CN114354574A - 一种基于模拟酶信号放大的多元sers生物检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物材料检测的技术领域内一种基于模拟酶信号放大的多元SERS生物检测方法法，本发明的检测方法中依次制备多种不同编码的SiO2固相免疫基底、多种修饰不同抗体的金纳米粒子，再次两者混合制备多组份抗原标志物的三明治免疫夹心结构微球混合液，进行表面增强拉曼光谱检测，以进行多元SERS生物检测方。本发明的检测方法中，金纳米粒子具有优异的表面增强拉曼性能，且在过氧化氢的存在下可将非活性的拉曼报告分子氧化成活性的拉曼报告分子，从而双重增强表面增强拉曼探针的拉曼信号，进一步提高了检测灵敏度，通过二氧化硅光子晶体的编码/解码最终实现了对不同生物分子的多元检测，实现了高灵敏度的多元生物SERS检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料检测的技术领域，特别涉及一种基于基于模拟酶信号放大的多元SERS生物检测方法。
背景技术
表面增强拉曼散射（SERS）作为一种功能强大的高灵敏度的分析技术，它可以在不破坏样品，不需添加试剂的条件下进行检测，现已被利用在生物化学，化学分子检测，药物分析，生物检测等领域。多重免疫分析与传统的单分子免疫分析法相比，拥有着更高的样本容量、更少的样本消耗、更短的检测时间和更低的成本。多元生物分析方法在药物筛选技术、基因功能分析和生物分析临床诊断中有着广泛的应用前景。但功能单一的流动编码载体存在某些不足，如编码量少、不易分离、编码稳定性低等，因此研究人员通过利用不同材料的性能来拓宽流动编码载体的应用范围。随着纳米科学和材料制备技术的快速发展，SERS技术也在不断进步。但是，人们已不再满足于SERS基底材料单一的增强作用。因此制备一种高活性且可实现多元分析的SERS增强基底变得十分重要。
酶联免疫吸附法(ELISA)是一种灵敏度高、操作简单且特异性强的分析手段，目前已被广泛应用于肿瘤的早期诊断、环境分析、食品控制等领域。然而传统的酶-抗体偶联物会降低酶标记的催化活性，降低抗体对抗原的捕获效率，导致免疫测定的检测灵敏度相对较低。此外，酶标记作为一种天然蛋白，在苛刻的条件下稳定性也较差。因此用催化纳米材料或其复合材料来代替天然酶解决不稳定性问题是十分必要的。
金纳米粒子拥有极强的SERS性能和催化性能，已有研究发现金纳米粒子是人工模拟酶中的“隐藏天才”，包括模拟核酸酶、酯酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等，且利用金纳米粒子模拟过氧化物酶进行整合素检测等。另一方面，局域表面等离子体共振特性使金纳米粒子具有显著的电磁场增强，可以提高SERS性能。因此，金纳米粒子的SERS活性和催化性能的结合将为开发灵敏的生物检测提供一个特别的平台，已被成功的用于开发敏感化学和生物医学检测的活性底物。
最近的一些研究表明可以利用本发明的目的在于提出一种基于模拟酶信号放大的多元生物SERS检测方法，该方法将推动高活性的多组分SERS生物分析技术。来监测硝基酚的氧化、还原过程。虽然已经成功利用金纳米粒子作为氧化酶模拟物构建了用于DNA检测的等离子体纳米传感器，但金纳米粒子的酶模拟特性及其SERS活性在生物检测中的结合仍有待探索。
发明内容
本发明本针对现有的技术中金纳米粒子的酶模拟特性及其SERS活性在生物检测中存在的问题，提供一种基于模拟酶信号放大的多元SERS生物检测方法，实现高活性多组份的SERS生物检测。
本发明的目的是这样实现的，一种基于模拟酶信号放大的多元SERS生物检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）制备SiO2固相免疫基底：
1.1）分别取样不同编码的SiO2光子晶体编码微球，并加入H2SO4和H2O2混合溶液中，浸泡10～16h，滤出微球，用超纯水洗绦后，再用N2吹干得到修饰羟基基团的功能化微球，再向功能化微球中加入质量浓度为1% GPTMS的甲苯溶液，浸泡10～16h，使其硅烷化，再用甲苯和无水乙醇洗涤后用N2吹干，得到活化的不同编码的SiO2功能微球；
1.2）按一种编码对应一种抗体分别配制：分别向活化的每一种编码的SiO2功能微球中加入浓度为0.5 mg/mL的相应抗体的磷酸盐缓冲溶液中，置于37℃摇床温浴2h，再转于4℃冰箱静置10～16 h，最后用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次；加入1%牛血清蛋白室温下封闭2h以上，将封闭好的微球用磷酸盐缓冲溶液清洗并保存，分别得到不同编码的SiO2固相免疫基底；
2）制备修饰抗体的金纳米粒子：将抗体浓度为0.5～2.5mg/mL的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.5 ～2.5mg/mL金纳米粒子的磷酸盐缓冲溶液混合，37℃下置于摇床中反应2 h，接着转于4℃冰箱静置过夜；加入质量浓度为1%牛血清蛋白溶液室温下封闭2 h，得到修饰抗体的金纳米粒子；
3）多元SERS生物检测方法：分别配置一系列以磷酸盐缓冲液为溶剂的不同浓度的抗原混合溶液n份，将步骤1.2)中得到的每一种编码SiO2固相免疫基底分别同时与同一种浓度的抗原混合溶液按2～20 mg/mL比例混合，得到混合液A1，分别取样每一种浓度的抗原溶液重复配制得到混合液A2～An，温浴反应合混合液后，分别加入步聚2）得到修饰抗体的金纳米粒子，分别形成三明治免疫夹心结构微球混合液，温浴反应后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，加入H2O2和拉曼报告分子TMB的混合液进行分子活化后，置于激光共焦拉曼光谱仪下，切换光路，通过金纳米粒子的双重SERS信号放大，对SiO2光子晶体编码微球表面的拉曼信号进行检测和解码，通过编码信息来确定待测生物分子抗原的种类，利用检测拉曼信号信息确定待测生物分子抗原的浓度。
进一步的，步骤 1.1）中H2SO4和H2O2按体积比为7：3～5混合，其中H2SO4的质量浓度为95～98%，所述SiO2光子晶体微球与H2SO4和H2O2混合溶液的用量比例为5～20 mmg/mL；活化SiO2功能微球与抗体浓度为0.5 mg/mL的磷酸盐缓冲溶液的用量比例为30～50 mg/mL。
进一步的，步骤1.1）中，SiO2光子晶体编码微球通过如下方法制备：
将粒径范围为230~280 nm单分散的SiO2纳米粒子分散在去离子水中，利用协流式微流控装置在二甲基硅油中收集SiO2液滴，待所有液滴沉降后，收集沉降层静置于60℃烘箱内2-3天，蒸发掉液滴中的水分形成SiO2光子晶体微球；再将SiO2光子晶体微球，先后用正己烷和乙醇洗涤洗净后自然吹干，再置于马弗炉经750℃高温煅烧2 h，得到不同粒径不同编码的SiO2光子晶体编码微球。
进一步的，所述述步骤2）中，金纳米粒子的粒径为10～30 nm。
进一步的，步骤2）中，磷酸盐缓冲溶液的抗体溶液与金纳米粒子的磷酸盐缓冲溶液的体积比为1∶1～3。
进一步的，步骤 1）和步骤2）中牛血清蛋白溶液与所封闭的混合液的用量比例为1～3∶1。
进一步的，步骤3）中所加入的修饰抗体的金纳米粒子与磷酸盐缓冲液的浓度比例为0.5～2.5 mmol/L，与混合液A的混合比例为：1：1
再进一步的。步骤3）中，中温浴反应温度为25~37℃，温浴时间为30～60 min，活化时间为5～30 min。
优选的，步骤3）中，所述待测生物分子抗原为CEA、AFP、IgG、CA125、CA199、CA211和/或CA724。
优先的，步骤3），H2O2和拉曼报告分子TMB混合液中拉曼报告分子的浓度为10- 4moL/L，相对三明治免疫夹心结构微球混合液的体积比为1:1。
本发明的有益效果在于：将金纳米粒子的过氧化氢模拟酶性能与SiO2光子晶体的编码特性相结合，同时对多元生物分子进行SERS检测。将抗体修饰在具有编码特性的功能化SiO2光子晶体微球表面，通过加入修饰有不同抗体的金纳米粒子和待测抗原，制备出三明治免疫结构。一方面，金纳米粒子自身具有SERS性能；另一方面在含有H2O2的条件下，金纳米粒子会将非活性的拉曼报告分子氧化成活性的拉曼报告分子，从而起到拉曼双重信号增强的作用，进一步提高了拉曼检测灵敏度。最后再利用SiO2光子晶体的反射峰和偏光显微镜照片进行解码，实现多元SERS生物检测。该方法操作简单，抗干扰性良好，且与实际样品的检测结果保持较高的一致性。
附图说明
图1 为实施1中步骤1制得粒径为230nm和280nm两种SiO2的编码固相免疫基底的扫描电镜图、相应的反射光谱图和显微镜照片；其中，1a为粒径为230 nm的 SiO2 编码光子晶体的CEA抗体免疫基底，1b为粒径约为28 nm SiO2编码光子晶体的AFP抗体免疫基底。
图2为实施例1的步骤（2）的金纳米粒子的TEM图。
图3为实施例1中步骤（2）的金纳米粒子其过氧化氢模拟酶性能的TMB拉曼光图谱；其中3a为TMB的SERS拉曼光谱图；3b为 金纳米粒子+TMB的SERS拉曼光谱图； 3c图金纳米粒子+TMB+H2O2的SERS光谱图。
图4 是为实施例步骤（4）中的2种不同肿瘤标记物的各浓度的SERS拉曼光谱图及SERS强度变化与抗原浓度关系的拟合曲线图。
其中，图4a和4c是SiO2光子晶体编码微球检测不同浓度的CEA(a)和AFP(c)的SERS拉曼光谱图；b和d图是以1605 cm-1处的峰为参考峰得到的CEA和AFP的SERS强度变化的拟合曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1
（1）制备SiO2光子晶体编码微球：
将单分散SiO2纳米粒子分散在去离子水中，利用协流式微流控装置在二甲基硅油中收集SiO2液滴，等所有液滴沉降后，收集静置于60℃烘箱内2-3天，使液滴中水分蒸发形成SiO2光子晶体微球。取出SiO2光子晶体微球，洗净后自然吹干，置于马弗炉经750℃高温煅烧2 h，得到 SiO2光子晶体编码微球，本实施例中的分别得到粒径为230nm和280nm两种编码的SiO2光子晶体编码微球。
（2）不同编码的固相免疫基底的制备：分别取样多份0.0075 g前述两种编码的SiO2光子晶体微球中加入质量分数为98%的H2SO4溶液和H2O2的混合溶液1 mL(其中，H2SO4/H2O2体积比7:3)，浸泡12h，然后用超纯水洗涤3次，再用N2吹干，得到修饰上羟基基团的SiO2光子晶体微球；接着向每份微加入1 mL 1 % GPTMS的甲苯溶液，浸泡12h使其硅烷化，接着用甲苯和无水乙醇分别洗涤微球三次后用N2吹干，分别得到修饰上活化环氧基团的功能化SiO2光子晶体微球；最后向每份取样230nm的功能化SiO2光子晶体微球中分别加入200 µL的CEA包被用抗体的磷酸盐缓冲溶液(0.5 mg/mL)，向每份取样的280nm的功能化SiO2光子晶体微球中分别加入200 µL的AFP包被用抗体的磷酸盐缓冲溶液(0.5 mg/mL)，置于摇床中，37℃条件下反应2 h后于4℃冰箱中静置12h，分别将两种包被用抗体修饰在功能化不同编码的SiO2光子晶体微球的表面；将微球样品从冰箱中取出并用磷酸盐缓冲溶液洗净后，加入100 µL的1 %的牛血清蛋白室温下封闭2 h，得到不同编码的固相免疫基底的SiO2微球，将微球分别用磷酸盐缓冲溶液洗净后待用。本步的两种编码的固相免疫基底的SiO2微球的扫描电镜图、相应的反射光谱图和显微镜如图1所示，其中图1a的左图为粒径为230 nm的SiO2 编码光子晶体的CEA抗体免疫基底的电镜扫描图，右图反射光谱图曲线为反射峰位置约为510 nm时的偏光显微镜下中心为绿色的照片，图1b为粒径为280 nm的 SiO2 编码光子晶体的AFP抗体免疫基底的电镜扫描图，右图反射光谱图曲线为反射峰位置约为600 nm时的偏光显微镜下中心为红色的照片。
（3）制备修饰不同抗体的金纳米粒子：分别取样200 µL浓度为0.5 mg/mL的CEA标记用抗体的磷酸盐缓冲溶液和200 µL浓度为0.5 mg/mL 的AFP标记用抗体的磷酸盐缓冲溶液，每种溶液中分别加入200 µL制备好的粒径为10～30 nm的金纳米粒子磷酸盐缓冲溶液(0.5 mg/mL)，置于摇床中，37℃条件下反应2 h后，于4℃冰箱环境内静置12h，然后取出静置样本，离心除去未反应的抗体，加入100 µL的1 %的牛血清蛋白室温下封闭2 h，分别得到两种修饰不同抗体的金纳米粒子。如图2所示，为本实施例的金纳米粒子的TEM图。
图3 是本实施例中的金纳米粒子过氧化氢模拟酶性能的拉曼曲线图谱。
其中曲线a是浓度为10-4 mol/L的TMB溶液的拉曼信号曲线图谱，曲线b为TMB溶液中加入金纳米粒子拉曼信号曲线图谱，曲线c为继续加入H2O2后的拉曼信号曲线图谱，从图片的曲线a、b、c显示，单独的TMB所产生的拉曼信号很弱，在TMB和金纳米粒子混合溶液所产生的拉曼信号得到了一定的增强，这是因为金纳米粒子具有SERS性能，可以增强TMB的拉曼信号；在H2O2存在的条件下，金纳米粒子会将非活性的TMB氧化成活性的TMB，从而大大的增强了TMB的拉曼信号。另外，试验中当金纳米粒子与TMB单独混合时，混合液颜色为粉红色；一旦加入H2O2后，金纳米粒子发挥其过氧化氢模拟酶性能，颜色变为紫色。
（4）多组分肿瘤标志物(生物分子或抗原)的SERS检测：分别配置1 mL一系列以磷酸盐缓冲液为溶剂的抗原浓度分别为1×10-3ng/mL、1×10-2 ng/mL、1×10-1 ng/mL、1ng/mL、10 ng/mL、1×102 ng/mL、1×103 ng/mL的CEA和AFP抗原混合溶液，其中，每一种浓度的混合液中CEA和AFP抗原的质量比为1:1；将步骤2)制得的两种不同编码抗体的SiO2光子晶体微球（每种微球的取样量0.0075 g）同时置于每一抗原浓度的混合溶液中，各混合液分别于37℃条件下温浴反应1 h，再用磷酸盐缓冲溶液洗净微球备用；向每种混合液中分别加入步骤（3）中制得的两种修饰相应抗体的金纳米粒子，得到三明治免疫夹心结构的微球混合液，于37℃条件下温浴反应60min，磷酸盐缓冲溶液冲洗3次后，滴加1 mL H2O2和（TMB浓度为10-4mol/L）的混合溶液，37℃条件下活化30 min后立即进行SERS检测，各浓度抗原对应的SERS检测图谱如图4a和4c所示，图4b和4d所示为对应不同抗原浓度的以1605 cm-1处的峰为参考峰得到的CEA和AFP浓度与SERS强度变化的标准曲线图。从该图可以看出，本方法可检测的抗原浓度范围较宽，线性拟合关系良好。
按本实施例的方法进行至少含有上述两种抗原之一的未知浓度的肿瘤标志物的SERS检测，直接采用前述（1）、（2）、（3）过程制备的各产物，将未知肿瘤标志物抗原溶液按本实施例(4)的过程制备三明治夹心结构的微球混合液，进行温浴、冲洗、滴加H2O2和TMB（浓度为10-4mol/L）的混合溶液，37℃条件下活化30 min后立即进行SERS检测和解码，根据解码信息，确定肿瘤标志物抗原的种类，根据SERS检测的拉曼信号强度确定抗原的浓度，从而实现未知浓度多种生物分子抗原也就是肿瘤标志物的检测。
实施例2：
（1）制备SiO2光子晶体编码微球：
同实施例1中的制备方法，分别制备粒径为230nm和280nm两种编码的SiO2光子晶体编码微球。
（2）固相免疫基底的制备：分别取样多份0.0075 g前述两种编码的SiO2光子晶体微球中加入质量分数为98%的H2SO4和H2O2混合溶液1mL(其中H2SO4与H2O2体积比7:5)，浸泡10h，然后用超纯水洗涤三次后用N2吹干，修饰上羟基基团的SiO2光子晶体微球。接着加入1%GPTMS的甲苯溶液1mL，继续浸泡12 h使其硅烷化，接着用甲苯和无水乙醇分别洗涤三次后用N2吹干，修饰上活化环氧基团。最后230nm向功能化SiO2光子晶体微球中分别加入200 µLCA125包被用抗体的磷酸盐缓冲溶液(0.5 mg/mL)，向2800nm向功能化SiO2光子晶体微球中分别加入200 µL CA199包被用抗体的磷酸盐缓冲溶液(0.5 mg/mL)，均置于摇床中，37℃条件下反应2 h后4℃过夜，将分别将包被用抗体修饰在不同编码的功能化SiO2光子晶体微球的表面；将微球取出并用磷酸盐缓冲溶液洗净后，分别加入100 µL的1 %的牛血清蛋白室温下封闭2 h，将封闭好的微球用磷酸盐缓冲溶液洗净后待用。
（3）制备修饰抗体的金纳米粒子：分别取样在200 µL浓度为2.5 mg/mL的CA125标记用抗体的磷酸盐缓冲液和200µL浓度为2.5 mg/mL的CA199标记用抗体的磷酸盐缓冲溶液(0.5 mg/mL)，每种溶液内分别加入400 µL制备好的金纳米粒子磷酸盐缓冲溶液(2.5 mg/mL)，置于摇床中，37℃条件下反应2 h后4℃过夜，第二天离心除去未反应的抗体，同样加入100 µL的1 %的牛血清蛋白室温下封闭2 h；
（4）多组分肿瘤标志物的SERS检测：配置一系列体积为1 mL不同浓度(1×10-4~1×102 ng/mL) CA125和CA199抗原混合溶液，（其中每种浓度的混合液中CA125和CA199抗原的质量比例为1：1），将（2）中制备的两种不同编码的固定有抗体的SiO2光子晶体微球各0.0075 g置于混合抗原溶液中，30℃条件下温浴反应50 min，用磷酸盐缓冲洗液洗净微球备用。同时再加入（3）中制得的修饰了相应抗体的金纳米粒子，得到三明治夹心结构的微球混合液，30℃条件下温浴反应50 min，用磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，滴加1mL的H2O2和TMB混合溶液（其中TMB浓度为10-4mol/L），37℃条件下活化25 min后进行SERS检测同样得到类似于图4的SERS检测图谱和抗原浓度与SERS强度变化的标准曲线图，进行未知浓度的CA125和CA199标志物的检测和解码。
本发明并不局限于上述实施例所述抗体的修饰和抗体的检测，也并仅局限于同时进行两种标志物分子浓度的检测。例如步骤（1）中，可以制备三种或三种以上不同粒径的SiO2光子晶体编码微球，步骤（2）中，每种编码微球修饰一种抗体，步骤（3）中，再分别修饰对应抗体的金纳米粒子，然后再制备步骤（4）中的相应的多组份的三明治免疫夹心微球，进行SERS检测和解码，进行相应的多组份标志物分子浓度的检测。
Claims (10)
1.一种基于模拟酶信号放大的多元SERS生物检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）制备SiO2固相免疫基底：
1.1）分别取样不同编码的SiO2光子晶体编码微球，并加入H2SO4和H2O2混合溶液中，浸泡10～16h，滤出微球，用超纯水洗绦后，再用N2吹干得到修饰羟基基团的功能化微球，再向功能化微球中加入质量浓度为1% GPTMS的甲苯溶液，浸泡10～16h，使其硅烷化，再用甲苯和无水乙醇洗涤后用N2吹干，得到活化的不同编码的SiO2功能微球；
1.2）按一种编码对应一种抗体分别配制：分别向活化的每一种编码的SiO2功能微球中加入浓度为0.5 mg/mL的相应抗体的磷酸盐缓冲溶液中，置于37℃摇床温浴2h，再转于4℃冰箱静置10～16 h，最后用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次；加入1%牛血清蛋白室温下封闭2h以上，将封闭好的微球用磷酸盐缓冲溶液清洗并保存，分别得到不同编码的SiO2固相免疫基底；
2）制备修饰抗体的金纳米粒子：将抗体浓度为0.5～2.5mg/mL的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.5 ～2.5mg/mL金纳米粒子的磷酸盐缓冲溶液混合，37℃下置于摇床中反应2 h，接着转于4℃冰箱静置过夜；加入质量浓度为1%牛血清蛋白溶液室温下封闭2 h，得到修饰抗体的金纳米粒子；
3）多元SERS生物检测方法：分别配置一系列以磷酸盐缓冲液为溶剂的不同浓度的抗原混合溶液n份，将步骤1.2)中得到的每一种编码SiO2固相免疫基底分别同时与同一种浓度的抗原混合溶液按2～20 mg/mL比例混合，得到混合液A1，分别取样每一种浓度的抗原溶液重复配制得到混合液A2～An，温浴反应混合液后，分别加入步聚2）得到修饰抗体的金纳米粒子，分别形成三明治免疫夹心结构微球混合液，温浴反应后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，加入H2O2和拉曼报告分子TMB的混合溶液进行分子活化后，置于激光共焦拉曼光谱仪下，切换光路，通过金纳米粒子的双重SERS信号放大，对SiO2光子晶体编码微球表面的拉曼信号进行检测和解码，通过编码信息来确定待测生物分子抗原的种类，利用检测拉曼信号信息确定待测生物分子抗原的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于模拟酶信号放大的多元SERS生物检测方法，其特征在于，步骤 1.1）中H2SO4和H2O2按体积比为7：3～5混合，其中H2SO4的质量浓度为95～98%，所述SiO2光子晶体微球与H2SO4和H2O2混合溶液的用量比例为5～20 mmg/mL；活化SiO2功能微球与抗体浓度为0.5 mg/mL的磷酸盐缓冲溶液的用量比例为30～50 mg/mL。
3.根据权利要求1所述的基于模拟酶信号放大的多元SERS生物检测方法，其特征在于，步骤1.1）中，SiO2光子晶体编码微球通过如下方法制备：
将粒径范围为230~280 nm单分散的SiO2纳米粒子分散在去离子水中，利用协流式微流控装置在二甲基硅油中收集SiO2液滴，待所有液滴沉降后，收集沉降层静置于60℃烘箱内2-3天，蒸发掉液滴中的水分形成SiO2光子晶体微球；
再将SiO2光子晶体微球，先后用正己烷和乙醇洗涤洗净后自然吹干，再置于马弗炉经750℃高温煅烧2 h，得到不同粒径不同编码的SiO2光子晶体编码微球。
4.根据权利要求1所述的基于模拟酶信号放大的多元SERS生物检测方法，其特征在于，所述步骤2）中，金纳米粒子的粒径为10～30 nm。
5.根据权利要求1所述的的基于模拟酶信号放大的多元SERS生物检测方法，其特征在于，步骤2）中，磷酸盐缓冲溶液的抗体溶液与金纳米粒子的磷酸盐缓冲溶液的体积比为1∶1～3。
6.根据权利要求1所述的的基于模拟酶信号放大的多元SERS生物检测方法，其特征在于，步骤 1）和步骤2）中牛血清蛋白溶液与所封闭的混合液的用量比例为1～3∶1。
7.根据权利要求1所述的的基于模拟酶信号放大的多元SERS生物检测方法，其特征在于，步骤3）中所加入的修饰抗体的金纳米粒子与磷酸盐缓冲液的浓度比例为0.5～2.5mmol/L，与混合液A的体积混合比例为：1：1。
8.根据权利要求1所述的的基于模拟酶信号放大的多元SERS生物检测方法，其特征在于，步骤3）中，温浴反应温度为25～37℃，温浴时间为30～60 min，活化时间为5～30 min。
9.根据权利要求1所述的的基于模拟酶信号放大的多元SERS生物检测方法，其特征在于，步骤3）中，所述待测生物分子抗原为所述待测生物分子抗原为CEA、AFP、IgG、CA125、CA199、CA211和/或CA724。
10.根据权利要求1所述的的基于模拟酶信号放大的多元SERS生物检测方法，其特征在于，步骤3），H2O2和拉曼报告分子TMB混合液中拉曼报告分子的浓度为10-4moL/L，相对三明治免疫夹心结构微球混合液的体积比为1:1。
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