CN107164514A - 转基因甜菜gtsb77品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒 - Google Patents

转基因甜菜gtsb77品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。本发明针对转基因甜菜GTSB77品系转入的基因盒3’端gox区域与甜菜基因组邻接区序列设计引物和探针，建立转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测方法，具有特异性好、灵敏度高、可重复性良好等优点，扩增效率为101％，最低定量检测下限为16copies。有效的解决了现有技术中无转基因甜菜GTSB77品系特异性精准定量检测技术的问题，该方法可应用于进出境口岸检验检疫、国内农业产品食品监管的转基因甜菜GTSB77及其产品的检测。

Description

转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、 方法和试剂盒
技术领域：
本发明属于转基因产品检测领域，具体涉及转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。
背景技术：
目前上市的转基因甜菜品系共有三个：GTSB77、T120-7和H7-1，其中H7-1已获得我国农业部批准用于饲料。转基因甜菜GTSB77是由诺华公司和孟山都公司通过农杆菌介导法将导入甜菜，研发出具抗草甘膦除草剂抗性的甜菜品系，商品名为：InVigorTMsugarbeet。1998年-2004年间，美国、日本、加拿大、澳大利亚、菲律宾相继批准甜菜GTSB77品系作为食品或饲料用途，中国尚未批准转基因甜菜GTSB77批准用于食品和饲料。目前美国和加拿大95％以上种植的甜菜均为转基因甜菜。
GTSB77(Glyphosate-tolerant sugarbeet line 77)由转入三个基因研发而成：cp4-epsps基因、uidA基因和修饰过的gox基因。cp4-epsps基因和gox基因均为草甘膦除草剂耐受基因(cp4-epsps基因编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶对草甘膦除草剂不敏感；gox基因编码草甘膦氧化还原酶而降解除草剂，然而由于其在翻译过程中被截断，其序列69％与甜菜基因融合形成嵌合基因，尽管嵌合基因序列能进行mRNA转录，但没有新的蛋白翻译产生，因此转基因甜菜GTSB77没有GOX酶活性。)。
目前对转基因产品多数国家均采用相应的标识管理制度，标识管理制度的建立和实施依赖于有效准确的检测鉴定技术。品系特异性PCR(转化事件特异性)(Event-specificPCR)检测的目标序列是外源***序列与植物基因组间连接区，相较于筛选PCR(ScreeningPCR)、基因特异性PCR(Gene-specific PCR)、构建特异性PCR(Construct-specific PCR)具有更加高的具有高特异性，甚至能用于检测鉴定相同质粒转化的转基因具体品系，是目前转基因品系鉴定检测技术研究和实际检测工作中的重要方法。
为打破其他国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒，完善和我国转基因产品定量检测技术体系，保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，为进出境口岸监管部门提供转基因不同品系标识检测鉴定的方法，建立转基因甜菜GTSB77品系特异性定量PCR精准检测方法十分必要。目前欧盟等其他国家和地区均尚无转基因甜菜GTSB77品系特异性定量检测方法。
发明内容：
本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确鉴别转基因甜菜GTSB77品系的转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。
本发明的第一个目的是提供一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
GTSB77-F：5’-AACGTGGATACCACATCGTGATC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
GTSB77-R：5’-GAAGTCCAAATCAGCCGAAATTT-3’(如SEQ ID NO.2所示)。
本发明的第二个目的是提供一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：
GTSB77-P：5’-CCCAGAAGCTGCTCCACGTATTCCAA-3’(如SEQ ID NO.3所示)，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
所述的荧光报告基团优选为FAM，所述的荧光淬灭基团优选为BHQ1。
本发明的第三个目的是提供一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
GTSB77-F：5’-AACGTGGATACCACATCGTGATC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
GTSB77-R：5’-GAAGTCCAAATCAGCCGAAATTT-3’(如SEQ ID NO.2所示)；
所述的检测探针如下所示：
GTSB77-P：5’-CCCAGAAGCTGCTCCACGTATTCCAA-3’(如SEQ ID NO.3所示)，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
本发明的第四个目的是提供一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样品的基因组DNA作为模板；
(2)加入上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
(3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为转基因甜菜GTSB77品系。
优选，所述的步骤(2)的扩增反应体系为：25μL，包括Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，10μmol/L检测引物GTSB77-F和GTSB77-R各0.5μL，10μmol/L检测探针GTSB77-P 0.5μL，DNA模板2μL和ddH2O 8.8μL；所述的步骤(3)的实时荧光PCR反应，其反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。
优选，所述的步骤(3)的根据扩增曲线判断样品是否为转基因甜菜GTSB77品系的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品为转基因甜菜GTSB77品系；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品不是转基因甜菜GTSB77品系。
本发明的第五个目的是提供一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取转基因甜菜GTSB77品系的基因组DNA进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，分别加入上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应；
(2)反应后得到各起始浓度模板对应的Ct值，该Ct值与起始模板量的常用对数(lg)呈线性关系，据此得到该线性范围内转基因甜菜GTSB77品系的标准曲线；
(3)提取待测样品的基因组DNA为模板，加入与步骤(1)中相同体系的上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应后得到Ct值，将其代入步骤(2)获得的转基因甜菜GTSB77品系的标准曲线，计算得到待检样品中转基因甜菜GTSB77品系基因组DNA的含量(拷贝数或质量)。
本发明针对转基因甜菜GTSB77品系特异性序列(GTSB77品系转入的基因盒3’端gox区域与甜菜基因组邻接区序列)设计引物和TaqMan探针，建立转基因甜菜GTSB77实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测方法，利用该检测引物和检测探针，按照本发明的方法进行检测发现其定量检测下限为16拷贝，建立的标准曲线线性相关系数(R2)为0.99，扩增效率E为101％，重复性实验显示本方法的标准偏差(SD)及相对标准偏差(RSD)都在可接受范围内，特异性良好、灵敏度高、稳定性强，可满足监管部门和公众对转基因甜菜GTSB77进行品系特异性检测鉴定的需求。
附图说明：
图1是甜菜内源基因GS特异性扩增图，1～4分别为GS-GTSB77质粒、转基因甜菜H7-1、非转基因甜菜荷兰KUHN8060和非转基因甜菜吉甜2045扩增曲线，阴性扩增分别为：转基因油菜MON88302、转基因苜蓿J101、转基因苜蓿J163、转基因玉米MON810、转基因大豆GTS40-30-2、转基因玉米BT11、转基因玉米MIR162、转基因玉米NK603、非转基因大麦、非转基因玉米和非转基因大豆、阴性对照和空白对照。
图2是转基因甜菜GTSB77品系特异性检测方法特异性实验结果，1为GS-GTSB77质粒；2～17分别为：转基因油菜MON88302、转基因苜蓿J101、转基因苜蓿J163、转基因玉米MON810、转基因大豆GTS 40-30-2、转基因玉米BT11、转基因玉米MIR162、转基因玉米NK603、非转基因大麦、非转基因甜菜荷兰KUHN8060、非转基因甜菜吉甜2045、转基因甜菜H7-1、非转基因玉米和非转基因大豆、阴性对照和空白对照。
图3是转基因甜菜GTSB77品系特异性检测灵敏度试验扩增图；1～8分别为：800000、80000、8000、800、80、40、8和4copies/μL质粒DNA。
图4是实时荧光PCR检测甜菜内源基因GS的标准曲线，Quantity表示DNA模板量(拷贝数)。
图5是实时荧光PCR检测转基因甜菜GTSB77品系的标准曲线，Quantity表示DNA模板量(拷贝数)。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
主要材料：转基因油菜MON88302、转基因苜蓿J101、转基因苜蓿J163、转基因玉米MON810、转基因大豆GTS 40-30-2、转基因玉米BT11、转基因玉米MIR162、转基因玉米NK603、非转基因大麦、非转基因甜菜荷兰KUHN8060、非转基因甜菜吉甜2045、转基因甜菜H7-1、非转基因玉米和非转基因大豆为本实验室购置储备，甜菜内源基因谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase,GS)和转基因甜菜GTSB77品系特异性片段双基因阳性质粒(双基因阳性质粒为将内源基因GS基因片段160bp序列(如SEQ ID NO.4所示)和转基因甜菜GTSB77品系特异性片段379bp序列(如SEQ ID NO.5所示)共539bp序列(如SEQ ID NO.6所示)克隆到AmpR抗性的PUC57载体上构建得到的重组质粒，将重组质粒转入受体菌DH5a后-70℃保存。以下称GS-GTSB77质粒)为本实验室构建。
选择甜菜内源基因谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase,GS)(参考文献：Mazzara M,FotiN,Savini C,Van Den Eede G.Event-Specific Method for theQuantitation of Sugarbeet Line H7-1Using Real-Time PCR-Validation Report andProtocol.EUR22134EN.2006.JRC32190)引物GS-F/R和探针GS-P用于检测甜菜样品基因组DNA是否成功提取以及是否适于进行实时荧光PCR扩增；其序列信息详见表1。
主要试剂：Primex Ex Taq(2×)for qPCR，大连宝生物；DNA提取试剂盒，北京天根公司；引物和探针由闪晶生物公司合成，稀释为终浓度为10μM的工作液使用。
主要仪器与设备：
ABI7500，ABI7500FAST实时荧光定量PCR仪，美国应用生物***公司；QX 200微滴式数字PCR***，美国伯乐公司；nanodrop2000c微量分光光度计，美国Thermo公司；研磨机，德国IKA。
农作物材料样品基因组DNA采用常规方法提取与纯化。
实施例1：实时荧光PCR检测方法的建立
根据转基因甜菜GTSB77品系转入的基因盒3’端gox区域与甜菜基因组邻接区序列(转基因甜菜GTSB77品系特异性片段，如SEQ ID NO.5所示)，应用Primer Primer 5.0软件设计引物和探针。将设计的引物、探针经NCBI网站上使用BLAST数据库比对确定引物和探针的理论特异性；甜菜内源基因谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase,GS)，用于甜菜来源样品DNA的检测及转基因成分的相对定量。具体引物探针信息见表1。
表1实时荧光PCR的引物、探针
扩增反应体系为25μL：包括Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROX Reference Dye II0.2μL，10μmol/L上游引物和下游引物各0.5μL，10μmol/L检测探针0.5μL，DNA模板2μL和ddH2O 8.8μL；反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。
实施例2：实时荧光PCR方法特异性测试
采用转基因油菜MON88302、转基因苜蓿J101、转基因苜蓿J163、转基因玉米MON810、转基因大豆GTS 40-30-2、转基因玉米BT11、转基因玉米MIR162、转基因玉米NK603、非转基因大麦、非转基因甜菜荷兰KUHN8060、非转基因甜菜吉甜2045、转基因甜菜H7-1、非转基因玉米和非转基因大豆的基因组DNA为模板，阳性样品为GS-GTSB77质粒，阴性对照为非转基因大米DNA。对建立的实时荧光PCR检测方法的特异性进行测试。实时荧光PCR检测反应体系和反应程序同实施例1。
结果显示，采用引物GS-F/R和探针GS-P对所有提取的样品的DNA进行实时荧光PCR时，只有非转基因甜菜荷兰KUHN8060、非转基因甜菜吉甜2045、转基因甜菜H7-1和GS-GTSB77质粒来源的DNA模板出现扩增曲线，其他农作物无典型扩增曲线，表明甜菜内源基因GS扩增结果正确(图1)。
采用GTSB77品系特异性引物GTSB77-F/R和探针GTSB77-P对所有提取的样品的DNA进行实时荧光PCR时，只有阳性样品GS-GTSB77质粒的DNA模板有典型荧光扩增曲线，以其他农作物材料DNA为模板的均无典型荧光扩增曲线(图2)。表明本发明的检测方法特异性良好。
实施例3：灵敏度测试、可重复性测试及标准曲线建立
将提取的GS-GTSB77质粒DNA溶液加TE缓冲液分别稀释至800000、80000、8000、800、80、40、8和4copies/μL作为DNA模板进行转基因甜菜GTSB77实时荧光PCR检测，实时荧光PCR检测反应体系和反应程序同实施例1，进行灵敏度测试；测试结果显示(图3)，800000-8copies/μL范围内7个浓度梯度三个平行均能有典型扩增曲线，而到4copies/μL浓度只有一个平行有扩增曲线，显示其结果不稳定。所以最低检测浓度为8copies/μL。扩增图1-8分别为800000、80000、8000、800、80、40、8和4copies/μL扩增曲线。
将提取的GS-GTSB77质粒DNA溶液加TE缓冲液分别稀释至800000、80000、8000、800、80、40、8和4copies/μL作为DNA模板，进行转基因甜菜GTSB77实时荧光PCR检测，进行线性范围测试及可重复性测试，每个样品进行3次重复实验，水为空白对照，实时荧光PCR检测反应体系和反应程序同实施例1。结果如表2所示。在模板量16-1600000copies(2μL/25μL体系)范围内7个浓度(其中4cpies/μL的浓度检测结果不稳定，三个平行只有一个Ct值，故不列入线性范围计算)的对数值与所得Ct值建立标准曲线(图5)，线性回归方程为：y＝-3.295x+40.385，R2为0.997，扩增效率为101％(介于90％～110％)，表明其线性相关性良好，扩增效率高，均符合ENGL相关要求[Definition of Minimum PerformanceRequirements for Analytical Methods of GMO Testing]；在模板量为16-1600000copies的范围内，其Ct值的SD介于0.02-0.61，RSD介于0.05％-1.64％，表明在最低模板量16copies时，其SD和RSD均小于25％。所以本发明的定量检测下限为16copies。实时荧光PCR检测甜菜内源基因GS的标准曲线见图4，线性方程为：y＝-3.292+41.06，R2:0.995，扩增效率101％，均满足相关要求。
表2实时荧光PCR方法的灵敏度及可重复性测试
本发明针对转基因甜菜GTSB77品系转入的基因盒3’端gox区域与甜菜基因组邻接区序列设计引物和探针，建立的转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测方法，可对转基因甜菜GTSB77进行品系特异性快速、高通量的定性及定量检测，满足检测、监管部门对其进行标识的需求。
序列表
<110> 中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局
<120> 转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒
<160> 6
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aacgtggata ccacatcgtg atc 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaagtccaaa tcagccgaaa ttt 23
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cccagaagct gctccacgta ttccaa 26
<210> 4
<211> 160
<212> DNA
<213> 甜菜
<400> 4
cacgcatcca ccccaccatg catctctctc tgtctcccac aggggagcca ggatggcgta 60
ctgagcctgg atgacaatga ctctcagcat ctgcctccct acgggaacta ctaccagaac 120
ctggggggcg atggcaacat caggagaaac tacgaactgt 160
<210> 5
<211> 379
<212> DNA
<213> 转基因甜菜GTSB77
<400> 5
cgtgttatcg gattcgagac tgaaggtcgt gctctcaagg gtatcaccac caccaacggt 60
gttcttgctg ttgatgcagc tgttgttgca gctggtgcac actccaagtc tcttgctaac 120
tcccttggtg atgacatccc attggatacc gaacgtggat accacatcgt gatcgccaac 180
ccagaagctg ctccacgtat tccaactacc gatgcttctg gaaagttccg gtccaaattt 240
gtttacattg tgtccaaatt tcggctgatt tggacttccc tagctatgcc aactaagcta 300
ataaaaaaca tgaaacaaca attacaaact gtcgagcaca ccttctacaa actagcttag 360
atttctattg gaagttaca 379
<210> 6
<211> 539
<212> DNA
<213> GS-GTSB77质粒
<400> 6
cacgcatcca ccccaccatg catctctctc tgtctcccac aggggagcca ggatggcgta 60
ctgagcctgg atgacaatga ctctcagcat ctgcctccct acgggaacta ctaccagaac 120
ctggggggcg atggcaacat caggagaaac tacgaactgt cgtgttatcg gattcgagac 180
tgaaggtcgt gctctcaagg gtatcaccac caccaacggt gttcttgctg ttgatgcagc 240
tgttgttgca gctggtgcac actccaagtc tcttgctaac tcccttggtg atgacatccc 300
attggatacc gaacgtggat accacatcgt gatcgccaac ccagaagctg ctccacgtat 360
tccaactacc gatgcttctg gaaagttccg gtccaaattt gtttacattg tgtccaaatt 420
tcggctgatt tggacttccc tagctatgcc aactaagcta ataaaaaaca tgaaacaaca 480
attacaaact gtcgagcaca ccttctacaa actagcttag atttctattg gaagttaca 539

Claims (8)

1.一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
GTSB77-F：5’-AACGTGGATACCACATCGTGATC-3’；
GTSB77-R：5’-GAAGTCCAAATCAGCCGAAATTT-3’。
2.一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：
GTSB77-P：5’-CCCAGAAGCTGCTCCACGTATTCCAA-3’，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ1。
4.一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
GTSB77-F：5’-AACGTGGATACCACATCGTGATC-3’；
GTSB77-R：5’-GAAGTCCAAATCAGCCGAAATTT-3’；
所述的检测探针如下所示：
GTSB77-P：5’-CCCAGAAGCTGCTCCACGTATTCCAA-3’，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
5.一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样品的基因组DNA作为模板；
(2)加入权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
(3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为转基因甜菜GTSB77品系。
6.根据权利要求5所述的转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)的扩增反应体系为：25μL，包括Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROXReference Dye II 0.2μL，10μmol/L检测引物GTSB77-F和GTSB77-R各0.5μL，10μmol/L检测探针GTSB77-P 0.5μL，DNA模板2μL和ddH2O 8.8μL；所述的步骤(3)的实时荧光PCR反应，其反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。
7.根据权利要求5所述的转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(3)的根据扩增曲线判断样品是否为转基因甜菜GTSB77品系的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品为转基因甜菜GTSB77品系；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品不是转基因甜菜GTSB77品系。
8.一种转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取转基因甜菜GTSB77品系的基因组DNA进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，分别加入权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应；
(2)反应后得到各起始浓度模板对应的Ct值，该Ct值与起始模板量的常用对数(lg)呈线性关系，据此得到该线性范围内转基因甜菜GTSB77品系的标准曲线；
(3)提取待测样品的基因组DNA为模板，加入与步骤(1)中相同体系的权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应后得到Ct值，将其代入步骤(2)获得的转基因甜菜GTSB77品系的标准曲线，计算得到待检样品中转基因甜菜GTSB77品系基因组DNA的含量。
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