CN114350845A - 水稻耐储基因挖掘与分子标记开发 - Google Patents

水稻耐储基因挖掘与分子标记开发 Download PDF

Info

Publication number
CN114350845A
CN114350845A CN202210085264.6A CN202210085264A CN114350845A CN 114350845 A CN114350845 A CN 114350845A CN 202210085264 A CN202210085264 A CN 202210085264A CN 114350845 A CN114350845 A CN 114350845A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rice
storage
loc
tolerant
snp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202210085264.6A
Other languages
English (en)
Inventor
刘兴泉
胡浩
崔杰
周海芳
郑晶
丁明全
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IMMEDIATE OILS REPOSITORY ZHEJIANG PROVINCE GRAIN BUREAU
Zhejiang A&F University ZAFU
Original Assignee
IMMEDIATE OILS REPOSITORY ZHEJIANG PROVINCE GRAIN BUREAU
Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IMMEDIATE OILS REPOSITORY ZHEJIANG PROVINCE GRAIN BUREAU, Zhejiang A&F University ZAFU filed Critical IMMEDIATE OILS REPOSITORY ZHEJIANG PROVINCE GRAIN BUREAU
Priority to CN202210085264.6A priority Critical patent/CN114350845A/zh
Publication of CN114350845A publication Critical patent/CN114350845A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/20—Polymerase chain reaction [PCR]; Primer or probe design; Probe optimisation
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/10—Signal processing, e.g. from mass spectrometry [MS] or from PCR
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B50/00—ICT programming tools or database systems specially adapted for bioinformatics
    • G16B50/10—Ontologies; Annotations
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B50/00—ICT programming tools or database systems specially adapted for bioinformatics
    • G16B50/30—Data warehousing; Computing architectures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了水稻耐储基因挖掘与分子标记开发，包括以下步骤：S1、稻谷种质资源收集：选取长江中下游的主要稻谷品种材料56份，其中包含籼稻25中，粳稻31种；S2、陈化处理：以未经陈化的样品为对照，记为CK；在恒温恒湿箱(37℃、85％RH)中加速陈化5周，7周的样品，分别记为CD5，CD7，同时，对不同处理下的样品的发芽率等数量性状进行测定。通过采用本发明设计的检测方法能够根据鉴定到的耐储基因SNP设计了KASP分子标记，便于未来开发鉴定耐储品种的检测试剂盒，可通过筛选耐储的稻谷基因型、培育品质耐储的新基因型，种植适于储藏、品质更佳的稻谷品种，从而实现粮食储藏的精准调控，对减少储粮损失、保证储粮质量具有重要意义。

Description

水稻耐储基因挖掘与分子标记开发
技术领域
本发明涉及农业技术领域，具体为水稻耐储基因挖掘与分子标记开发。
背景技术
稻谷储藏过程伴随陈化将引起稻谷品质的下降，这不利于粮食储藏与供给，目前，市场上通过控制储藏环境条件减缓稻谷变质的储藏技术已十分成熟，而稻谷基因型在储粮安全中应用仍处于初步探索阶段，开发稻谷耐储性脂质相关分子标记，可通过筛选耐储的稻谷基因型、培育品质耐储的新基因型，种植适于储藏、品质更佳的稻谷品种，从而实现粮食储藏的精准调控，对减少储粮损失、保证储粮质量具有重要意义，由于稻谷品种间耐储的遗传机制复杂，决定耐储性状的基因较多且主要由微效多基因调控导致，目前对稻谷耐储性的影响机理研究尚未阐明。
发明内容
本发明的目的在于提供水稻耐储基因挖掘与分子标记开发，具备便于未来开发鉴定耐储品种的检测试剂盒的优点，解决了上述背景技术提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：水稻耐储基因挖掘与分子标记开发，包括以下步骤：
S1、稻谷种质资源收集：
选取长江中下游的主要稻谷品种材料56份，其中包含籼稻25中，粳稻31种；
S2、陈化处理：
以未经陈化的样品为对照，记为CK；在恒温恒湿箱(37℃、85％RH)中加速陈化5周，7周的样品，分别记为CD5，CD7，同时，对不同处理下的样品的发芽率、脂肪酸值、丙二醛含量、电导率等数量性状进行测定；
S3、耐储表型鉴定：
对水稻样品的DNA进行提取，DNA样品经检测合格后进行文库构建，库检合格后上机测序，采用Illumina HiSeq/MiSeqe测序，测序得到的原始序列数据通过FASTQ进行测序数据质控分析，通过Hisat2软件将测序过滤后数据与参考基因组粳稻品种日本晴比对，利用GATK软件完成对群体内样本的SNP检测开发，采用Plink软件，剔除最小等位基因频率＜5％，缺失率＞20％的基因标记SNP，共筛选高质量SNP标记353196个用于接下来的表型关联分析；
S4、全基因组关联分析(GWAS)和转录组分析：
(1)采用Gemma软件，选择单变量的混合线性模型，结合样品间亲缘关系分析结果，筛选显著关联的SNP位点；
(2)对三个环境下的表型数据分别进行关联分析，以检测在不同点稳定出现的耐储位点；
(3)显著关联SNP位点的阈值P-value为10-4，关联分析所用的SNP总数为254815个(本试验总开发353196个SNP)，根据日本晴基因组的GFF3注释文件，对SNPs的功能进行注释，采用Halpoview软件联合表型数据对目标候选基因进行单倍型分析；
(4)显著关联SNP位点：经关联分析发现，全基因组范围内稻谷基因型发芽率共关联到2071个SNP位点，其中在6号和8号染色体的关联区域上有强信号，8号染色体上1.2MB-1.5MB区域有多个SNP位点超过阈值，全基因组范围内稻谷基因型脂肪酸性状共关联到510个SNP位点，其中关联区域在1号、7号和9号染色体上有强信号，1号染色体和9号染色体信号显示有极强关联信号，全基因组范围内稻谷基因型丙二醛性状共关联到4034个SNP位点，其中在1，3，4，5，8号染色体上都有极强关联信号，全基因组范围内稻谷基因型电导率性状共关联到1510个SNP位点，其中1号2号染色体出现极强关联信号；
(5)依据表型数据选取4个具有极端耐储性的稻谷基因型进行转录组测序；
(6)耐储基因型：秀水134和浙粳96；不耐储基因型南粳9108和苏秀867，采用Trizol法提取陈化前后稻谷粉末中总RNA，并对RNA样品进行严格质控：通过琼脂糖凝胶电泳分析样品RNA完整性及是否存在DNA污染；采用NanoPhotometer检测RNA纯度；再以Qubit2.0、Agilent 2100精确定量RNA浓度、完整性，RNA质检合格后上机测序，总计获得rawdata 300G，以日本晴基因组作为参考基因组，选用Hisat2软件进行比对，利用R包Deseq2统计差异表达基因，对比水稻基因组注释项目数据库，总共注释差异基因11039个；
(7)结合转录组结果，本试验分析了GWAS筛选得到的14个耐储候选基因的表达模式，发现其中三个基因LOC_Os06g09450.8、LOC_Os01g45060.1、LOC_Os01g47350.1分别编码蔗糖合酶、多聚半乳糖醛酸酶、烯酰辅酶A水合酶异构酶家族蛋白，在耐储与不耐储基因型中表达量差异明显，耐储基因型可能通过上调表达LOC_Os06g09450.8、LOC_Os01g45060.1，为胁迫反应提供能量；
(8)显著差异基因：不耐储基因型中基因正常表达，在LOC_Os01g45060、LOC_Os01g47350和LOC_Os06g09450基因的内部共发现和耐储形状关联的位点7个(chr1_25581589、chr1_270544634、chr6_4796306、chr6_4800231、chr6_4802754、chr6_4802754、chr6_4802768)，在LOC_Os01g45060上游1000bp范围内挖掘到关联位点一个(chr1_25579324)；
S5、耐储候选基因筛选：
在耐储性状相关联的3个基因附近共发现强关联SNP位点8个，以这个8个位点为依据，共开发相应的荧光分子标记8对，结合竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive AlleleSpecific PCR，KASP)技术，对不同品种的水稻基因组DNA样品中关联到的SNPs进行进一步的验证和分型；
S6、通用荧光引物设计：
KASP需要准备：
(1)两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的Primer Mix，两条正向引物5’端分别连有不同序列的检测引物序列；
(2)带有不同荧光的两条检测引物Master Mix；3)DNA模板；
KASP反应在LightCycler480(LC480)上进行，PCR扩增反应体系和反应程序参照韦宇等[25]的方法：
将稀释好的DNA模板50—100ng·μL-1，分别加入96孔板中，配制如下反应体系进行PCR扩增反应：模板DNA5μL，2×KASP Master mix5μL，KASP标记引物0.14μL，每个孔的反应体系总体积为10.14μL；
在LightCycler480(LC480)上的PCR反应程序为：
(1)KASP热循环：94℃预变性15min；94℃变性20s；61—55℃退火延伸60s，10个循环(每个循环降低0.6℃)；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环；37℃读取1min；
(2)KASP回收：94℃变性20s；57℃延伸60s，重复步骤(1)—(2)两次(共3次)；37℃读取1min；
(3)反应结束后，根据检测的2种荧光信号来判断样本分型情况，不同的荧光信号获得不同的基因型；
S7、KASP分子标记分型：
实验结果证实这8个SNP标记均存在于耐储材料中，是水稻耐储性状QTL的可用分子标记，利用以上分子标记可以为以后得到耐储品种单株，提供依据，为后续的耐储品种的选育，打下基础。
优选的，所述步骤S3中采用DNA提取试剂盒对水稻样品的DNA进行提取。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
通过采用本发明设计的检测方法能够根据鉴定到的耐储基因SNP设计了KASP分子标记，便于未来开发鉴定耐储品种的检测试剂盒，可通过筛选耐储的稻谷基因型、培育品质耐储的新基因型，种植适于储藏、品质更佳的稻谷品种，从而实现粮食储藏的精准调控，对减少储粮损失、保证储粮质量具有重要意义。
附图说明
图1为本发明流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的部件均为通用标准件或本领域技术人员知晓的部件，其结构和原理都为本技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知。
请参阅图1，水稻耐储基因挖掘与分子标记开发，包括以下步骤：
S1、稻谷种质资源收集：
选取长江中下游的主要稻谷品种材料56份，其中包含籼稻25中，粳稻31种；
S2、陈化处理：
以未经陈化的样品为对照，记为CK；在恒温恒湿箱(37℃、85％RH)中加速陈化5周，7周的样品，分别记为CD5，CD7，同时，对不同处理下的样品的发芽率、脂肪酸值、丙二醛含量、电导率等数量性状进行测定；
S3、耐储表型鉴定：
对水稻样品的DNA进行提取，DNA样品经检测合格后进行文库构建，库检合格后上机测序，采用Illumina HiSeq/MiSeqe测序，测序得到的原始序列数据通过FASTQ进行测序数据质控分析，通过Hisat2软件将测序过滤后数据与参考基因组粳稻品种日本晴比对，利用GATK软件完成对群体内样本的SNP检测开发，采用Plink软件，剔除最小等位基因频率＜5％，缺失率＞20％的基因标记SNP，共筛选高质量SNP标记353196个用于接下来的表型关联分析，所述步骤S3中采用DNA提取试剂盒对水稻样品的DNA进行提取；
S4、全基因组关联分析(GWAS)和转录组分析：
(1)采用Gemma软件，选择单变量的混合线性模型，结合样品间亲缘关系分析结果，筛选显著关联的SNP位点；
(2)对三个环境下的表型数据分别进行关联分析，以检测在不同点稳定出现的耐储位点；
(3)显著关联SNP位点的阈值P-value为10-4，关联分析所用的SNP总数为254815个(本试验总开发353196个SNP)，根据日本晴基因组的GFF3注释文件，对SNPs的功能进行注释，采用Halpoview软件联合表型数据对目标候选基因进行单倍型分析；
(4)显著关联SNP位点：经关联分析发现，全基因组范围内稻谷基因型发芽率共关联到2071个SNP位点，其中在6号和8号染色体的关联区域上有强信号，8号染色体上1.2MB-1.5MB区域有多个SNP位点超过阈值，全基因组范围内稻谷基因型脂肪酸性状共关联到510个SNP位点，其中关联区域在1号、7号和9号染色体上有强信号，1号染色体和9号染色体信号显示有极强关联信号，全基因组范围内稻谷基因型丙二醛性状共关联到4034个SNP位点，其中在1，3，4，5，8号染色体上都有极强关联信号，全基因组范围内稻谷基因型电导率性状共关联到1510个SNP位点，其中1号2号染色体出现极强关联信号；
(5)依据表型数据选取4个具有极端耐储性的稻谷基因型进行转录组测序；
(6)耐储基因型：秀水134和浙粳96；不耐储基因型南粳9108和苏秀867，采用Trizol法提取陈化前后稻谷粉末中总RNA，并对RNA样品进行严格质控：通过琼脂糖凝胶电泳分析样品RNA完整性及是否存在DNA污染；采用NanoPhotometer检测RNA纯度；再以Qubit2.0、Agilent 2100精确定量RNA浓度、完整性，RNA质检合格后上机测序，总计获得rawdata 300G，以日本晴基因组作为参考基因组，选用Hisat2软件进行比对，利用R包Deseq2统计差异表达基因，对比水稻基因组注释项目数据库，总共注释差异基因11039个；
(7)结合转录组结果，本试验分析了GWAS筛选得到的14个耐储候选基因的表达模式，发现其中三个基因LOC_Os06g09450.8、LOC_Os01g45060.1、LOC_Os01g47350.1分别编码蔗糖合酶、多聚半乳糖醛酸酶、烯酰辅酶A水合酶异构酶家族蛋白，在耐储与不耐储基因型中表达量差异明显，耐储基因型可能通过上调表达LOC_Os06g09450.8、LOC_Os01g45060.1，为胁迫反应提供能量；
(8)显著差异基因：不耐储基因型中基因正常表达，在LOC_Os01g45060、LOC_Os01g47350和LOC_Os06g09450基因的内部共发现和耐储形状关联的位点7个(chr1_25581589、chr1_270544634、chr6_4796306、chr6_4800231、chr6_4802754、chr6_4802754、chr6_4802768)，在LOC_Os01g45060上游1000bp范围内挖掘到关联位点一个(chr1_25579324)；
S5、耐储候选基因筛选：
在耐储性状相关联的3个基因附近共发现强关联SNP位点8个，以这个8个位点为依据，共开发相应的荧光分子标记8对，结合竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive AlleleSpecific PCR，KASP)技术，对不同品种的水稻基因组DNA样品中关联到的SNPs进行进一步的验证和分型；
S6、通用荧光引物设计：
KASP需要准备：
(1)两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的Primer Mix，两条正向引物5’端分别连有不同序列的检测引物序列；
(2)带有不同荧光的两条检测引物Master Mix；3)DNA模板；
KASP反应在LightCycler480(LC480)上进行，PCR扩增反应体系和反应程序参照韦宇等[25]的方法：
将稀释好的DNA模板50—100ng·μL-1，分别加入96孔板中，配制如下反应体系进行PCR扩增反应：模板DNA5μL，2×KASP Master mix5μL，KASP标记引物0.14μL，每个孔的反应体系总体积为10.14μL；
在LightCycler480(LC480)上的PCR反应程序为：
(1)KASP热循环：94℃预变性15min；94℃变性20s；61—55℃退火延伸60s，10个循环(每个循环降低0.6℃)；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环；37℃读取1min；
(2)KASP回收：94℃变性20s；57℃延伸60s，重复步骤(1)—(2)两次(共3次)；37℃读取1min；
(3)反应结束后，根据检测的2种荧光信号来判断样本分型情况，不同的荧光信号获得不同的基因型；
S7、KASP分子标记分型：
实验结果证实这8个SNP标记均存在于耐储材料中，是水稻耐储性状QTL的可用分子标记，利用以上分子标记可以为以后得到耐储品种单株，提供依据，为后续的耐储品种的选育，打下基础，通过采用本发明设计的检测方法能够根据鉴定到的耐储基因SNP设计了KASP分子标记，便于未来开发鉴定耐储品种的检测试剂盒，可通过筛选耐储的稻谷基因型、培育品质耐储的新基因型，种植适于储藏、品质更佳的稻谷品种，从而实现粮食储藏的精准调控，对减少储粮损失、保证储粮质量具有重要意义。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (2)

1.水稻耐储基因挖掘与分子标记开发，其特征在于：包括以下步骤：
S1、稻谷种质资源收集：
选取长江中下游的主要稻谷品种材料56份，其中包含籼稻25中，粳稻31种；
S2、陈化处理：
以未经陈化的样品为对照，记为CK；在恒温恒湿箱(37℃、85％RH)中加速陈化5周，7周的样品，分别记为CD5，CD7，同时，对不同处理下的样品的发芽率、脂肪酸值、丙二醛含量、电导率等数量性状进行测定；
S3、耐储表型鉴定：
对水稻样品的DNA进行提取，DNA样品经检测合格后进行文库构建，库检合格后上机测序，采用Illumina HiSeq/MiSeqe测序，测序得到的原始序列数据通过FASTQ进行测序数据质控分析，通过Hisat2软件将测序过滤后数据与参考基因组粳稻品种日本晴比对，利用GATK软件完成对群体内样本的SNP检测开发，采用Plink软件，剔除最小等位基因频率＜5％，缺失率＞20％的基因标记SNP，共筛选高质量SNP标记353196个用于接下来的表型关联分析；
S4、全基因组关联分析(GWAS)和转录组分析：
(1)采用Gemma软件，选择单变量的混合线性模型，结合样品间亲缘关系分析结果，筛选显著关联的SNP位点；
(2)对三个环境下的表型数据分别进行关联分析，以检测在不同点稳定出现的耐储位点；
(3)显著关联SNP位点的阈值P-value为10-4，关联分析所用的SNP总数为254815个(本试验总开发353196个SNP)，根据日本晴基因组的GFF3注释文件，对SNPs的功能进行注释，采用Halpoview软件联合表型数据对目标候选基因进行单倍型分析；
(4)显著关联SNP位点：经关联分析发现，全基因组范围内稻谷基因型发芽率共关联到2071个SNP位点，其中在6号和8号染色体的关联区域上有强信号，8号染色体上1.2MB-1.5MB区域有多个SNP位点超过阈值，全基因组范围内稻谷基因型脂肪酸性状共关联到510个SNP位点，其中关联区域在1号、7号和9号染色体上有强信号，1号染色体和9号染色体信号显示有极强关联信号，全基因组范围内稻谷基因型丙二醛性状共关联到4034个SNP位点，其中在1，3，4，5，8号染色体上都有极强关联信号，全基因组范围内稻谷基因型电导率性状共关联到1510个SNP位点，其中1号2号染色体出现极强关联信号；
(5)依据表型数据选取4个具有极端耐储性的稻谷基因型进行转录组测序；
(6)耐储基因型：秀水134和浙粳96；不耐储基因型南粳9108和苏秀867，采用Trizol法提取陈化前后稻谷粉末中总RNA，并对RNA样品进行严格质控：通过琼脂糖凝胶电泳分析样品RNA完整性及是否存在DNA污染；采用NanoPhotometer检测RNA纯度；再以Qubit2.0、Agilent 2100精确定量RNA浓度、完整性，RNA质检合格后上机测序，总计获得raw data300G，以日本晴基因组作为参考基因组，选用Hisat2软件进行比对，利用R包Deseq2统计差异表达基因，对比水稻基因组注释项目数据库，总共注释差异基因11039个；
(7)结合转录组结果，本试验分析了GWAS筛选得到的14个耐储候选基因的表达模式，发现其中三个基因LOC_Os06g09450.8、LOC_Os01g45060.1、LOC_Os01g47350.1分别编码蔗糖合酶、多聚半乳糖醛酸酶、烯酰辅酶A水合酶异构酶家族蛋白，在耐储与不耐储基因型中表达量差异明显，耐储基因型可能通过上调表达LOC_Os06g09450.8、LOC_Os01g45060.1，为胁迫反应提供能量；
(8)显著差异基因：不耐储基因型中基因正常表达，在LOC_Os01g45060、LOC_Os01g47350和LOC_Os06g09450基因的内部共发现和耐储形状关联的位点7个(chr1_25581596、chr1_27054464、chr6_4796306、chr6_4800231、chr6_4802745、chr6_4802754、chr6_4802768)，在LOC_Os01g45060上游1000bp范围内挖掘到关联位点一个(chr1_25579324)；
S5、耐储候选基因筛选：
在耐储性状相关联的3个基因附近共发现强关联SNP位点8个，以这个8个位点为依据，共开发相应的荧光分子标记8对，结合竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive AlleleSpecific PCR，KASP)技术，对不同品种的水稻基因组DNA样品中关联到的SNPs进行进一步的验证和分型；
S6、通用荧光引物设计：
KASP需要准备：
(1)两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的Primer Mix，两条正向引物5’端分别连有不同序列的检测引物序列；
(2)带有不同荧光的两条检测引物Master Mix；3)DNA模板；
KASP反应在LightCycler480(LC480)上进行，PCR扩增反应体系和反应程序参照韦宇等[25]的方法：
将稀释好的DNA模板50—100ng·μL-1，分别加入96孔板中，配制如下反应体系进行PCR扩增反应：模板DNA5μL，2×KASP Master mix5μL，KASP标记引物0.14μL，每个孔的反应体系总体积为10.14μL；
在LightCycler 480(LC480)上的PCR反应程序为：
(1)KASP热循环：94℃预变性15min；94℃变性20s；61—55℃退火延伸60s，10个循环(每个循环降低0.6℃)；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环；37℃读取1min；
(2)KASP回收：94℃变性20s；57℃延伸60s，重复步骤(1)—(2)两次(共3次)；37℃读取1min；
(3)反应结束后，根据检测的2种荧光信号来判断样本分型情况，不同的荧光信号获得不同的基因型；
(4)开发分子标记序列：
Figure FDA0003487500260000041
S7、KASP分子标记分型：
实验结果证实这8个SNP标记均存在于耐储材料中，是水稻耐储性状QTL的可用分子标记，利用以上分子标记可以为以后得到耐储品种单株，提供依据，为后续的耐储品种的选育，打下基础。
2.根据权利要求1所述的水稻耐储基因挖掘与分子标记开发，其特征在于：所述步骤S3中采用DNA提取试剂盒对水稻样品的DNA进行提取。
CN202210085264.6A 2022-01-25 2022-01-25 水稻耐储基因挖掘与分子标记开发 Withdrawn CN114350845A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210085264.6A CN114350845A (zh) 2022-01-25 2022-01-25 水稻耐储基因挖掘与分子标记开发

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210085264.6A CN114350845A (zh) 2022-01-25 2022-01-25 水稻耐储基因挖掘与分子标记开发

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114350845A true CN114350845A (zh) 2022-04-15

Family

ID=81093693

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210085264.6A Withdrawn CN114350845A (zh) 2022-01-25 2022-01-25 水稻耐储基因挖掘与分子标记开发

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114350845A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108103235B (zh) 一种苹果砧木抗寒性鉴定的snp分子标记、引物及其应用
CN115029451B (zh) 一种绵羊液相芯片及其应用
CN114657238B (zh) 一种枸杞40k液相芯片及应用
CN105525000B (zh) 一种基于QTL-seq发掘东乡野生稻耐冷基因的方法
CN111088382B (zh) 一种玉米全基因组snp芯片及其应用
CN109554493A (zh) 一种梅花垂枝性状紧密连锁的snp分子标记及其检测方法与应用
CN110846429A (zh) 一种玉米全基因组InDel芯片及其应用
CN109402291A (zh) 一种鉴定甜瓜雌花着生部位InDel分子标记及其引物和应用
CN112289384A (zh) 一种柑橘全基因组kasp标记库的构建方法及应用
CN113564266B (zh) Snp分型遗传标记组合、检测试剂盒及用途
CN114350841A (zh) 基于全基因组测序的多态性分子标记和制备方法及应用
CN108642201B (zh) 与谷子株高性状相关的snp标记及其检测引物和应用
CN107815502B (zh) 一种鉴定菊花耐涝性的dCAPS标记开发及应用
CN117683927A (zh) 水稻抗稻瘟病基因的功能性kasp分子标记及其应用
CN109762925B (zh) 水稻抗稻瘟病广谱基因pi9的KASP分子标记及其检测方法和应用
CN107447022B (zh) 一种预测玉米杂种优势的snp分子标记及应用
CN114350845A (zh) 水稻耐储基因挖掘与分子标记开发
CN108715901B (zh) 一种与谷子株高性状相关的snp标记及其检测引物和应用
CN108642199B (zh) 与谷子旗叶长性状相关的snp标记及其检测引物和应用
CN108707684B (zh) 一种与谷子旗叶长性状相关的snp标记及其检测引物和应用
CN111705157A (zh) 用于甘蓝自交不亲和系ⅰ类s单元型筛选的pcr标记及引物
CN110616256B (zh) 一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系和应用
CN108660240B (zh) 与谷子脖长性状相关的snp标记及其检测引物和应用
CN108728566B (zh) 与谷子千粒重性状相关的snp标记及其检测引物和应用
CN117821636A (zh) 一种水稻稻瘟病抗性基因Pib的SNP分子标记及引物组和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20220415

WW01 Invention patent application withdrawn after publication