CN114350608A - 一种诱导t细胞重编程为类nk细胞的组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物及其应用，所述诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物包括维生素C和小分子化合物；所述小分子化合物包括DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰酶抑制剂或组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂中的任意一种或至少两种的组合。本发明创造性地发现维生素C能够显著促进小分子化合物诱导T细胞重编程为类NK细胞，并能够促进细胞增殖，因此将维生素C与小分子化合物进行组合，形成一种诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物。利用所述组合物诱导T细胞重编程为类NK细胞，显著地提高了重编程效率且促进了T细胞增殖，在细胞免疫治疗等领域具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物及其应用。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞是天然免疫***的重要组成部分，其杀伤活性无MHC(主要组织相容性复合体，major histocompatibility complex)限制，不依赖抗体。NK细胞是人体内最有效、活力最强的免疫细胞之一，通过NKp46等NK细胞受体(NCR)识别病毒及病毒感染细胞，参与多种病毒的免疫应答反应。
然而，由于人体内自然存在的NK细胞数量和再生能力有限，细胞来源成为限制NK细胞应用于肿瘤治疗的主要障碍。T细胞表面的T细胞受体(TCR)识别病毒感染细胞或外源抗原，并做出反应。类NK细胞不仅可以表达NCR受体如NKp46、NKp30、NKp44和NKG2D等，而且可以表达功能完整的TCR受体，同时具备T细胞和NK细胞的功能。类NK细胞具有比正常NK细胞更强的杀伤活性及更广谱的抗肿瘤效应，同时还能在体外条件下大量增殖，体外增殖的类NK细胞能在体内继续存活三周以上。将T细胞重编程为类NK细胞，为肿瘤及相关疾病的免疫治疗提供一种全新的细胞源，将极大地推动肿瘤细胞免疫治疗的发展。
目前，T细胞重编程方法主要基于转基因手段，包括慢病毒转染、PB***电转、CRISPR/cas9***敲除等，然而这些方法存在诸多缺陷，例如，慢病毒转染方式处理周期长、过程繁琐，电转方式会损失大量原代T细胞、效率较低，基因过表达或敲除过程存在脱靶几率，且以上三种方式均较难实现规模化应用，仍然不能从根本上实现体外大规模获取NK细胞的效果。此外也有研究人员采用化学小分子诱导T细胞重编程为类NK细胞，但此方法的效率一般，而且化学小分子对T细胞存在一定的毒性，因此限制了此方法的应用。
因此，如何开发一种诱导T细胞重编程为类NK细胞的方法，以提高重编程效率，且不影响或者促进T细胞的生长，成为了本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物，所述诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物包括维生素C和小分子化合物；
所述小分子化合物包括DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰酶抑制剂或组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂中的任意一种或至少两种的组合。
所述至少两种的组合例如DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰酶抑制剂的组合、组蛋白去乙酰酶抑制剂和组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂的组合、DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂的组合等，其他任意的组合方式均可。
本发明创造性地发现维生素C能够显著促进小分子化合物诱导T细胞重编程为类NK细胞，并能够促进细胞增殖。(而其他抗凋亡药物如Q-VD-Oph等对小分子化合物诱导T细胞重编程为类NK细胞的过程并无促进作用)因此将维生素C与小分子化合物进行组合，形成一种诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物。利用所述组合物诱导T细胞重编程为类NK细胞，显著地提高了重编程效率且促进了T细胞增殖，在细胞免疫治疗等领域具有重要的应用价值。
优选地，所述DNA甲基转移酶抑制剂包括地西他滨和/或GSK-3484862。
优选地，所述组蛋白去乙酰酶抑制剂包括Mocetinostat、Givinostat或Entinostat中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如Mocetinostat和Givinostat的组合、Givinostat和Entinostat的组合、Mocetinostat和Entinostat的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂包括Tazemetostat和/或GSK126。
第二方面，本发明提供一种诱导T细胞重编程为类NK细胞的方法，所述方法包括将激活的T细胞与第一方面所述的诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物共培养，得到类NK细胞。
优选地，所述维生素C的终浓度为40-60ng/mL，例如40ng/mL、42ng/mL、45ng/mL、48ng/mL、50ng/mL、52ng/mL、55ng/mL、58ng/mL、60ng/mL等。
优选地，所述地西他滨的终浓度为0.05-0.5μM，例如0.05μM、0.07μM、0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.5μM等。
优选地，所述GSK-3484862的终浓度为0.5-8μM，例如0.5μM、0.7μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.5μM、6μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM等。
优选地，所述Mocetinostat的终浓度为0.1-0.5μM，例如0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.5μM等。
优选地，所述Givinostat的终浓度为0.05-1μM，例如0.05μM、0.07μM、0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.5μM、0.55μM、0.6μM、0.65μM、0.7μM、0.75μM、0.8μM、0.85μM、0.9μM、0.95μM、1μM等。
优选地，所述Entinostat的终浓度为0.05-1μM，例如0.05μM、0.07μM、0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.5μM、0.55μM、0.6μM、0.65μM、0.7μM、0.75μM、0.8μM、0.85μM、0.9μM、0.95μM、1μM等。
优选地，所述Tazemetostat的终浓度为0.1-5μM，例如0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.5μM、0.7μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM等。
优选地，所述GSK126的终浓度为0.05-1μM，例如0.05μM、0.07μM、0.1μM、0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.5μM、0.55μM、0.6μM、0.65μM、0.7μM、0.75μM、0.8μM、0.85μM、0.9μM、0.95μM、1μM等。
优选地，所述共培养的时间为3-10天。
优选地，在所述共培养过程中，每天进行半数换液。
第三方面，本发明提供一种由第二方面所述的方法制备得到的类NK细胞，所述类NK细胞表达NK细胞受体和T细胞受体。
优选地，所述NK细胞受体包括NKp46、NKp30、NKp44或NKG2D中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如NKp46和NKp30的组合、NKp44和NKG2D的组合、NKp30和NKp44的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述NK细胞受体包括NKp46和/或NKp30。
第四方面，本发明提供如第一方面所述的诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物、如第二方面所述的诱导T细胞重编程为类NK细胞的方法或如第三方面所述的类NK细胞在制备细胞免疫治疗药物中的应用。
第五方面，本发明提供维生素C在促进小分子化合物诱导T细胞重编程为类NK细胞中的应用；
所述小分子化合物包括：DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰酶抑制剂或组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述DNA甲基转移酶抑制剂包括地西他滨和/或GSK-3484862；
优选地，所述组蛋白去乙酰酶抑制剂包括Mocetinostat、Givinostat或Entinostat中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述组蛋白甲基转移酶抑制剂EZH2包括Tazemetostat和/或GSK126。
优选地，所述类NK细胞表达NK细胞受体和T细胞受体。
优选地，所述NK细胞受体包括NKp46、NKp30、NKp44或NKG2D中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述NK细胞受体包括NKp46和/或NKp30。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地发现维生素C能够显著促进小分子化合物诱导T细胞重编程为类NK细胞，并能够促进细胞增殖，因此将维生素C与小分子化合物进行组合，形成一种诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物。利用所述组合物诱导T细胞重编程为类NK细胞，显著地提高了重编程效率且促进了T细胞增殖，在细胞免疫治疗等领域具有重要的应用价值。
附图说明
图1A是未经小分子药物诱导的CD4 T细胞NKp30和NKp46的表达结果图。
图1B是添加Vc的未经小分子药物诱导的CD4 T细胞NKp30和NKp46的表达结果图。
图1C是经DAC药物诱导的CD4 T细胞中NKp30和NKp46的表达结果图。
图1D是经Vc+DAC药物诱导的CD4 T细胞中NKp30和NKp46的表达结果图。
图1E是经GSK3484862药物诱导的CD4 T细胞中NKp30和NKp46的表达结果图。
图1F是经Vc+GSK3484862药物诱导的CD4 T细胞中NKp30和NKp46的表达结果图。
图1G是经DAC+GSK3484862药物联合诱导CD4 T细胞中NKp30和NKp46的表达结果图。
图1H是经Vc+DAC+GSK3484862药物联合诱导CD4 T细胞中NKp30和NKp46的表达结果图。
图2A是未经小分子药物诱导的CD8 T细胞NKp30和NKp46的表达结果图。
图2B是添加Vc的未经小分子药物诱导的CD8 T细胞NKp30和NKp46的表达结果图。
图2C是经DAC药物诱导的CD8 T细胞中NKp30和NKp46的表达结果图。
图2D是经Vc+DAC药物诱导的CD8 T细胞中NKp30和NKp46的表达结果图。
图2E是经GSK3484862药物诱导的CD8 T细胞中NKp30和NKp46的表达结果图。
图2F是经Vc+GSK3484862药物诱导的CD8 T细胞中NKp30和NKp46的表达结果图。
图2G是经DAC+GSK3484862药物联合诱导CD8 T细胞中NKp30和NKp46的表达结果图。
图2H是经Vc+DAC+GSK3484862药物联合诱导CD8 T细胞中NKp30和NKp46的表达结果图。
图3A是Vc对GSK-3484862诱导T细胞重编程为类NK细胞的增殖促进结果图。
图3B是Vc对DAC诱导T细胞重编程为类NK细胞的增殖促进结果图。
图3C是Vc对GSK-3484862+Mocetinostat共同诱导T细胞重编程为类NK细胞的增殖促进结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
下述实施例所涉及的材料来源如下：
脐带血来自广东省脐带血造血干细胞库；
维生素C(Vc)购自Sigma-Aldrich(美国)。
Pan T细胞分离试剂盒购自STEMCELL Technologies(加拿大)；
Transact购自德国美天旎生物技术有限公司；
地西他滨(decitabine,DAC)购自Selleck(中国，上海蓝木化工有限公司)；
GSK-3484862、Mocetinostat均购自MCE(MedChemExpress)公司；
CD3 PE-Cy7、CD4 APC-Cy7、CD8 FITC、NKp30 PE和NKp46 APC均购自BioLegend(美国)。
实施例1
人脐血原代T细胞的分离和体外培养
采用Ficoll-hypaque(聚蔗糖-泛影葡胺)密度梯度离心法从脐带血中分离单个核细胞(UCBMC)，取4×107个CD3阳性UCBMC过夜培养，细胞密度为2×106/mL，剩余UCBMC冻存；使用Pan T细胞分离试剂盒进行T细胞分选，培养一段时间获得≥4×107个CD3阳性T细胞，活率≥70％，无细菌、真菌、支原体等外源微生物污染。
实施例2
小分子药物诱导T细胞重编程
(1)取Transact激活培养36小时的T细胞，300g离心5min，用T551+5％FBS+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)+IL2(300U)重悬T细胞并调整T细胞密度为(2～3)×105个/mL；
(2)分别向重悬的T细胞中加入各组小分子药物，各药物添加的终浓度如表1所示。每天进行半数换液，并根据换液后的体积补加新的药物；以初次加药记为Day0(第0天)，持续补药到Day5(第5天)时，300g离心5min换液，之后采用T551+5％FBS+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)继续培养。
表1
实施例3
利用流式细胞术检测Vc对T细胞重编程为类NK细胞表型的影响
(1)取实施例2中表1中的各药物组诱导(即经不含Vc的GSK-3484862单组分诱导后、不含Vc的DAC单组分诱导后，不含Vc的GSK-3484862+Mocetinostat共同诱导后，以及添加Vc的DAC诱导后、添加Vc的GSK-3484862诱导后，添加Vc的GSK-3484862+Mocetinostat共同诱导后)Day6(第6天)的T细胞、未诱导处理的T细胞以及添加50ng/mL Vc的未诱导处理的T细胞各200μL，400g离心4min，弃上清后，加入50μL磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，随后分别加入CD3 PE-Cy7、CD4 APC-Cy7、CD8 FITC、NKp30 PE和NKp46 APC各0.5μL，4℃避光孵育30min；加入500μL PBS稀释抗体，400g离心4min，小心弃去上清，加入300μL PBS重悬细胞转移到流式管中，上机；
(2)应用BD-flowcyto分析软件进行数据分析，每管收取10000个细胞，计算NKp46阳性T细胞与NKp30阳性T细胞的百分比。
如图1A、图1B所示，未诱导处理组的CD4 T细胞中NKp30的表达率与添加Vc的未诱导处理组的CD4 T细胞NKp30的表达率相近；如图1C、图1D所示，DAC诱导组中CD4 T细胞中NKp30的表达率约为15.1％，而DAC+Vc组中CD4 T细胞NKp30的表达率约为22.8％；如图1E、图1F所示，GSK3484862诱导组中CD4 T细胞中NKp30的表达率约为12.6％，而GSK3484862+Vc组中CD4 T细胞NKp30的表达率约为22.9％；如图1G、图1H所示，GSK-3484862+Mocetinostat共同诱导组中CD4 T细胞中NKp30的表达率约为57.3％，而GSK-3484862+Mocetinostat+Vc共同诱导组中CD4 T细胞NKp30的表达率约为67.6％。综上，在小分子药物中添加Vc后，各组CD4 T细胞中NKp30的表达率明显有增加，充分证明了Vc对小分子药物诱导T细胞重编程为NK类细胞的显著促进作用，尤其对CD4 T细胞中NKp30的表型影响更明显。
如图2A、图2B所示，未处理组中CD8 T细胞中NKp30的表达率约为14.7％，而添加Vc的未处理组中CD8 T细胞NKp30的表达率约为10.3％；如图2C、图2D所示，DAC诱导组中CD8 T细胞中NKp30的表达率约为23.2％，而DAC+Vc组中CD8 T细胞NKp30的表达率约为47.8％，且明显开始出现NKp46的表型(从0.62％增至3.3％)；如图2E、图2F所示，GSK3484862诱导组中CD8 T细胞中NKp30的表达率约为24.6％，而GSK3484862+Vc组中CD8 T细胞NKp30的表达率约为36.7％，且同时开始明显的出现NKp46的表型(从0.56％增至5.6％)；如图2G、图2H所示，GSK-3484862+Mocetinostat共同诱导组中CD8T细胞中NKp30的表达率约为49.6％，而GSK-3484862和Mocetinostat+Vc共同诱导组中CD8 T细胞NKp30的表达率约为46.0％，Vc的加入使其NKp30的表型表达稍微降低，但是NKp46开始出现表型(从2.51％增至6.63％)。以上结果说明，在CD8 T细胞中，Vc的加入除了影响NKp30表型以外还可提升NKp46的表达。
以上结果说明：Vc本身并不能诱导T细胞重编程为类NK细胞。但Vc的加入显著地促进了小分子化合物诱导T细胞重编程为类NK细胞。
实施例4
绘制细胞增殖曲线
取DAC诱导、GSK-3484862诱导、GSK-3484862+Mocetinostat共同诱导、DAC+Vc诱导、GSK-3484862+Vc诱导、以及GSK-3484862+Mocetinostat+Vc共同诱导2、4、6、10天的T细胞以及未处理的T细胞各10μL，分别与苔盼蓝10μL以1:1比例混合进行计数，绘制细胞增殖曲线。
结果如图3A、图3B、图3C所示，加入Vc后，细胞增殖速度显著加快，说明Vc明显促进了小分子化合物诱导T细胞重编程为类NK细胞的增殖。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物，其特征在于，所述诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物包括维生素C和小分子化合物；
所述小分子化合物包括DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰酶抑制剂或组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂中的任意一种或至少两种的组合。
2.如权利要求1所述的诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物，其特征在于，所述DNA甲基转移酶抑制剂包括地西他滨和/或GSK-3484862。
3.如权利要求1或2所述的诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物，其特征在于，所述组蛋白去乙酰酶抑制剂包括Mocetinostat、Givinostat或Entinostat中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂包括Tazemetostat和/或GSK126。
4.一种诱导T细胞重编程为类NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将激活的T细胞与权利要求1-3中任一项所述的诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物共培养，得到类NK细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述维生素C的终浓度为40-60ng/mL；
优选地，所述地西他滨的终浓度为0.05-0.5μM；
优选地，所述GSK-3484862的终浓度为0.5-8μM；
优选地，所述Mocetinostat的终浓度为0.1-0.5μM；
优选地，所述Givinostat的终浓度为0.05-1μM；
优选地，所述Entinostat的终浓度为0.05-1μM；
优选地，所述Tazemetostat的终浓度为0.1-5μM；
优选地，所述GSK126的终浓度为0.05-1μM。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述共培养的时间为3-10天；
优选地，在所述共培养过程中，每天进行半数换液。
7.一种由如权利要求4-6中任一项所述的方法制备得到的类NK细胞，其特征在于，所述类NK细胞表达NK细胞受体和T细胞受体。
8.如权利要求7所述的类NK细胞，其特征在于，所述NK细胞受体包括NKp46、NKp30、NKp44或NKG2D中的任意一种或至少两种的组合。
9.如权利要求1-3中任一项所述的诱导T细胞重编程为类NK细胞的组合物、如权利要求4-6中任一项所述的诱导T细胞重编程为类NK细胞的方法或如权利要求7-8中任一项所述的类NK细胞在制备细胞免疫治疗药物中的应用。
10.维生素C在促进小分子化合物诱导T细胞重编程为类NK细胞中的应用；
所述小分子化合物包括：DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰酶抑制剂或组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂中的任意一种或至少两种的组合。
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