壳为内标的核壳纳米粒子表面增强拉曼光谱定量分析方法
技术领域
本发明涉及拉曼光谱定量分析领域,尤其涉及壳为内标的核壳纳米粒子表面增强拉曼光谱定量分析方法。
背景技术
表面增强拉曼光谱(SERS)将分子指纹信息与单分子检测相结合从而表现出了高特异性和高灵敏度的优势。此外,SERS继承了拉曼光谱的特点:分辨率高,支持多重分析,响应时间短,样品预处理要求低,可在室温和水溶液条件下方便地进行测试。近年来,SERS已成为一种极具吸引力的超灵敏定量分析方法,主要包括基于固体基底的表面分析和基于纳米颗粒溶胶的分析。SERS还被广泛用于检测蛋白质、核酸、小分子和生物医药等。然而,由于热点在增强基底上的不均匀分布以及拉曼信号容易受到周围测试条件的影响,定量SERS分析的应用受到了重现性差的挑战。
为了提高定量SERS测定的准确性和可靠性,已经报道了多种方法来解决重现性差的问题,例如比率SERS和内标法用于校正由SERS基底的物理性质变化引起的SERS强度的波动。比率SERS定量分析需要目标分析物与组装在增强基底表面上的SERS探针进行反应,通过光谱频率变化获得分析物准确的定量结果,分析物和SERS探针之间没有竞争吸附问题,但是对于给定的分析物需要合适的SERS探针与其产生反应,寻找合适的探针这一过程增加了方法的困难性,因此基于比率SERS检测模式,相对而言是受限的。在增强粒子的表面组装内标分子可以校正信号的波动并提高稳定性,同时可以解决比率SERS遇到的问题。然而,通过配位或静电相互作用,在增强的粒子表面上修饰内标分子,又会产生分析物与内标分子竞争吸附粒子表面的问题和受到微环境的影响。2015年,任斌课题组(W.Shen,X.Lin,C.Y.Jiang,C.Y.Li,H.X.Lin,J.T.Huang,S.Wang,G.K.Liu,X.M.Yan,Q.L.Zhong,B.Ren,Reliable Quantitative SERS Analysis Facilitated by Core–Shell Nanoparticleswith Embedded Internal Standards.Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,7308-7312.)合成核-壳-纳米粒子(CMS NPs)在核-壳之间嵌入内标分子,这一研究引起了许多研究者的关注。CMS NPs作为理想的内标材料用于定量SERS分析,表现出许多优异的性能:1)内标不受外界环境的影响;2)内标不会与分析物竞争吸附位点;3)CMS NPs既可用作增强基底,也可用作内标,不会影响分析物的空间分布。然而,这些纳米结构制备复杂且内标分子需要结合到金属核的表面,而且,内标分子的量控制和组装过程不容易。2016年,谭蔚泓(Y.Zhang,Y.X.Zou,F.Liu,Y.T.Xu,X.W.Wang,Y.J.Li,H.Liang,L.Chen,Z.Chen,W.H.Tan,StableGraphene-Isolated-Au-Nanocrystal for Accurate and Rapid Surface EnhancementRaman Scattering Analysis.Anal.Chem.2016,88,10611-10616.)课题组合成了一种稳定的石墨烯-隔离-金纳米晶,以石墨烯壳层为内标,提高了SERS分析的准确性,另外不需要组装内标分子的操作过程。然而,来自石墨烯的D和G峰将引入可能与分析物信号重叠的背景信号,另外,石墨烯包金纳米粒子的合成过程复杂且耗时。基于上述,目前仍然迫切需要探索可以广泛应用的新型基底和通用的内标以解决SERS定量分析遇到的问题。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的上述问题,提供一种操作简单、快速、无标记、成本低、稳定、准确、通用的壳为内标的核壳纳米粒子表面增强拉曼光谱定量分析方法。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
壳为内标的核壳纳米粒子表面增强拉曼光谱定量分析方法,包括以下步骤:
1)制备核壳结构纳米粒子,其中,金属纳米粒子为内核,普鲁士蓝或普鲁士蓝类似物为外壳,所述金属纳米粒子为金纳米粒子或银纳米粒子;
2)将步骤1)制备的核壳结构纳米粒子与多个不同浓度的标准溶液混合均匀,分别进行SERS检测,然后依据得到的不同浓度标准溶液的SERS信号与内标物的SERS信号相对强度与标准溶液浓度的关系绘制标准曲线,所述内标物为普鲁士蓝外壳或普鲁士蓝类似物外壳;
3)将核壳结构纳米粒子与待测样品溶液混合均匀,检测待测样品和内标物的SERS信号;
4)将步骤3)得到的SERS信号与步骤2)的标准曲线比较,得到待测样品的含量。
步骤1)中,所述金属纳米粒子为球形、立方体或棒状。所述金属纳米粒子的粒径为16~150nm。所述外壳的厚度为1~3nm。
本发明中,步骤2)和3)中,检测的激发光源波长为600~1000nm。
所述步骤2)和步骤3)中,内标物的SERS信号选取内标物在2155cm-1拉曼峰位移处的峰高强度。
普鲁士蓝(PB)是一种蓝色染料,由Fe(II)和Fe(III)和氰化物(-CN-)组成,具有优异的磁性、电学和光学性能,已广泛应用于储能、催化和生物医学等领域。PB是一种高灵敏度且无背景的共振拉曼标签,在拉曼静默区呈现出尖锐、信号强的单一峰(2155cm-1)。
金纳米粒子和银纳米粒子是具有显著表面等离子体共振性质的金属纳米粒子。
本发明的原理如下:
通过借用内核金属纳米粒子的高SERS活性来增强待测分析物的拉曼信号,即在具有强电磁场的金属纳米粒子上包覆一层超薄壳层PB,构成核壳纳米粒子M@PB NPs,壳层厚度控制在几个纳米以内,以保证强的SERS活性,然后将该纳米粒子与待测样品混合均匀进行拉曼测试,利用壳层作为内标信号和吸附待测物的作用,利用内层金属纳米粒子的强电磁场增强的长程效应来增强核壳纳米粒子表面的待测物样品的拉曼信号,以待测样品的拉曼特征峰与内标信号的比值对分析物浓度绘制线性关系,从而得出定量关系。
相对于现有技术,本发明技术方案取得的有益效果是:
1、本发明M@PB NPs的制备方法及原材料简单,其中内核金属纳米粒子的大小以及壳层的厚度都是可控的。
2、PB壳作为拉曼内标,纠正SERS基底热点不均和测试条件引起的信号波动,提高SERS定量分析的准确度。
3、PB壳在2155cm-1处的特征峰位于拉曼静默区,使其成为拉曼定量分析的理想内标,没有任何背景信号的干扰。
4、PB在整个拉曼光谱中呈现强而单一的峰,与常规内标的标记分子和壳层材料相比,分析物和内标PB的信号不会产生重叠。
5、M@PB NPs在强酸和高温下保持稳定,适合在复杂的基质中应用。
6、M@PB NPs由于其稳定且稳健的信号而不受光漂白或光猝灭的影响。
7、本发明扩展了SERS定量技术的应用范围,使SERS在定量分析中的普遍应用于生产科研中奠定了一定的基础,尤其是复杂生物样品的定量分析。
附图说明
图1为制备Au@PB NPs纳米粒子和检测待测物的实验流程示意图;
图2为Au@PB NPs纳米粒子的SEM图;
图3为Au@PB NPs纳米粒子的TEM图;
图4为金纳米粒子、普鲁士蓝纳米粒子和Au@PB NPs溶胶的紫外吸收光谱图;
图5为Au@PB NPs纳米粒子的拉曼光谱图;
图6为不同pH条件处理的Au@PB NPs纳米粒子的拉曼光谱图;
图7为不同温度处理的Au@PB NPs纳米粒子的拉曼光谱图;
图8为不同条件处理的Au@PB NPs纳米粒子的TEM图,其中:A为water,B为pH 2.2,C为pH 3.2,D为pH 8.0,E为25℃,F为130℃;
图9为结晶紫在有无Au@PB NPs存在下的拉曼光谱图;
图10为Au@PB NPs与不同浓度的结晶紫溶液混合均匀后的拉曼光谱图;
图11为结晶紫特征峰1617cm-的强度与结晶紫浓度对数值的关系曲线图;
图12为1617cm-的强度与内标信号2155cm-的强度比值与结晶紫浓度的对数值的关系曲线图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白,以下结合附图和实施例,对本发明做进一步详细说明。
本实施例以Au@PB NPs纳米粒子为例进行说明。
如图1所示,为Au@PB NPs纳米粒子的合成和检测分析物的实验流程示意图。
Au@PB NPs纳米粒子的具体制备方法如下:
1、16nm金种子的制备:取100mL质量分数为0.01%的氯金酸的水溶液,搅拌条件下加热至沸腾,然后加入3.0mL质量分数为1%的柠檬酸钠水溶液,并保持沸腾60min,溶液为酒红色,完全反应后自然冷却至室温,即得直径约为16nm的金纳米粒子溶胶;
2、50nm的金纳米粒子的制备:将20~30mL16nm金种子加入160mL水溶液中,然后加入2.0~5.0mL质量分数为1%的抗坏血酸和1.0~2.0mL质量分数为1%的柠檬酸钠溶液,溶液在冰浴中保持搅拌;之后,在室温下使用步进电机以0.1~1.0mL/min的速率向上述溶液中滴加10~20mL质量分数为0.005%的氯金酸的水溶液;
3、Au@PB NPs的制备:将50nm金纳米粒子溶液用浓度为0.1~1.0mM K3[Fe(CN)6]水溶液50~200μL刻蚀几分钟后,在室温下使用步进电机以0.1~1mL/min的速率将K4[Fe(CN)6]水溶液和与相同浓度的FeCl3·6H2O溶液同时滴加到上述溶液中,反应一段时间后即得到Au@PB NPs,最后通过离心(6500rpm,10min)将Au@PB NPs用超纯水洗涤三次,并将它们再分散在超纯水中。
本实施例可通过改变K4[Fe(CN)6]和FeCl3·6H2O水溶液的浓度和添加速率,得到壳层厚度约为2~12nm范围内变化的Au@PB NPs溶胶。本发明采用包覆上超薄的壳层是为了提供内标的信号,为了使待测样品获得来自内核金属纳米粒子的电磁场增强最好的效果,壳层厚度不能太厚,所以必须控制壳层是超薄的,在本实施例中,PB壳的厚度控制为1~3nm。
图2为Au@PB NPs纳米粒子的SEM图,图3为Au@PB NPs纳米粒子的TEM图。在图2中,标尺为2.0μm,在图3中,标尺为50nm。从图3中能清楚的看到金核表面包覆上了不同厚度的壳层。
Au@PB NPs溶液的紫外吸收光谱和SERS的表征:
分别对金纳米粒子、普鲁士蓝纳米粒子和Au@PB NPs溶胶测试紫外吸收光谱,以及对Au@PB NPs纳米粒子进行拉曼测试。在图4中,其中Au@PB NPs吸收峰同时具有金纳米粒子和普鲁士蓝的特征吸收峰,说明粒子制备成功;另外,Au@PB NPs纳米粒子在600~900nm范围内有强的吸收峰,说明Au@PB NPs纳米粒子可与638nm和785nm的激发光产生共振耦合作用。图5中曲线分别代表空的石英比色皿和Au@PB NPs的拉曼光谱图,图5中可看出在整个谱图中只在静默区出现了一个明显的2155cm-的碳氮三键在金上的特征拉曼谱峰,其它为石英比色皿的峰。
分别在不同pH和温度下考察Au@PB NPs的结构稳定性:
1、将体积为20μL的Au@PB NP溶液与180μL磷酸氢二钠-柠檬酸盐缓冲溶液在不同pH(2.2、3.2、4.2、5.2、6.2、7.5、8.0)下混合,120min后,将上述溶液转移到石英比色皿中进行拉曼测试,并通过TEM观察纳米粒子的形态;如图6和图8所示,粒子在pH 2.2过酸条件下,壳层有微弱析出;在碱性条件下,壳层溶解,2155cm-拉曼峰消失,出现了Au上CO的特征峰,粒子壳层信号保持稳定,结构完整的pH范围在3.2~7.5之间;
2、将体积为20μL的Au@PB NPs分别置于不同温度(50℃、100℃、130℃)的烘箱中1h,然后加入适量的水至200μL的体积然后拉曼测试,将滴有适量Au@PB NP的铜网也放入上述烘箱中,在相同温度下加热1h,然后通过TEM进行形貌表征;如图7~8所示,温度低于100℃壳层稳定存在,说明Au@PB NPs在常规的测试条件下保持结构的完整性,适合用做增强的基底和内标进行SERS定量分析。
样品的拉曼测试流程:
对于在超纯水中的SERS测试,将10~50μL不同浓度的样品与10~50μL Au@PB NPs在100~200μL水中混合15min,随后将所得溶液转移到石英池中,然后将石英池置于Xplora拉曼光谱仪上进行拉曼测试;
对于湖水和血清样品中的SERS测试,将20μL不加标或加标不同浓度的分析物的湖水或血清样品与20μL Au@PB NPs在160μL水中混合15min,随后将所得溶液转移到石英池中,然后将石英池置于Xplora拉曼光谱仪上进行拉曼测试;
在以上的SERS测试中,将每个浓度的样品平行测定3次,每次测量是2次扫描的平均值,对于所有测量,使用633nm激光,功率选择100%,曝光时间为10秒。
存在与不存在Au@PB NPs的情况下对结晶紫进行测试,比较它们在表面增强拉曼光谱上的区别:
从图9可以看出,存在Au@PB NPs的条件下,2.0×10-9mol/L的结晶紫的多个拉曼特征峰强度高于不存在Au@PB NPs的结晶紫(5.0×10-4mol/L)的拉曼峰强度。这明显的区别表明,Au@PB NP具有强的电磁场增强效果和增强因子,可提供强的SERS增强能力。
Au@PB NPs在SERS定量分析结晶紫中的应用:
将Au@PB NPs与不同浓度2.0×10-9~100.0×10-9mol/L的结晶紫溶液混合均匀,然后拉曼测试,结果如图10所示,1617和1586cm-处的峰归属环C-C伸缩,而724和799cm-处的峰归属C-H的平面外振动。另外,916和1171cm-处的峰分别归属环C-H的基本取向和面内振动的环骨架振动。随着结晶紫(CV)浓度的增加,在1617cm-处的峰强度逐渐增加,而2155cm-1峰的强度仅略微波动。如图11~12所示,分别表示1617cm-峰强度I1617cm -与Log[CV]的关系曲线图,1617cm-峰强度I1617cm -与2155cm-峰强度I2155cm -的比值I1617cm -/2155cm -和结晶紫浓度的对数(Log[CV])的关系曲线。I1617cm -/2155cm -对Log[CV]的图显示出相对更好的线性拟合关系和更高的精密度,这是使用PB作为内标的优势之处,此外,可以容易地测试2.0×10-9mol/L的结晶紫。