农药制剂中抗稻瘟病菌的放线菌对稻瘟病菌的抑制率；
本发明的另一个目的在于提供一种防控水稻稻瘟病的植物源农药制剂及其制备方法，使得所述植物源农药制剂对稻瘟病菌具有较佳的抑制率，可应用于稻瘟病的防治上。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于防控水稻稻瘟病植物源农药制剂的中药提取液，为黄连、知母、牡丹皮、川桂皮、前胡、猫爪草、刺五加混合后的提取物。
针对现有水稻内生放线菌单独使用在稻瘟病防治效果上不足的缺陷，本发明在内生放线菌基础上添加了多种中药提取物，各组分通过协同作用提高了对稻瘟病菌的抑制作用。
作为优选，所述黄连、知母、牡丹皮、川桂皮、前胡、猫爪草、刺五加的重量比为1:1:1:1:1:1:1。
作为优选，所述提取物为乙醇提取物。进一步优选地，所述中药提取液由以下方法制备获得：
分别取各中草药20g粉碎，混合，加入95％的乙醇100ml，室温下浸泡48h，3层纱布过滤，滤液4000r/min离心15min，取上清液，40℃下旋转蒸发至干，残余物溶于20ml 50％乙醇中，获得所述中药提取液。
将本发明所述中药提取液与抗稻瘟病菌的放线菌的孢子悬浮液配合使用后，其所表现出的对稻瘟病菌的抑制率和防效，均显著高于单独使用抗稻瘟病菌的放线菌的孢子悬浮液的效果。因此，本发明提供了所述中药提取液在防治稻瘟病和/或在制备防治稻瘟病的生防制剂中的应用。
同时，本发明根据应用提供了一种防控稻瘟病的植物源农药制剂，由抗稻瘟病菌的放线菌的孢子悬浮液和所述中药提取液组成。其中，所述放线菌为水稻拮抗放线菌CZ1367，保藏编号为CCTCC No：M2016277，于2016年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心。优选地，所述孢子悬浮液中放线菌的浓度为108个/mL。
作为优选，所述放线菌的孢子悬浮液由以下方法制备获得：
步骤1、将放线菌接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH值7.2，于28℃下培养7天，获得试管种；
步骤2、先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为酵母膏4g，葡萄糖4g，麦芽膏10g，琼脂20g，水1000mL，pH值7.2；在每个三角瓶中装入100mL液体培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2所述试管种，28℃下于转速为200r/min震荡培养7天，获得种子液；
步骤3、先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为大豆粉20g，蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，NaCl 2g，CaCO3 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 0.5g，水1000mL，pH值7.0；在每个500ml三角瓶中装入100mL液体发酵培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入10mL步骤2中得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养6天得发酵液，在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡8小时后，用转速为3000rpm的离心机离心10分钟，取上清液并在旋转蒸发仪上50℃蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，获得所述孢子悬浮液。
本发明所述植物源农药制剂对稻瘟病菌多个生理小种，如62、RB3、131、稻农具有较高的抑制率，同时在盆栽试验和大田试验中具有较高防效和增产率。基于此，本发明也提供了所述植物源农药制剂在防治稻瘟病以及在制备防治稻瘟病农药制剂中的应用。
此外，本发明提供了所述植物源农药制剂的制备方法，包括：步骤1、制备放线菌的孢子悬浮液，以及制备黄连、知母、牡丹皮、川桂皮、前胡、猫爪草、刺五加混合后的中药提取液；
步骤2、调整步骤1制备的孢子悬浮液放线菌浓度，和中药提取液混合，获得所述植物源农药制剂。
具体地，步骤1可按如下步骤进行：
步骤1.1、将放线菌接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH值7.2，于28℃下培养7天，获得试管种；
步骤1.2、先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为酵母膏4g，葡萄糖4g，麦芽膏10g，琼脂20g，水1000mL，pH值7.2；在每个三角瓶中装入100mL液体培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2所述试管种，28℃下于转速为200r/min震荡培养7天，获得种子液；
步骤1.3、先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为大豆粉20g，蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，NaCl 2g，CaCO3 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 0.5g，水1000mL，pH值7.0；在每个500ml三角瓶中装入100mL液体发酵培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入10mL步骤2中得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养6天得发酵液，在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡8小时后，用转速为3000rpm的离心机离心10分钟，取上清液并在旋转蒸发仪上50℃蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，获得所述孢子悬浮液，备用；
步骤1.4、分别取各中草药20g粉碎，混合，加入95％的乙醇100ml，室温下浸泡48h，3层纱布过滤，滤液4000r/min离心15min，取上清液，40℃下旋转蒸发至干，残余物溶于20ml50％乙醇中，获得所述中药提取液。其中，步骤1.4与步骤1.1-1.3属于并列关系。
由以上技术方案可知，本发明提供了一种可增强抗稻瘟病菌的放线菌防效的中药提取液，其和抗稻瘟病菌的放线菌相配合协同防控稻瘟病菌，不仅弥补了拮抗放线菌防效上的不足，而且避免使用化学农药，依然保证了对环境友好，无毒副作用，相比放线菌更加不易使病原菌产生抗药性。
生物材料保藏信息说明
CZ1367，分类命名：放线菌CZ1367，Actinomyces sp.CZ1367，于2016年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC No：M2016277。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种防控水稻稻瘟病的植物源农药制剂及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述产品及其制备方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品、方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种防控水稻稻瘟病的植物源农药制剂及其制备方法做进一步说明。
实施例1：制备本发明所述中药提取液
分别取黄连、知母、牡丹皮、川桂皮、前胡、猫爪草、刺五加各20g粉碎，混合，加入95％的乙醇100ml，室温下浸泡48h，3层纱布过滤，滤液4000r/min离心15min，取上清液，40℃下旋转蒸发至干，残余物溶于20ml 50％乙醇中，获得所述中药提取液。
实施例2：制备本发明植物源农药制剂
1、制备抗稻瘟病菌的放线菌的孢子混悬液
步骤1、将放线菌接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH值7.2，于28℃下培养7天，获得试管种；
步骤2、先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为酵母膏4g，葡萄糖4g，麦芽膏10g，琼脂20g，水1000mL，pH值7.2；在每个三角瓶中装入100mL液体培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2所述试管种，28℃下于转速为200r/min震荡培养7天，获得种子液；
步骤3、先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为大豆粉20g，蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，NaCl 2g，CaCO3 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 0.5g，水1000mL，pH值7.0；在每个500ml三角瓶中装入100mL液体发酵培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入10mL步骤2中得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养6天得发酵液，在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡8小时后，用转速为3000rpm的离心机离心10分钟，取上清液并在旋转蒸发仪上50℃蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，获得所述孢子悬浮液。
2、植物源农药制剂的制备
调整1中的孢子悬浮液中放线菌的浓度为108个/mL，与实施例1获得的中药提取液混合，即为本发明所述植物源农药制剂。
实施例3：平板拮抗抑菌试验
处理1：采用平板对峙法，在直径为90mm的PDA培养基平板上，距离培养皿中心30mm的位置上接种活化好的放线菌，再在培养皿中心位置接种稻瘟病菌。封口膜封好培养皿，在霉菌培养箱中28℃条件下倒置培养7天以上，每个处理重复3次，以不接放线菌为CK对照，7d后观察实验结果。测量真菌菌落直径并计算真菌菌丝生长抑制率。
处理2：将中药提取液配制成50mg/ml的带药培养基，除了培养基不同外，其余步骤与处理1相同。
抑制率按照下式计算：
菌丝生长抑制率％＝(CK菌落平均直径-处理菌落平均直径)/CK菌落平均直径×100％
结果见表1。
表1不同处理对稻瘟病不同生理小种的抑菌率
由表1可以看出，水稻拮抗放线菌CZ1367与中药提取液配合使用后，对各稻瘟病生理小种抑菌率得到了显著提升。
实施例4：盆栽试验
1.种子处理：
水稻种子进行表面消毒处理：用75％的酒精处理15s后无菌水水洗三次，5％的次氯酸钠溶液处理15min后无菌水水洗三次。表面消毒的水稻种子浸泡于浓度为≥108个/mlCZ1367孢子液(和实施例2植物源农药制剂)30min后，保湿催芽后播种育秧苗。
2.病原菌的接种和CZ1367菌剂的施用
用塑料小桶装水稻田间土壤(土壤先灭菌，加点蛭石，蛭石：土壤＝1∶3，疏通土壤)，每桶移栽3穴，每穴5棵秧苗。水稻植株长至分蘖期时接种病原菌。以稻瘟病菌生理小种RB3为病原菌)，苗期接种：将病菌诱导产孢后，在2-3叶期的水稻苗上喷施稻瘟病孢子悬浮液106个/ml接种，以叶片挂满水滴，不滴落为标准，25℃，95％以上湿度处理一天，然后28℃培养。
3.试验设计
处理1:清水对照。
处理2:CZ1367，接种稻瘟病菌孢子后，至清水对照组开始发病时第一次喷施CZ1367孢子悬浮液108个/ml，以叶片挂满水滴，不滴落为标准，此后每隔7-10天喷施一次，喷施2-3次。
处理3：CZ1367+中药提取液，除了喷施实施例2中的植物源农药制剂不同外，其余同处理2，喷施浓度108个/ml。
处理4:75％三环唑可湿性粉剂(江苏丰登农化有限公司生产)，除了喷施75％三环唑可湿性粉剂外，其余同处理2，喷施浓度为1g/L。
3.统计结果
叶瘟病情指数＝∑(病级叶数×代表数值)/总叶数/发病最重级代表数值
叶瘟防效＝(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数
4.试验结果
水稻抽穗期，调查防效，结果见表2。
表2防治稻瘟病的盆栽试验结果
由表2可知，处理1的CZ1367在温室试验中对水稻稻瘟病防效达80.49％,与对照三环唑的防效相当，而处理2的植物源农药制剂防效要显著高于处理1的CZ1367。
实施例5：大田小区试验
田间试验选择在稻瘟病连年发生较重的湖南省浏阳市大围山和湖南省桂东县水稻田中。共设4个处理：A：CZ1367 108个/ml孢子液500ml/亩，兑水30L喷雾；B：实施例2植物源农药制剂500ml/亩，兑水30L喷雾；C：70％三环唑(WP)30g/亩，兑水30L喷雾；D：清水对照。每处理4次重复，每小区面积30m2，各处理随机区组排列。小区之间以保护行隔离，试验田按常规进行肥水管理。播种前浸种处理，防治叶瘟在发病初期进行，第一次施药后7天，再施药1次，采用背负式喷雾器喷雾。
病情调查参照农药田间药效试验准则(一)(GB/T17980.19-2000)，施药前调查发病基数，对叶瘟的防效调查于第2次施药后8～10d进行，对穗颈瘟的防效调查则于穗颈瘟病情发展稳定后调查1次。每小区对角线五点取样，每点调查5丛，共25丛，调查叶片(穗)的发病程度，计算病情指数和防效。调查分级标准与全国稻瘟病药效试验所用标准相同。收获时测产。结果见表3和表4。
分级标准：
叶瘟(以叶片为单位)
0级：无病；
1级：叶片病斑少于5个，长度<1cm侧
3级：叶片病斑6-10个，部分病斑长度>1cm；
5级：叶片病斑11-25个，部分病斑连成片，占叶面积10％-25％；
7级：叶片病斑26个以上，病斑连成片，占叶面积26％-50％；
9级：病斑连成片，占叶面积50％以上或全叶枯死。
穗瘟(以穗为单位)
0级：无病；
1级：每穗损失5％以下(个别枝梗发病)；
3级：每穗损失6％-20％(1/3左右枝梗发病)；
5级：每穗损失21％-50％(穗颈或主轴发病，谷粒半瘪)；
7级：每穗损失51％-70％(穗颈发病，大部瘪谷)；
9级：每穗损失71％-100％(穗颈发病，造成白穗)。
药效计算方法：
CK0—喷药前不施药对照区的病指；
CK1—喷药后不施药对照区的病指；
pt0—喷药前处理区的病指；
pt1—喷药后处理区的病指。
表3防治稻瘟病的大田小区试验结果(浏阳市)
表4防治稻瘟病的大田小区试验结果(桂东县)
注：表3和表4中数字都是四次重复平均值。
由表3和表4试验结果可知，CZ1367对水稻稻瘟病有较好的效果，在湖南省浏阳市大围山和湖南省桂东县的叶瘟防效分别为81.65％和71.04％，穗瘟防效分别为76.99％、85.37％，增产率分别为7.36％、8.37％，与对照75％三环唑可湿性粉剂的防效相当；
而植物源农药制剂在湖南省浏阳市大围山和湖南省桂东县的叶瘟防效分别为89.95％和82.32％，穗瘟防效分别为87.73％、92.15％，增产率分别为13.23％、12.60％，效果均显著好于CZ1367。
以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于防控水稻稻瘟病植物源农药制剂的中药提取液，其特征在于，为黄连、知母、牡丹皮、川桂皮、前胡、猫爪草、刺五加混合后的提取物。
2.根据权利要求1所述中药提取液，其特征在于，所述黄连、知母、牡丹皮、川桂皮、前胡、猫爪草、刺五加的重量比为1:1:1:1:1:1:1。
3.根据权利要求1所述中药提取液，其特征在于，所述中药提取液由以下方法制备获得：
分别取各中草药20g粉碎，混合，加入95％的乙醇100ml，室温下浸泡48h，3层纱布过滤，滤液4000r/min离心15min，取上清液，40℃下旋转蒸发至干，残余物溶于20ml50％乙醇中，获得所述中药提取液。
4.权利要求1-3任意一项所述中药提取液在防治稻瘟病和/或在制备防治稻瘟病的生防制剂中的应用。
5.一种防控水稻稻瘟病的植物源农药制剂，其特征在于，由抗稻瘟病菌的放线菌的孢子悬浮液和权利要求1-4任意一项所述中药提取液组成。
6.根据权利要求5所述植物源农药制剂，其特征在于，所述放线菌为水稻拮抗放线菌CZ1367，保藏编号为CCTCC No：M2016277。
7.根据权利要求5所述植物源农药制剂，其特征在于，所述放线菌的孢子悬浮液由以下方法制备获得：
步骤1、将放线菌接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH值7.2，于28℃下培养7天，获得试管种；
步骤2、先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为酵母膏4g，葡萄糖4g，麦芽膏10g，琼脂20g，水1000mL，pH值7.2；在每个三角瓶中装入100mL液体培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2所述试管种，28℃下于转速为200r/min震荡培养7天，获得种子液；
步骤3、先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为大豆粉20g，蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，NaCl2g，CaCO3 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 0.5g，水1000mL，pH值7.0；在每个500ml三角瓶中装入100mL液体发酵培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入10mL步骤2中得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养6天得发酵液，在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡8小时后，用转速为3000rpm的离心机离心10分钟，取上清液并在旋转蒸发仪上50℃蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，获得所述孢子悬浮液。
8.权利要求5-7任意一项所述植物源农药制剂在防治稻瘟病以及在制备防治稻瘟病农药制剂中的应用。
9.权利要求5所述植物源农药制剂的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1、制备放线菌的孢子悬浮液，以及制备黄连、知母、牡丹皮、川桂皮、前胡、猫爪草、刺五加混合后的中药提取液；
步骤2、调整步骤1制备的孢子悬浮液放线菌浓度，和中药提取液混合，获得所述植物源农药制剂。
10.根据权利要求9所述制备方法，其特征在于，步骤1为：
步骤1.1、将放线菌接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH值7.2，于28℃下培养7天，获得试管种；
步骤1.2、先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为酵母膏4g，葡萄糖4g，麦芽膏10g，琼脂20g，水1000mL，pH值7.2；在每个三角瓶中装入100mL液体培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2所述试管种，28℃下于转速为200r/min震荡培养7天，获得种子液；
步骤1.3、先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为大豆粉20g，蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，NaCl 2g，CaCO3 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 0.5g，水1000mL，pH值7.0；在每个500ml三角瓶中装入100mL液体发酵培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入10mL步骤2中得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养6天得发酵液，在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡8小时后，用转速为3000rpm的离心机离心10分钟，取上清液并在旋转蒸发仪上50℃蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，获得所述孢子悬浮液，备用；
步骤1.4、分别取各中草药20g粉碎，混合，加入95％的乙醇100ml，室温下浸泡48h，3层纱布过滤，滤液4000r/min离心15min，取上清液，40℃下旋转蒸发至干，残余物溶于20ml50％乙醇中，获得所述中药提取液。
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