CN114369678B - 一种检测甜菜转基因成分和转基因品系的引物组合、试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测甜菜转基因成分和转基因品系的引物组合、试剂盒、检测方法及应用。所述的检测甜菜常用的转基因元件及转基因品系的引物对组合包括以扩增13种常用甜菜转基因元件、2种转基因品系特异性序列以及1种甜菜内参基因Bv_GLuA3(glutamine synthetase leaf isozyme gene)的引物组。本发明还涉及检测甜菜转基因元件、转基因品系的试剂盒与检测方法。本发明技术方案操作简单，检测效率高；检验对象全面，具有较高的检测特异性、准确度和灵敏性；可用于转基因甜菜及其制品的大规模检测，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种检测甜菜转基因成分和转基因品系的引物组合、试剂盒、检测方法及应用。
背景技术
甜菜是一种重要经济作物，目前美国和加拿大95％以上种植的甜菜均为转基因甜菜。目前上市的转基因甜菜品系共有三个:GTSB77、T120-7和H7-1，其中仅H7-1获得我国农业部批准用于糖、甜菜浆及
加工原料，主要性状为：抗病,抗虫和品质改良等,其中仅H7-1获得我国农业部批准用于糖、甜菜浆及加工原料。随着大量的转基因甜菜被直接或间接地制成食品以及国际社会对转基因产品安全性问题的日益关注，农产品中的转基因成分检测已纳入国内外检验检疫部门的检测项目并逐渐得到加强。因此，开发高效、便捷的转基因食品检测技术显得至关重要。
转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。目前基于核酸的PCR检测方法仍是目前最普遍、最准确的转基因检测技术，其主要包括普通定性PCR、巢式PCR、环介导等温扩增技术(LAMP)、荧光定量PCR多重PCR等方法。相对于普通定性PCR方法，巢式PCR高了检测的灵敏度，容易造成假阳性。LAMP操作简单、特异性强，然而引物设计较为复杂，容易造成DNA污染，影响后续的实验。荧光定量PCR方法具有重复性好、灵敏度高、核酸交叉污染少的优点，但其成本高，并且需要特殊检测仪器。普通的多重PCR方法可以在一个反应中同时检测多个基因，但一般不超过6重，否则引物之间干扰较大，影响检测效果。基因芯片和数字PCR技术也是常用的转基因产品检测技术，它们均具有高通量、灵敏度高、特异性强等优点，且可平行检测1个转基因作物中多个基因或同时检测多种转基因作物；然而其成本高昂，需要专门的仪器设备，要求操作人员具有较高的专业素质，这些因素限制了该技术在检测中的广泛应用。
因此研发一种高效、灵敏和通量高的转基因产品检测方法，成为亟待解决的关键问题。
发明内容
本发提供了一种面检测甜菜转基因元件、品系的引物对组合、试剂盒及检测方法，以解决基于定量PCR技术通量低、基因芯片和数字PCR技术的转基因检测成本高的技术问题。
本发提供的一种面检测甜菜转基因元件及品系的技术方案，以13种检测常用的甜菜转基因元件p35S、t35S、pFMV35S、pNOS、tNOS、tOCS、GUS、GOX、 PAT、bar、NPtII、E93、cp4epsps和2个转基因品系H7-1、GTSB77的特异性核苷酸序列即本发明所筛选的靶标分子，以及内参基因BV_GLUA3作为检测目标，设计多重PCR扩增引物对的核苷酸序列；开发了17对引物，所述引物互相间不影响，可以通过多重PCR进行高效的扩增。所述多重PCR引物组合可以用于开发甜菜转基因元件及品系检测试剂盒。
具体的技术方案为，第一方面，本申请提供了一种检测甜菜转基因元件及品系引物对组合，即包括编号BvGMO1、BvGMO2、BvGMO3、BvGMO4、BvGMO5、BvGMO6、 BvGMO7、BvGMO8、BvGMO9、BvGMO10、BvGMO11、BvGMO12、BvGMO13、BvGMO14、 BvGMO15的15对引物，每对引物由正向引物和反向引物组成，具体的引物对组合核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.30所示。
还提供了包括用用于扩增甜菜内参基因BV_GLUA3的编号为BvGMO16、 BvGMO17两对引物对组合，每对引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.31-SEQID NO.34所示。
上述这些引物分别用于扩增下列甜菜转基因元件p35S、t35S、pFMV35S、 pNOS、tNOS、tOCS、GUS、GOX、PAT、bar、NPtII、E93、cp4epsps和2个转基因品系H7-1、GTSB77的特异性核苷酸序列即本发明所筛选的靶标分子。上述引物与其扩增的上述甜菜转基因元件及品系的特异性核苷酸序列、相应引物对的编号及引物对的核苷酸序列如表1所示。
表1本发明所筛选的靶标分子及其引物序列
在引物设计时，为了增强所述引物的适用性和灵敏性，所设引物长度介于在18-30bp之间，引物间互不干扰，且所有引物可以组合成引物池进行多重PCR 扩增，即所有设计的引物可以在一个扩增反应中均正常扩增，经使用证实，灵敏度高和适用性强。
另一方面，本申请提供了一种检测甜菜转基因元件、品系的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测甜菜转基因元件、品系的引物对组合和权利要求2所述的用于扩增甜菜内参基因BV_GLUA3的引物对组合。
优选地，所述检测试剂盒还包括多重PCR预混液。
本发明还提供了权利要求1或2所述的引物对组合、权利要求3或4的述的检测试剂盒在检测转基因甜菜种子及相关产品中的应用。
本发明还提供了一种检测甜菜转基因元件、品系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)以甜菜转基因元件、品系和甜菜内参基因进行参考，得到多重PCR引物；
2)得到待测甜菜的DNA；以所述DNA为模板，将所述多重PCR引物加入反应体系中，进行扩增反应，得到扩增产物；将所述扩增产物进行高通量测序，得到高通量文库；将所述高通量文库中的基因序列进行分析，以实现检测甜菜转基因元件及品系。
优选地，所述的方法的扩增反应的环境/程序包括：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个Touch Down循环，(每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃)；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。
再优选地，所述的方法的反应体系包括：总体系30μl，引物对：2μl、 2×buffer：15ul，多重扩增酶：0.5μl；剩余的用水补充；所述高通量文库的浓度大于2ng/ul为合格。
为了实现对样品中甜菜转基因元件及品系的检测目的，在选用了上述甜菜转基因元件或品系时，加入对甜菜内参基因的检测引物，以实现转基因成分含量的定量检测。
在引物设计时，为了增强所述引物的适用性和灵敏性，所设引物长度介于在18-30bp之间，引物间互不干扰，且所有引物可以组合成引物池进行多重PCR 扩增，即所有设计的引物可以在一个扩增反应中均正常扩增，经使用证实，灵敏度高和适用性强。
具体的，多重PCR预混液的组分包括所述扩增转基因甜菜元件、品系和内参基因的各引物组时，每条引物按照1:1的比例进行预混，根据不同的实验目的进行各引物的混合，具体实施实例中，每条引物浓度是2nM。
在一些实施方式中，所述引物对数范围为：1-17对之间根据具体检测样品的情况适当调整。后期可根据新收集的转基因元件或品系进行定期增加，我们的引物组合尝试过3000对，扩增效果依然很好。为了实现对转基因甜菜的检测，我们收集了13个常用的甜菜转基因元件和2种转基因品系，覆盖了市面上大多数转基因甜菜品系的常用转基因元件，所述多重PCR引物的对数范围为： 1-17对，相比常规的8对特异性的多重PCR，具有检测通量和灵敏度高的优势。
具体地，高通量测序可以是二代测序，也可以是3代测序，得到的高通量文库可以从多个维度分析甜菜中转基因成分，包括但不限于我们实施案例中的甜菜转基因元件或品系。
在一些实施例中，使用上述方法，可一次性对多样本的所有靶标转基因成分进行检测，具有高通量、高灵敏、准确和快速等优势，可应用于转基因甜菜品系及其制品的转基因成分的定性与定量检测。
本发明所提供的试剂盒能灵敏的检测样品中转基因含量为0.05％的甜菜转基因产品。
本发明的重现性试验中每个样品不同文库间、不同建库批次间检测结果重现率r＝100％，准确率a＝100％。
本发明的所述试剂盒在复杂模板中检测多种甜菜转基因品系，具有高度特异性。
本发明的有益效果是：
1)操作简单，经过一次样品前处理，单管PCR扩增，文库构建与测序就可以同步检测多样品或一个样品中多种转基因成分，具有平行分析和多重判断的特点，大大提升了转基因产品的检测效率；
2)检验对象全，包含了甜菜当前常见的转基因元件和2种转基因品系，并且可以很方便的加入新的检测靶标序列，避免单个靶标扩增失败，提高的了检测的特异性、准确度和灵敏性；
3)试剂盒融合二代测序平台进行扩增产物的测序，提高了检测***的通量和可重复性，并且检测结果可以直接数字化，适用于转基因甜菜及其制品的大规模检测。
因此，本发明克服了现有技术费时费力成本高的缺陷，提供的甜菜转基因品系检测试剂盒操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果重复性好，多样本多靶标序列检测成本低廉，对种子站、农科院所及海关进出口岸的转基因制品检测具有重要应用。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的技术方案进行详细说明。
附图说明
图1；转基因甜菜T120-7的结构示意图
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
需要说明的是，除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。
除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1靶标转基因元件、品系的筛选和多重PCR扩增引物的设计
S1、靶标转基因元件、品系的筛选
本申请实施例中，靶标转基因成分主要指的是转基因元件和品系，他们及实施例中使用的甜菜内参基因，主要收集于常用的转基因数据库、国家标准、行业标准或者现有的文献中，尽量收集的全，以保证我们检测的特异性和准确性。其中筛选的转基因元件、品系和内参基因的名称如表1所示。
S2、多重PCR扩增引物的设计
本申请实施例中，利用Primer3Plus设计多重PCR引物，所设引物长度介于在18-30bp之间，引物间互不干扰，这个主要评估引物之间的二聚体，或者引物内部的发夹结构，以及非靶标序列的非特异扩增，评估后的所有引物可以组合成引物池进行多重PCR扩增，即所有设计的引物可以在一个扩增反应中均正常扩增。具体的引物序列包括：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.44所示。
实施例2检测甜菜样品是否含有转基因成分
1.实验材料：抗除草剂甜菜品种T120-7，转基因材料T120-7的结构示意图如图1所示。实验材料转入了p35S、t35S、PAT、NPtII、tNOS、tOCS，其转基因含量为10％，用其作为我们的研究材料。
2.DNA模板的准备：植物基因组的提取采用的是CTAB或天根生化科技(北京)有限公司的高效植物基因组DNA提取试剂盒(DP350)。本实施例是用天根 DNA提取试剂盒提取的待测样品DNA，每个样品做了三个生物重复。
3.PCR扩增、文库构建与测序
利用22对多重PCR扩增引物扩增样本的基因组DNA；将每个样本的扩增产物连接测序接头和特异样本DNA条形码后混合，成为高通量测序文库；利用高通量测序平台检测高通量测序文库并对高通量测序数据进行质量控制。本步骤需要根据检测的准确性、灵敏性等要求，研究调整扩增循环数、测序深度等关键参数；本步骤也可连接三代测序，以实现二代测序与三代测序间优势互补。
4.结果的判定
1)据测试样品中的转基因元件、品系的信号指数S和空白对照中转基因元件、品系的信号指数P判定污染是否可接受，其中：
空白对照噪音指数P＝nc/Nc，其中nc和Nc分别代表空白对照中，转基因元件、品系的测序片段的数量和总测序片段数量。
测试样品的信号指数S＝nt/Nt，其中，和Nt分别代表测试样品中，转基因元件、品系的测序片段的数量和总测序片段数量。
信噪比＝S/P
2)转基因结果的判断
利用待测样本DNA条形码和同源比对，将每个测序片断分配到每个目标物种的每个靶标位置上，所述的靶标包括转基因元件、品系和内参基因。根据每个靶标位置上的测序序列数目，以实现转基因元件或品系的绝对定量。当比对内参基因和转基因元件上的测序序列超过指定阈值时，定性判定样品中含有转基因成分；当样品中含有转基因成分时，根据转基因元件和品系与内参基因的测序序列的比值，定量判定样品中的外源基因的含量。本实施例中转基因含量的计算公式如(A)所示：
CtestDNA ——测试样品的转基因含量
tTi ——测试样品中的每种转基因元件和品系的测序序列数目
tRi ——测试样品中检出的每种内参基因片段的测序序列目
m ——测试样品中检出的内参基因片段的总数
n ——标准品中检出的转基因元件和品系片段的总数
根据本实例，我们共检测了2个样品，1个转基因品系和一个阴性样品，每个样品做了三个生物重复，结果如表2和图1所示：阴性样品中常用的启动子和终止子在阴性甜菜种也会检测出几个序列，本实例中我们要求测序reads 数目小于5条的序列过滤掉。本发明规定当信噪比大于10倍时，可判定检测体系中的污染是可接受的。当样品中转基因品系的信噪比大于10，判定样本中检出转基因品系的核酸。具体地，阳性样品中的所对应的各转基因元件在三个重复实验中国均被有效检出，而且含量接近于其含量；从该表说明我们发明的这个甜菜转基因试剂盒可以用来检测转基因产品。
表2本实施例2待测样品的转基因检测结果
实施例3准确性、特异性与灵敏度评估
转基因甜菜品种H7-1和GTSB77转基因标准品制备不同质量百分比的转基因样本来评估所开发技术的准确度、特异性和灵敏度。具体地，各样本的转基因含量采用质量百分进行稀释，具体地把转基因甜菜H7-1和GTSB77用阴性甜菜分别稀释成10％，1％，0.1％，0.05％，0.025％和0.01％的样本，分别对应于转基因品系H7-1的稀释样本编号(A1，A2，A3，A4，A5，A6)和转基因品系GTSB77 的稀释样本编号(B1，B2，B3，B4，B5，B6)。定性检测的准确度指真阳性与真阴性所占的比例，定量准确度是指多次测定的平均值与真值相符合的程度，以误差来表示。特异性又称真阴性率，多次检测检出的真阴性占所有阴性的百分比。灵敏度指在95％置信度下，能够检出的转基因品系的最低含量，即检测下限。按照实施例2的方法进行检测，每个样本三个生物重复，结果如表3所示：所述试剂盒能在转基因含量为0.05％的样本中稳定地检出各转基因元件，而在阴性的样本中没有检出任何转基因成分，说明所述试剂盒特异性强，说明所述试剂盒特异性强，能够明显区分转基因含量为0.05％的样本和阴性样本，具有技术稳定性和转基因含量为0.05％的检测灵敏度。
表3本发明方法的准确性与灵敏度评估
注：+代表检出，－代表未检出，A1和B1代表转基因含量为10％，A2和B2代表转基因含量为1％，A3和B3代表转基因含量为0.1％，A4和B4代表转基因含量为0.05％，A5和B5 代表转基因含量为0.025％，A6和B6代表转基因含量为0.01％。
实施例4我们发明的方法在实际检测样品中的应用
为了验证本发明的准确性及批量样品转基因检测中的作用，实验室选取了某公司351份未知基因型的甜菜叶片样本进行检测，采用实施例2的检测方法，检测结果并与该公司的保存类型进行比较，并统计结果的一致性。分析结果表明在351份测试样品中，只有2份样品的结果不一致，检测结果的一致性高达 99.43％，因此较好的证明了我们所发明方法的准确性。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性地包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 江汉大学
<120> 一种检测甜菜转基因成分和转基因品系的引物组合、试剂盒、检测方法及应用
<130> 20220102
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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gcctccgatg atcgacgaat 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
tccttgacgc ggagttcttc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
tgggatctgg gtggctctaa 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
acccaatctg gaatgctgct 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 29
ggataccaca tcgtgatcgc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 30
gaagtccaaa tcagccgaaa 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 31
acagggaagc atgagactgc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
tcagcttcga gtgtgggttc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 33
actgccgaca tcgacacatt 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 34
tcagcttcga gtgtgggttc 20
Claims (5)
1.一种检测甜菜转基因元件及转基因品系的多重PCR引物对组合，其特征在于，所述引物对组合包括编号为BvGMO1、BvGMO2、BvGMO3、BvGMO4、BvGMO5、BvGMO6、BvGMO7、BvGMO8、BvGMO9、BvGMO10、BvGMO11、BvGMO12、BvGMO13、BvGMO14、BvGMO15的15对引物，每对引物由正向引物和反向引物组成，具体的引物对组合核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.30所示，所述甜菜转基因品系为H7-1和GTSB77。
2.根据权利要求1所述的引物对组合，其特征在于，所述引物对组合还包括用于扩增甜菜内参基因BV_GLUA3的编号为BvGMO16、BvGMO17两对引物对组合，每对引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.34所示。
3.一种检测甜菜转基因元件和转基因品系的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测甜菜转基因元件和转基因品系的引物对组合和权利要求2所述的用于扩增甜菜内参基因BV_GLUA3的引物对组合，所述甜菜转基因品系为H7-1和GTSB77。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括多重PCR预混液。
5.权利要求1或2所述的引物对组合、权利要求3或4所述的检测试剂盒在检测转基因甜菜品种及相关产品中的应用，所述转基因甜菜品种为H7-1和GTSB77。
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Applications Claiming Priority (1)
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