KR101356798B1 - 금 나노입자의 성장 유도물질의 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 금 나노입자 성장 유도물질의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 금 나노입자 성장 유도물질에 의해 유도되는 금 나노입자의 성장과 형광 나노입자의 형광신호 저하를 이용하여 고감도로 금 나노입자 성장 유도물질을 용이하게 검출할 수 있는 금 나노입자 성장 유도물질의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 금 나노입자의 성장 후 흡광도 변화를 측정하는 방식에 비해 높은 민감도로 금 나노입자 성장 유도물질을 검출할 수 있는 동시에 금 나노입자 성장 유도물질에 의해 유도되는 금 나노입자의 성장반응이 고체상에서 이루어져 금 나노입자 성장 유도물질을 용이하고 간단하게 측정할 수 있으며, 다양한 형광 기반 광학 바이오센서의 제조에 응용할 수 있는 효과가 있다.

Description

금 나노입자의 성장 유도물질의 검출방법{Method for Detecting Analytes Inducing Enlargement of Gold Nanoparticles}
본 발명은 금 나노입자의 성장 유도물질의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 금 나노입자 성장 유도물질에 의해 유도되는 금 나노입자의 성장과 형광 나노입자의 형광신호 저하를 이용하여 고감도로 금 나노입자 성장 유도물질을 용이하게 검출할 수 있는 금 나노입자의 성장 유도물질의 검출방법에 관한 것이다.
최근 나노기술 분야의 급진적인 발전으로 인하여, 생체인식 과정에 있어서 금속 나노입자가 주요 표지(lable)로서 참여하는 것이 가능하게 되었다 (Niemeyer CM., Angew Chem , 40:4128-4158, 2001).
예를 들어, 금속 나노입자-뉴클레오티드 접합체를 이용하여, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance), 표면-향상 라만 분산(surface-enhanced Raman scattering), 수정진동자 미소저울(quartz-crystal microbalance) 등의 방법을 통해 DNA 혼성화를 탐지할 수 있음을 입증한 연구개발 결과가 공개된 바 있다 (Cao et al ., Science , 297:1536-1540, 2002; He et al ., J Am Chem Soc, 122:9071-9077, 2000).
또한, 다양한 산화환원반응에 있어서 효소반응 동안에 생성된 H2O2와 같은 환원제에 의한 금 이온의 환원을 통해 금 나노입자가 성장할 때, 금 나노입자의 흡광도 변화를 측정함으로써, 다양한 산화환원반응 효소의 활성을 분석할 수 있음이 보고되었다 (Zayats, M. et al ., Nano Lett ., 5:21-25, 2005; Baron, R., Anal. Chem., 77:1566-1571, 2005; Xiao, Y. et al ., Angew . Chem ., Int . Ed ., 43:4519-4522, 2004).
한편, 금 나노입자의 성장 기술을 이용하여 형광 기반 광학 바이오센서를 개발하려는 연구가 지속되어 왔다 (Bultzingslowen C. et al ., Anal . Chem . Acta, 480:275-283, 2003; Pickup, J. C. et al ., Biosens . Bioelectron, 20:2555-2565, 2005). 대표적으로, 생물학적으로 분석물을 검출하기 위하여 금 나노입자를 형광-기반 어세이에 도입한 예가 있다 (Griffin, J. et al ., Chem . Eur . J., 15:342-351, 2009; Lee, S. et al ., Angew . Chem ., Int . Ed ., 47:2804-2807, 2008). 상기 형광-기반 어세이는 대부분 FRET 현상을 도입한 것으로, FRET을 기반으로 하는 검출 프로브의 디자인은 특정 방향 또는 거리에서 금속 나노입자의 배열을 조정하도록 형광분자의 변형을 필요로 하므로, 센싱 부재의 제조가 쉽지 않다 (Zhu, L. et al ., Lab Chip, 6:115-120, 2006).
이에 따라, 본 발명자는 한국공개특허 제2011-0065232호에서 금 나노입자 성장에 의한 형광저하를 이용한 고감도 분석물 검출방법을 개시한 바 있으나, 금 나노입자 성장물질과 형광염료에 금 나노입자가 분산된 형태로 존재하기 때문에 실사용자들에 대한 사용편의성이 떨어진다는 단점이 있다.
이에, 본 발명자는 금 나노입자를 이용하여 고감도이면서 용이하게 분석물을 검출할 수 있는 형광기반 센싱기술을 개발하고자 예의 노력한 결과, 형광물질이 함유된 나노입자 표면에 금 나노입자를 고정시켜 검출 프로브를 제조하고, 상기 제조된 검출 프로브에 금 나노입자 성장 유도물질을 주입한 다음, 금 나노입자 성장 유도물질이 주입된 검출 프로브의 형광신호를 측정할 경우, 미량의 금 나노입자 성장 유도물질을 용이하게 고감도로 검출할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 미량이 금 나노입자 성장 유도물질을 용이하게 고감도로 검출하기 위해 금 나노입자 성장 유도물질에 의해 유도되는 금 나노입자의 성장과 검출 프로브의 형광신호 저하를 이용하는 금 나노입자의 성장 유도물질의 검출방법 및 금 나노입자의 성장 유도물질에 의해 성장이 유도되는 금 나노입자가 고정된 검출 프로브를 포함하는 금 나노입자의 성장 유도물질 검출용 키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, (a) 형광물질이 함유된 담체 표면에 금 나노입자를 고정시켜 검출 프로브를 제조하는 단계; (b) 상기 제조된 검출 프로브에 금 나노입자 성장물질을 첨가하는 단계; (c) 상기 금 나노입자 성장물질이 첨가된 검출 프로브에 금 나노입자의 성장 유도물질을 첨가하여 검출 프로브상의 금 나노입자 성장을 유도하는 단계; 및 (d) 상기 금 나노입자의 성장이 유도된 검출 프로브의 형광 강도를 측정하여 금 나노입자의 성장 유도물질을 검출하는 단계를 포함하는, 금 나노입자의 성장 유도물질의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 형광물질이 함유된 담체 표면에 금 나노입자를 고정시켜 검출프로브를 제조하는 단계; (b) 상기 제조된 검출 프로브에 금 나노입자 성장물질 및 효소를 첨가하는 단계; (c) 상기 금 나노입자 성장물질 및 효소가 첨가된 검출 프로브에 효소기질을 첨가하여 검출 프로브상의 금 나노입자 성장을 유도하는 단계; 및 (d) 상기 금 나노입자의 성장이 유도된 검출 프로브의 형광 강도를 측정하여 효소기질을 검출하는 단계를 포함하는, 금 나노입자의 성장을 유도하는 효소기질의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 형광물질을 함유하는 담체; 및 상기 형광물질을 함유하는 담체에 고정된 금 나노입자를 포함하는 다수의 검출 프로브와 금 나노입자 성장물질을 함유하는 것을 특징으로 하는 금 나노입자 성장 유도물질 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 형광물질을 함유하는 담체; 및 상기 형광물질을 함유하는 담체에 고정된 금 나노입자를 포함하는 다수의 검출 프로브와 금 나노입자 성장물질과 효소를 함유하는 것을 특징으로 하는 효소기질 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따르면, 금 나노입자의 성장 후 흡광도 변화를 측정하는 방식에 비해 높은 민감도로 금 나노입자 성장 유도물질을 검출할 수 있는 동시에 금 나노입자 성장 유도물질에 의해 유도되는 금 나노입자의 성장반응이 고체상에서 이루어져 금 나노입자 성장 유도물질을 용이하고 간단하게 측정할 수 있으며, 다양한 형광 기반 광학 바이오센서의 제조에 응용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 금 나노입자의 성장 유도물질의 검출방법을 개략적으로 도시한 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 금 나노입자의 성장을 유도하는 효소기질의 검출방법을 개략적으로 도시한 개략도이다.
도 3은 과산화수소의 농도가 (a) 0μM, (f) 16μM 및 (h) 60μM일 때의 검출 프로브의 TEM 이미지(A), 파장에 따른 과산화수소의 농도별 형광강도 변화를 측정한 그래프(B) 및 과산화수소의 농도에 따른 검출 프로브의 표준 형광신호 저하를 측정한 그래프(C)이다.
도 4는 하이드로퀴논의 농도에 따른 검출 프로브의 표준 형광신호 저하를 측정한 그래프이다.
도 5는 금 나노입자 성장물질이 첨가되지 않은 상태(a)에서 과산화수소 존재하의 검출 프로브의 파장에 따른 형광 스펙트럼(b) 및 하이드로퀴논 존재하의 검출 프로브의 파장에 따른 형광 스펙트럼(c)을 나타낸 그래프이다.
도 6은 하이드로퀴논의 농도에 따른 검출 프로브의 표준 형광신호 저하를 측정한 그래프(a) 및 형광스펙트럼을 나타낸 그래프(b)이다.
도 7은 아세틸티오콜린의 농도에 따른 검출 프로브의 표준 형광신호 저하를 측정한 그래프이다.
도 8은 파라옥손의 농도에 따른 검출 프로브의 형광비 변화를 측정한 그래프이다.
도 9는 자외선-오전 처리된 유리 슬라이드상에 적층된 검출 프로브의 SEM 이미지(A) 및 적층된 검출 프로브가 주입된 PDMS 몰드의 사진(B)이다.
이하 본 발명에 첨부된 도면을 참조하여 발명의 실시를 위한 구체적인 내용에서는 본 발명의 바람직한 일 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 생략한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 층 또는 부재가 다른 층 또는 부재와 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 층 또는 부재가 다른 층 또는 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 층 또는 두 부재 사이에 또 다른 층 또는 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 형광물질이 함유된 담체 표면에 금 나노입자를 고정시켜 검출 프로브를 제조하는 단계; (b) 상기 제조된 검출 프로브에 금 나노입자 성장물질을 첨가하는 단계; (c) 상기 금 나노입자 성장물질이 첨가된 검출 프로브에 금 나노입자의 성장 유도물질을 첨가하여 검출 프로브상의 금 나노입자 성장을 유도하는 단계; 및 (d) 상기 금 나노입자의 성장이 유도된 검출 프로브의 형광 강도를 측정하여 금 나노입자의 성장 유도물질을 검출하는 단계를 포함하는, 금 나노입자의 성장 유도물질의 검출방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 형광물질이 함유된 나노입자 표면에 금 나노입자를 고정시켜 검출 프로브를 제조하고, 상기 제조된 검출 프로브에 금 나노입자 성장물질을 첨가한 다음, 금 나노입자 성장 유도물질을 주입하여 금 나노입자의 성장을 유도시킨다. 이때, 상기 금 나노입자 성장 유도물질은 검출 프로브에 고정된 금 나노입자의 성장을 유도시킬 수 있는 물질이면 검출가능하다.
본 발명은 전술된 바와 같이 금 나노입자 성장 유도물질의 농도에 따라 검출 프로브상의 금 나노입자가 성장 범위가 조절되고, 검출 프로브의 형광물질 방출 밴드와 성장된 금 나노입자의 흡수밴드가 중첩(overlap)되면서 형광물질의 형광 신호가 저하되는 현상을 이용하여 금 나노입자의 성장을 유도하는 금 나노입자 성장 유도물질을 정량적으로 검출하는 원리를 기반으로 한다. 또한, 본 발명은 금 나노입자가 고정되어 있는 형광 나노입자를 이용하여 고체상에서 금 나노입자 성장 유도물질을 검출하는 것을 특징으로 한다.
상기 담체는 형광물질을 함유시킬 수 있는 지지체로, 표면에 수산화기, 카르복실기, 에폭시기 또는 아민기를 가질 수 있으면 제한 없이 사용 가능하고, 바람직하게는 실리카, 알루미나(Al2O3), 티타니아(TiO2), 틴디옥사이드(SnO2), 징크옥사이드(ZnO), 아이언옥사이드(Fe2O3) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되고, 바람직하게는 실리카이다.
상기 형광물질은 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민 B 비소티오시아네이트(rhodamine B bisothiocyanate), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(Tetramethylrhodamine isothiocyanate), 에오신 5 이소티오시아네이트(Eosin 5-isothiocyanate), 플루오레세인 디아세테이트 5(6)-이소티오시아네이(Fluorescein diacetate 5(6)-isothiocyanate), 플루오레세인 디아세테이트 6-이소티오시아네이트(Fluorescein diacetate 6-isothiocyanate) 인 것이 바람직하나, 일반적으로 사용되는 유기 형광물질이라면 제한되지 않고 사용될 수 있다. 또한, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), 로다민 레드-X(Rhodamine Red-X), 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), 캐스캐이드 블루(Cascade Blue), DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole), 쿠마린류(Coumarine) 또는 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow) 등과 같이 화학적으로 변형된 유기형광물질도 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 담체에 형광물질의 함유시키는 방법은 특별히 한정되지 않으나, 형광물질을 아미노프로필트리에톡실란 등과 같은 링커(linker)로 처리한 용액과, 테트라에틸오르소실리케이트(tetraethly orthosilicate; TEOS), 테트라에톡시실란, 테트라메톡시실란, 실리케이트나트륨 등과 같은 담체 전구 물질을 혼합시켜 수행된다.
이때, 링커(linker)로 아미노프로필트리에톡시실란을 사용하는 이유는, 형광물질과 용이하게 결합할 뿐만 아니라 형광물질이 함유된 담체로부터 형광물질의 이탈을 방지할 수 있고, 담체 표면에 아미노기를 도입하기 위해서이며, 상기 아미노기는 이후 담체 표면에 금 나노입자의 도입을 용이하게 할 수 있다.
또한, 상기 형광물질이 함유된 담체는 평균 직경이 50 ~ 300nm인 나노입자이거나, 또는 두께가 10 ~ 100nm 인 층상일 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우에는 함유된 형광물질의 형광신호 효율이 현저히 낮아지는 문제점이 발생된다.
이후, 상기 형광물질이 함유된 담체는 아민기(-NH2), 티올기(-SH), 시아나이드(-CN), 이소시아나이드(-CNO), 이소티오시아나이드(-CNS), 다이설파이드(-SS-) 및 아자이드기(-N3)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 기능기로 표면을 개질시킨 다음, 금 나노입자를 고정시켜 검출 프로브로 제조한다. 이때, 형광물질이 함유된 담체 표면을 개질시키는 기능기는 금 나노입자와 강한 친화력이 있는 기능기이면 제한 없이 사용가능하다.
이와 같이 제조된 검출 프로브에는 금 나노입자 성장 유도물질 존재시 금 나노입자의 성장을 유도시키기 위해 금 나노입자 성장물질을 첨가시킨 다음, 검출대상 물질인 금 나노입자 성장 유도물질을 주입한다. 이때, 상기 금 나노입자 성장물질 100 중량부에 대하여 검출 프로브 5 ~ 80 중량부를 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 만약 금 나노입자 성장물질 100 중량부에 대하여 검출 프로브의 첨가량이 5 중량부 미만이면, 초기 형광신호가 극히 미약하고, 금 나노입자의 성장이 불균일해져 검출 능력이 현저히 저하되는 문제점이 있고, 80 중량부를 초과하면 최소 검출한도가 저하되는 문제점이 있다.
상기 금 나노입자 성장물질은 HAuCl4, NaAuCl4, AuCl3, K(AuCl4) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 금 이온 생성물질인 것을 특징으로 할 수 있으나, 금 이온을 생성할 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않고 사용가능하다.
또한, 상기 금 나노입자 성장 유도물질은 금 나노입자의 성장을 유도시킬 수 있는 물질이면 가능하고, 특히, 금 이온을 환원시킬 수 있는 물질이라면 이에 제한 없이 검출 가능하며, 바람직하게는 H2O2, hydroquinone(HQ), adrenaline, noradrenaline, dopamine, L-Dopa, mercaptosuccinic acid, 4-aminophenol, 3-aminophenol, 1,4-phenylenediamine, aniline, triethylamine, indole, 4-bromoaniline, 1-methylindole, 3-amino-1-propanol, pyridine, 3-indole propionic acid, glucine, DL-tryptophan, sodium cirate, citric acid, sodium boro hydride, hydroxylamine, HCl, acetone, oxalic acid 및 b-diketone으로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명에 따르면, 금 나노입자의 성장 후 흡광도 변화를 측정하는 방식에 비해 높은 민감도로 금 나노입자 성장 유도물질을 검출할 수 있는 동시에 금 나노입자 성장 유도물질에 의해 유도되는 금 나노입자의 성장반응이 고체상에서 이루어져 금 나노입자 성장 유도물질을 용이하고 간단하게 측정할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 형광물질이 함유된 담체 표면에 금 나노입자를 고정시켜 검출프로브를 제조하는 단계; (b) 상기 제조된 검출 프로브에 금 나노입자 성장물질 및 효소를 첨가하는 단계; (c) 상기 금 나노입자 성장물질 및 효소가 첨가된 검출 프로브에 효소기질을 첨가하여 검출 프로브상의 금 나노입자 성장을 유도하는 단계; 및 (d) 상기 금 나노입자의 성장이 유도된 검출 프로브의 형광 강도를 측정하여 효소기질을 검출하는 단계를 포함하는, 금 나노입자의 성장을 유도하는 효소기질의 검출방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 형광물질이 함유된 나노입자 표면에 금 나노입자를 고정시켜 검출 프로브를 제조하고, 상기 제조된 검출 프로브에 금 나노입자 성장물질과 효소 또는 효소기질을 첨가한다. 이때, 효소가 첨가된 경우에는 효소기질을 주입하고, 효소기질이 첨가된 경우에는 효소를 주입하여 금 나노입자의 성장을 유도시켜 효소 또는 효소기질을 검출한다.
본 발명은 전술된 바와 같이 효소기질의 농도에 따라 검출 프로브상의 금 나노입자가 성장 범위가 조절되고, 검출 프로브의 형광물질 방출밴드와 성장된 금 나노입자의 흡수밴드가 중첩(overlap)되면서 형광물질의 형광 신호가 저하되는 현상을 이용하여 금 나노입자의 성장을 유도하는 효소기질을 정량적으로 검출하는 원리를 기반으로 한다. 또한, 본 발명은 금 나노입자가 고정되어 있는 형광 나노입자를 이용하여 고체상에서 금 나노입자의 성장을 유도하는 효소기질을 검출하는 것을 특징으로 한다(도 2).
본 발명에 있어서, 상기 효소는 AChE(acetylthiocholinesterase), 콜린 옥시다제(choline oxidase), 글루코즈 옥시다제(glucose oxidase), 싸이토크롬 옥시다제 (Cytochrome oxidase), ascorbic 잔틴 옥시다제 (xanthine oxidase), 폴리페놀 옥시다제 (polyphenol oxidase), 카테콜 옥시다제 (catechol oxidase), 라이실 옥시다제 NADPH 옥시다제 (NADPH oxidase), 모노아민 옥시다제 (monoamine oxidase) 및 라카아제 (laccase)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 효소기질은 acetylthiocholine, acetylcholine, hydroquinone, glucose, adrenaline, noradrenaline, dopamine, L-Dopa, mecaptosuccinic acid, 4-aminophenol, 3-aminophenol, 1,4-phenylenediamine, aniline, triethylamine, indole, 4-bromoaniline, 1-methylindole, 3-amino-1-propanol, pyridine, 3-indole propionic acid, glucine, DL-tryptophan, Sodium cirate, citric acid, sodium boro hydride, hydroxylamine, HCl, acetone, oxalic acid 및 b-diketone로 구성된 군에서 선택되나, 효소와 효소기질과의 반응 후에 금 이온의 환원시켜 금 나노입자 성장을 유도할 수 있는 환원제 및 전자를 방출할 수 있는 효소 및 효소기질이라면 이에 국한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 금 나노입자 성장물질은 HAuCl4, NaAuCl4, AuCl3, K(AuCl4) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 금 이온 생성물질인 것을 특징으로 할 수 있으나, 금 이온을 생성할 수 있는 물질이라면 이에 국한되지 않는다.
상기 형광물질은 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민 B 이소티오시아네이트(rhodamine B isothiocyanate), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(Tetramethylrhodamine isothiocyanate), 에오신 5 이소티오시아네이트(Eosin 5-isothiocyanate), 플루오레세인 디아세테이트 5(6)-이소티오시아네이(Fluorescein diacetate 5(6)-isothiocyanate), 플루오레세인 디아세테이트 6-이소티오시아네이트(Fluorescein diacetate 6-isothiocyanate)인 것이 바람직하나, 일반적으로 사용되는 유기 형광물질이라면 제한되지 않고 사용될 수 있다. 또한, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), 로다민 레드-X(Rhodamine Red-X), 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), 캐스캐이드 블루(Cascade Blue), DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole), 쿠마린류(Coumarine) 또는 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow) 등과 같이 화학적으로 변형된 유기형광물질도 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 담체에 형광물질의 함유시킨 다음, 개질시켜 금 나노입자를 표면에 고정시키는 방법은 전술된 바와 같다.
이와 같이 제조된 검출 프로브에는 효소기질 존재시 금 나노입자의 성장을 유도시키기 위해 금 나노입자 성장물질 및 효소를 첨가시킨 다음, 효소기질을 주입한다. 이때, 금 나노입자 성장물질 100 중량부에 대하여 효소 0.01 ~ 80 중량부 및 검출 프로브 5 ~ 80 중량부를 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 만약 금 나노입자 성장물질 100 중량부에 대하여 효소의 첨가량이 0.01 중량부 미만이면, 측정한계가 현저히 낮아지는 문제점이 있고, 80 중량부를 초과하면 측정치가 불균일해지는 문제점이 있다. 또한, 금 성장용액 100 중량부에 대하여 검출 프로브의 첨가량이 5 중량부 미만이면, 초기 형광신호가 극히 미약하고, 금 나노입자의 성장이 불균일해져 검출 능력이 현저히 저하되는 문제점이 있고, 80 중량부를 초과하면 최소 검출한도가 저하되는 문제점이 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 형광물질을 함유하는 담체; 및 상기 형광물질을 함유하는 담체에 고정된 금 나노입자를 포함하는 다수의 검출 프로브와 금 나노입자 성장물질을 함유하는 것을 특징으로 하는 금 나노입자 성장 유도물질 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 금 나노입자 성장 유도물질 검출용 키트는 형광물질을 함유하는 담체; 및 상기 형광물질을 함유시킨 담체 표면에 고정된 금 나노입자를 포함하는 다수의 검출 프로브 및 금 나노입자 성장물질을 포함하며, 여기에서 상기 금 나노입자 성장 유도물질이 주입되면, 주입된 금 나노입자 성장 유도물질과 금 나노입자 성장물질이 반응하여 다수의 검출 프로브상의 금 나노입자의 성장을 유도시키고, 성장이 유도된 금 나노입자로 인하여 검출 프로브의 형광 특성을 저하시켜 금 나노입자 성장 유도물질을 검출한다. 이때, 상기 다수의 검출 프로브는 키트상에 적층되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 금 나노입자 성장 유도물질 검출용 키트는 금 나노입자 성장물질 및 분석물의 존재하에서도 검출 프로브의 적층이 유지되어 적층된 프로브의 넓은 표면적에 의한 고민감도의 센서로 사용가능하다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 형광물질을 함유하는 담체; 및 상기 형광물질을 함유하는 담체에 고정된 금 나노입자를 포함하는 다수의 검출 프로브가 적층와 금 나노입자 성장물질과 효소가 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 효소기질 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 효소기질 검출용 키트는 형광물질을 함유하는 담체; 및 상기 형광물질을 함유시킨 담체 표면에 고정된 금 나노입자를 포함하는 검출 프로브와 효소와 금 나노입자 성장물질을 포함하며, 여기에서 상기 효소기질이 주입되면, 주입된 효소기질이 효소와 반응하여 금 나노입자 성장물질을 환원시키고, 상기 환원된 금 나노입자 성장물질이 검출 프로브상의 금 나노입자의 성장을 유도시킨다. 이렇게 성장이 유도된 금 나노입자로 인하여 검출 프로브의 형광 특성을 저하시켜 효소 기질을 검출한다. 이때, 상기 다수의 검출 프로브는 키트상에 적층되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 금 나노입자 성장 유도물질의 검출방법
1-1: 형광 담체 나노입자의 제조
형광물질로 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate;이하 FITC라 함)가 코팅된 담체 나노입자의 제조는 stober의 방법을 이용하였다(W. Stober, A. Fink and E. Bohn, J. Colloid Interface Sci ., 26:62, 1968). 먼저, 무수 에탄올 1ml에 FITC 5.2ml 및 아미노프로필트리에톡실란(aminopropyltriethoxysilane; 이하 APTES라 함) 72.7㎕를 혼합한 다음 빛이 없는 질소 분위기하에서 12시간 동안 반응시켜 FITC와 APTES을 결합시켰다. 상기 결합된 FITC-APTES는 테트라에틸오르소실리케이트(tetraethly orthosilicate; TEOS) 100㎕가 함유된 에탄올 1ml에 첨가시킨 다음, 30 동안 vertex시켰다. 상기 혼합물을 5.0N의 암모늄 하이드록사이드(ammonium hydroxide) 40ml와 에탄올 100㎕를 포함하는 용액에 첨가하고, 빛이 없는 어두운 공간에서 밤새도록 교반하였다. 상기와 같이 교반된 혼합물은 15분 동안 3000rpm으로 원심분리하여 형광 담체 나노입자를 수득한 다음, 에탄올에 두 번 재분산시켰다.
1-2: 검출 프로브의 제조
실시예 1-1에서 제조된 형광 담체 나노입자 10ml를 프로필트리메톡시실란(propyltrimethoxysilane; 이하 APTMS라 함) 30㎕가 함유된 에탄올에서 환류시켜 아민기를 가지도록 개질시켰다. 상기 아민기로 개질된 형광 담체 나노입자 용액은 15분 동안 3000rpm으로 원심분리한 다음, 에탄올에 재분산시켜 세척하였다. 상기 세척된 아민기로 개질된 형광 담체 나노입자 용액 500㎕를 원심분리하고, 증류수 1ml에 분산시킨 다음, 여기에 금 나노입자(지름: 2.9±0.5nm) 용액 5㎕를 혼합하여 2시간 동안 유지시켜 금 나노입자가 고정된 형광 담체 나노입자를 수득하였다. 상기 수득된 금 나노입자가 도입된 형광 담체 나노입자는 원심분리한 후에 증류수에 현탁시켰다. 전술된 금 나노입자는 T. pham 등의 합성방법으로 제조하였다(T. Pham, J. B. Jackson, N. J. Halas and T. R. Lee, Langmuir, 18:4915, 2002).
1-3: 금 나노입자 성장 유도물질의 검출
1-3-1: 과산화수소의 검출
인산 버퍼(PB, pH 7.1, 10mM)에 실시예 1-2의 검출 프로브 용액과 HAuCl4 0.1mM을 혼합한 다음, 과산화수소를 각각 0, 0.1, 0.5, 2.0, 8.0, 16.0, 30.0 및 60.0μM으로 각각 주입시켜 형광 강도를 측정하였다. 이때, 형광 강도는 형광분광광도계(RF-5310 PC, Shimadzu, Japan)을 이용하여 측정하였으며, 검출 프로브의 이미지는 투과전자현미경(Transmission electron microscopy, JEOL 3010 HT)을 사용하여 측정하였다.
그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, 아민기로 개질된 형광 담체 나노입자 표면에 금 나노입자가 잘 고정되어 있는 것으로 나타났고, 과산화수소가 주입되기 전의 검출 프로브상의 금 나노입자의 평균 직경은 대략 2.9±0.5nm인 반면, 과산화 수소가 각각 16μM와 60μM로 주입된 경우에는 검출 프로브상의 금 나노입자의 평균 직경이 5.9±1.2nm와 8.5±1.8nm로 나타났다. 이 결과로 주입되는 과산화수소의 양에 따라 검출 프로브상의 금 나노입자가 성장됨을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3b 및 도 3c에 나타난 바와 같이, 과산화수소 농도가 증가 될수록 검출 프로브의 형광 강도가 감소되는 것으로 나타남에 따라 과산화수소(H2O2)의 첨가에 따라 검출 프로브의 형광이 변화됨을 알 수 있었다.
1-3-2: 하이드로퀴논(hydroquinone)의 검출
인산 버퍼(PB, pH 7.1, 10mM)에 실시예 1-2의 금 나노입자가 도입된 형광 담체 나노입자 검출 프로브 용액과 HAuCl4 0.1mM을 혼합한 다음, 하이드로퀴논을 다양한 농도로 주입시켜 형광 강도를 측정하였다. 이때, 형광 강도는 형광분광광도계(RF-5310 PC, Shimadzu, Japan)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 주입되는 하이드로퀴논의 농도가 증가할수록 검출 프로브의 형광이 소광되는 것으로 나타남에 따라 본 발명의 검출 프로브를 이용하여 하이드로퀴논을 정량적으로 측정할 수 있음을 확인하였다.
1-3-3: 금 나노입자 성장물질의 부재에 따른 과산화수소 및 하이드로퀴논 검출
인산 버퍼(PB, pH 7.1, 10mM)에 실시예 1-2의 금 나노입자가 도입된 형광 담체 나노입자 검출 프로브 용액에 금 나노입자 성장물질의 혼합 없이, 과산화수소(100μM) 및 하이드로퀴논(100μM)을 주입시켜 파장에 따른 형광 신호를 측정하였다. 이때, 형광 강도는 형광분광광도계(RF-5310 PC, Shimadzu, Japan)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 금 나노입자 성장물질 없이 과산화수소(b) 또는 하이드로퀴논(c)의 단독 주입은 검출 프로브의 형광 강도에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
실시예 2: 금 나노입자의 성장을 유도하는 효소기질의 검출방법
2-1: 글루코오스의 검출
인산 버퍼(PB, pH 7.1, 10mM)에 실시예 1의 금 나노입자가 도입된 형광 담체 나노입자 검출 프로브 용액과 HAuCl4 0.1mM을 혼합한 다음, 다양한 농도의 글루코오스(glucose)를 측정하기 위해 글루코스 옥시다아제(glucose oxidase, 이하, 이하 GOX라 함) 10㎍ml-1을 각각 검출 프로브가 함유된 용액에 첨가시켰다. 상기 혼합물은 15분 동안 37℃에서 배양한 다음, HAuCl4(10mM, 15㎕)를 첨가시키고, 37℃에서 10분 동안 유지시켜 형광 강도를 측정하였다. 이때, 형광 강도는 형광분광광도계(RF-5310 PC, Shimadzu, Japan)을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 글루코오스의 농도가 증가할수록 검출 프로브의 형광 강도가 저하되는 것으로 나타남에 따라 글루코오스의 첨가에 따라 검출 프로브의 형광이 변화됨을 확인할 수 있었다.
2-1: 아세틸티오콜린의 검출
인산 버퍼(PB, pH 7.1, 10mM)에 실시예 1의 금 나노입자가 도입된 형광 담체 나노입자 검출프로브 용액과 HAuCl4 0.1mM을 혼합한 다음, 아세틸티오콜린(acetylthiocholine)을 측정하기 위해 아세틸콜린 에스테라제(acetylcholine esterase, 이하 AChE라 함) 0.1㎍ml-1을 각각 금 나노입자가 도입된 형광 담체 나노입자 프로브가 함유된 용액에 첨가시켰다. 상기 혼합물은 15분 동안 37℃에서 배양한 다음, HAuCl4(10mM, 15㎕)를 첨가시키고, 37℃에서 10분 동안 유지시켜 형광분광광도계(RF-5310 PC, Shimadzu, Japan)을 이용하여 검출 프로브의 형광 강도를 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 아세틸티오콜린의 농도가 증가할수록 검출 프로브의 표준 형광이 소광되는 것으로 나타남에 따라 아세틸티오콜린의 첨가에 따라 검출 프로브의 형광이 변화됨을 확인할 수 있었다.
2-2: 파라옥손의 검출
인산 버퍼(PB, pH 7.1, 10mM)에 실시예 1의 금 나노입자가 도입된 형광 담체 나노입자 검출프로브 용액 17㎍ml-1과 AChE 0.1ngml-1을 혼합하였다. 상기 혼합물에 아세틸티오콜린(acetylthiocholine) 100μM와 HAuCl4 0.2mM를 첨가시키고, 37℃에서 20분 동안 반응시킨 다음, 다양한 파라옥손의 농도를 첨가하여 검출 프로브의 형광신호를 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 파라옥손의 농도가 증가할수록 검출 프로브의 형광비가 증가되는 것으로 나타남에 따라 파라옥손의 첨가에 따라 검출 프로브의 형광이 변화됨을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 키트 제작
본 발명의 키트는 투명하고 탄성을 갖는 폴리다이메틸실로산(polydimethylsiloxane, 이하 PDMS라 칭함) 재질을 이용하여 몰딩(molding) 방법으로 제작하였다. PDMS 몰딩을 제작하기 위해서, SYLGARDTM(Dow Corning, USA) 경화제와 실리콘 엘라스토머 베이스(1:10, v/v)를 탈 가스화한 다음 에탄올에서 20분 동안 초음파로 세척된 6인치 실리콘 웨이퍼상에 붓고, 70℃에서 6시간 동안 배양시켜 PDMS 몰딩을 제조하였다. 상기 제조된 PDMS 몰딩은 지름 1mm인 펀치(puncher)를 사용하여 천공한 다음, 자외선-오존 처리된 유리 슬라이드상에 배치시켰다. 상기 배치된 자외선-오존 처리된 유리 슬라이드상에 검출 프로브를 적층시키고 이를 주사전자현미경(SEM, Hitachi S-4800)과 microarray scanner(Axon Instrument, USA)를 통하여 적층된 검출 프로브의 형광을 측정하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 자외선-오존 처리된 유리 슬라이드상에 검출 프로브(FSN-Au NP probes로 표시)가 적층된 상태를 확인할 수 있었고, 적층된 상태에서도 검출 프로브의 형광신호 저하를 측정할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (22)

  1. 다음 단계를 포함하는, 금 나노입자의 성장 유도물질의 검출방법:
    (a) 형광물질이 함유된 담체 표면에 금 나노입자를 고정시켜 검출 프로브를 제조하는 단계;
    (b) 상기 제조된 검출 프로브에 금 나노입자 성장물질을 첨가하는 단계;
    (c) 상기 금 나노입자 성장물질이 첨가된 검출 프로브에 금 나노입자의 성장 유도물질을 첨가하여 검출 프로브상의 금 나노입자 성장을 유도하는 단계; 및
    (d) 상기 금 나노입자의 성장이 유도된 검출 프로브의 형광 강도를 측정하여 금 나노입자의 성장 유도물질을 검출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 금 나노입자의 성장 유도물질은 H2O2, hydroquinone(HQ), adrenaline, noradrenaline, dopamine, L-Dopa, mercaptosuccinic acid, 4-aminophenol, 3-aminophenol, 1,4-phenylenediamine, aniline, triethylamine, indole, 4-bromoaniline, 1-methylindole, 3-amino-1-propanol, pyridine, 3-indole propionic acid, glucine, DL-tryptophan, Sodium cirate, citric acid, sodium boro hydride, hydroxylamine, HCl, acetone, oxalic acid 및 b-diketone으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 금 나노입자의 성장 유도물질의 검출방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 금 나노입자 성장물질은 HAuCl4, NaAuCl4, AuCl3 및 K(AuCl4)으로 구성된 군에서 선택되는 금이온 생성물질의 수용액인 것을 특징으로 하는 금 나노입자의 성장 유도물질의 검출방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 형광물질은 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민 B 이소티오시아네이트(rhodamine B isothiocyanate), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(Tetramethylrhodamine isothiocyanate), 에오신 5 이소티오시아네이트(Eosin 5-isothiocyanate), 플루오레세인 디아세테이트 5(6)-이소티오시아네이(Fluorescein diacetate 5(6)-isothiocyanate), 플루오레세인 디아세테이트 6-이소티오시아네이트(Fluorescein diacetate 6-isothiocyanate) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 금 나노입자의 성장 유도물질의 검출방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 금 나노입자 고정은 형광물질이 함유된 담체 표면을 아민기, 티올기, 카르복실기, 시아나이드(-CN), 이소시아나이드(-CNO), 이소티오시아나이드(-CNS), 다이설파이드(-SS-) 및 아자이드기(-N3)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 기능기로 개질시킨 다음, 금 나노입자와 반응시켜 수행하는 것을 특징으로 하는 금 나노입자의 성장 유도물질의 검출방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계에서 금 나노입자 성장물질은 100 중량부에 대해, 검출 프로브 5 ~ 80 중량부를 첨가하는 것을 특징으로 하는 금 나노입자의 성장 유도물질의 검출방법.
  7. 다음 단계를 포함하는, 금 나노입자의 성장을 유도하는 효소기질의 검출방법:
    (a) 형광물질이 함유된 담체 표면에 금 나노입자를 고정시켜 검출프로브를 제조하는 단계;
    (b) 상기 제조된 검출 프로브에 금 나노입자 성장물질 및 효소를 첨가하는 단계;
    (c) 상기 금 나노입자 성장물질 및 효소가 첨가된 검출 프로브에 효소기질을 첨가하여 검출 프로브상의 금 나노입자 성장을 유도하는 단계; 및
    (d) 상기 금 나노입자의 성장이 유도된 검출 프로브의 형광 강도를 측정하여 효소기질을 검출하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 상기 효소는 AChE(acetylthiocholinesterase), 콜린 옥시다제(choline oxidase), 글루코즈 옥시다제(glucose oxidase), 싸이토크롬 옥시다제 (Cytochrome oxidase), 아스코르베이트 옥시다제(ascorbic oxidase), 잔틴 옥시다제(xanthine oxidase), 폴리페놀 옥시다제(polyphenol oxidase), 카테콜 옥시다제 (catechol oxidase), 라이실 옥시다제 NADPH 옥시다제(NADPH oxidase), 모노아민 옥시다제(monoamine oxidase) 및 라카아제(laccase)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 금 나노입자의 성장을 유도하는 효소기질의 검출방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 효소기질은 acetylthiocholine, acetylcholine, hydroquinone, glucose, adrenaline, noradrenaline, dopamine, L-Dopa, mecaptosuccinic acid, 4-aminophenol, 3-aminophenol, 1,4-phenylenediamine, aniline, triethylamine, indole, 4-bromoaniline, 1-methylindole, 3-amino-1-propanol, pyridine, 3-indole propionic acid, glucine, DL-tryptophan, Sodium cirate, citric acid, sodium boro hydride, hydroxylamine, HCl, acetone, oxalic acid 및 b-diketone로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 금 나노입자의 성장을 유도하는 효소기질의 검출방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 금 나노입자 성장물질은 HAuCl4, NaAuCl4, AuCl3, K(AuCl4)로 구성된 군에서 선택되는 금이온 생성물질의 수용액인 것을 특징으로 하는 금 나노입자의 성장을 유도하는 효소기질의 검출방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 형광물질은 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민 B 이소티오시아네이트(rhodamine B isothiocyanate), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(Tetramethylrhodamine isothiocyanate), 에오신 5 이소티오시아네이트(Eosin 5-isothiocyanate), 플루오레세인 디아세테이트 5(6)-이소티오시아네이(Fluorescein diacetate 5(6)-isothiocyanate), 플루오레세인 디아세테이트 6-이소티오시아네이트(Fluorescein diacetate 6-isothiocyanate) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 금 나노입자의 성장을 유도하는 효소기질의 검출방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 (a) 단계의 금 나노입자 고정은 형광물질이 함유된 담체 표면을 아민기, 티올기, 카르복실기, 시아나이드(-CN), 이소시아나이드(-CNO), 이소티오시아나이드(-CNS), 다이설파이드(-SS-) 및 아자이드기(-N3)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 기능기로 개질시킨 다음, 금 나노입자와 반응시켜 수행하는 것을 특징으로 하는 금 나노입자의 성장을 유도하는 효소기질의 검출방법.
  13. 제7항에 있어서, 상기 (b)단계에서 금 나노입자 성장물질 100 중량부에 대해 효소 0.01 ~ 80 중량부 및 검출 프로브 5 ~ 80 중량부를 첨가하는 것을 특징으로 하는 금 나노입자의 성장을 유도하는 효소기질의 검출방법.
  14. 형광물질을 함유하는 담체; 및 상기 형광물질을 함유하는 담체에 고정된 금 나노입자를 포함하는 다수의 검출 프로브와 금 나노입자 성장물질 및 금 나노입자 성장 유도물질을 함유하되, 상기 다수의 검출 프로브는 적층되어 있는 것을 특징으로 하는 금 나노입자 성장 유도물질 검출용 키트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 형광물질은 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민 B 이소티오시아네이트(rhodamine B isothiocyanate), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(Tetramethylrhodamine isothiocyanate), 에오신 5 이소티오시아네이트(Eosin 5-isothiocyanate), 플루오레세인 디아세테이트 5(6)-이소티오시아네이(Fluorescein diacetate 5(6)-isothiocyanate), 플루오레세인 디아세테이트 6-이소티오시아네이트(Fluorescein diacetate 6-isothiocyanate) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 금 나노입자 성장 유도물질 검출용 키트.
  16. 제14항에 있어서, 상기 금 나노입자 성장 유도물질은 H2O2, hydroquinone(HQ), adrenaline, noradrenaline, dopamine, L-Dopa, mercaptosuccinic acid, 4-aminophenol, 3-aminophenol, 1,4-phenylenediamine, aniline, triethylamine, indole, 4-bromoaniline,, 1-methylindole, 3-amino-1-propanol, pyridine, 3-indole propionic acid, glucine, DL-tryptophan, Sodium cirate, citric acid, sodium boro hydride, hydroxylamine, HCl, acetone, oxalic acid 및 b-diketone으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 금 나노입자 성장 유도물질 검출용 키트.
  17. 제14항에 있어서, 상기 금 나노입자 성장물질은 HAuCl4, NaAuCl4, AuCl3 및 K(AuCl4)으로 구성된 군에서 선택되는 금이온 생성물질의 수용액인 것을 특징으로 하는 금 나노입자 성장 유도물질 검출용 키트.
  18. 형광물질을 함유하는 담체; 및 상기 형광물질을 함유하는 담체에 고정된 금 나노입자를 포함하는 다수의 검출 프로브와 금 나노입자 성장물질과 효소 및 효소기질을 함유하되, 상기 다수의 검출 프로브는 적층되어 있는 것을 특징으로 하는 효소 또는 효소기질 검출용 키트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 형광물질은 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민 B 이소티오시아네이트(rhodamine B isothiocyanate), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(Tetramethylrhodamine isothiocyanate), 에오신 5 이소티오시아네이트(Eosin 5-isothiocyanate), 플루오레세인 디아세테이트 5(6)-이소티오시아네이(Fluorescein diacetate 5(6)-isothiocyanate), 플루오레세인 디아세테이트 6-이소티오시아네이트(Fluorescein diacetate 6-isothiocyanate) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 효소 또는 효소기질 검출용 키트 .
  20. 제18항에 있어서, 상기 효소는 AChE(acetylthiocholinesterase), 콜린 옥시다제(choline oxidase), 글루코즈 옥시다제(glucose oxidase), 싸이토크롬 옥시다제(Cytochrome oxidase), 아스코르베이트 옥시다제(ascorbic oxidase), 잔틴 옥시다제(xanthine oxidase), 폴리페놀 옥시다제(polyphenol oxidase), 카테콜 옥시다제(catechol oxidase), 라이실 옥시다제 NADPH 옥시다제(NADPH oxidase), 모노아민 옥시다제(monoamine oxidase) 및 라카아제(laccase)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 효소 또는 효소기질 검출용 키트.
  21. 제18항에 있어서, 상기 효소기질은 acetylthiocholine, acetylcholine, hydroquinone, glucose, adrenaline, noradrenaline, dopamine, L-Dopa, mecaptosuccinic acid, 4-aminophenol, 3-aminophenol, 1,4-phenylenediamine, aniline, triethylamine, indole, 4-bromoaniline, 1-methylindole, 3-amino-1-propanol, pyridine, 3-indole propionic acid, glucine, DL-tryptophan, Sodium cirate, citric acid, sodium boro hydride, hydroxylamine, HCl, acetone, oxalic acid 및 b-diketone로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 효소 또는 효소기질 검출용 키트.
  22. 제18항에 있어서, 상기 금 나노입자 성장물질은 HAuCl4, NaAuCl4, AuCl3, K(AuCl4)로 구성된 군에서 선택되는 금이온 생성물질의 수용액인 것을 특징으로 하는 금 나노입자 성장을 유도하는 효소 또는 효소기질 검출용 키트.
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