CN112080469B - T1肽在体外促进脐带血造血干细胞增殖中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种T1肽在体外促进脐带血造血干细胞增殖中的应用。本发明在无血清条件下，对人脐带血中的CD34+造血干细胞进行培养，同时测试T1(GPANVET)在人源脐带血造血干细胞体外扩增中的作用，发现T1肽对于人脐带血造血干细胞自我更新具有较好的促进作用。本发明还发现干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3‑L)、白介素‑6(IL‑6)和T1肽的组合培养基具有促进造血干细胞扩增和维持干细胞的比例，而且能提高造血干细胞的分化潜能，可为日后临床治疗提供新的方法。

Description

T1肽在体外促进脐带血造血干细胞增殖中的应用
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，特别涉及一种T1肽在体外促进脐带血造血干细胞增殖中的应用。
背景技术
造血干细胞(Hematopietic stem cells,HSCs)是在血液***中产生其他血细胞的干细胞，具有长期自我更新能力和分化为各类成熟血细胞的潜能。自体或同种异体移植已成功用于治疗儿童和成人患者的血液***疾病、恶性肿瘤、原发性免疫缺陷疾病和代谢异常等危害人类健康疾病。但是造血干细胞移植也受到了多种因素的限制，如骨髓造血干细胞需要高度相似的HLA配型、G-CSF动员外周血造血干细胞可能引起供体的脾脏破裂。
脐带血造血干细胞(umbilical cord blood hematopoietic stem cells，UCB-HSCs)因来源广泛、长期保存、GVHD(移植物抗宿主病)发生率低、免疫源性低等优点，成为一种有重要临床应用价值的干细胞产品。目前，UCB-HSCs临床应用的最大瓶颈是细胞数量不足，从而导致HSCs植入延迟及免疫重建延迟，进而增加了病人细菌及病毒感染的风险，增加了患者的死亡率。因此，UCB-HSCs的体外扩增是解决目前细胞数量不足的最直接方案。
HSCs的自我更新及定向分化受HSCs内部因素及外部外环境因素的双重调控。自我更新程序是一个集成过程，涉及激活和维持细胞增殖途径以及抑制分化和细胞死亡途径。内部因素主要是HSCs特异性转录因子构成的转录因子网络，外部微环境包括基质细胞、细胞因子、小分子化合物、microRNA等，此外，特殊的培养体系包括低氧、灌流培养、流加培养等，对HSCs的自我更新及定向分化也具有重要的调控作用。
按照体外扩增的方式不同，可分为两种：一种是利用基质细胞模拟骨髓中的生长环境和机构，在基质支持下进行灌流培养，能够提供造血干细胞各种生长所需的成分，调节其生长分化方向，具有较好的扩增的效果。但是此种方式的缺点也明显，成本高，培养成分复杂，后期造血干细胞分离难度大，这些都限制了该种扩增方式的推广。另一种方式，则是通过添加细胞因子或小分子化合物和胎牛血清进行造血干细胞的体外扩增，但这种方式容易出现缺氧，营养不足，血清成分复杂，影响因素增多，可能无法到达预期的扩增效果。
因此，研究和开发出一种无血清的促进造血干细胞快速扩增、安全方便、且能维持造血干细胞干性的体外培养基，具有重要的价值和应用前景。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种T1肽在体外促进脐带血造血干细胞增殖中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种脐带血造血干细胞的体外无血清扩增方法。
本发明的又一目的在于提供一种用于扩增脐带血造血干细胞的药物组合物。
本发明的再一目的在于提供一种用于扩增脐带血造血干细胞的无血清培养基。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种T1肽在体外促进脐带血造血干细胞增殖中的应用，其中，所述的T1肽的氨基酸序列如下所示：GPANVET。
所述的T1肽能够提高脐带血造血干细胞的比例和数量，以及提高造血干细胞的分化潜能(其扩增的造血干细胞的分化潜能与细胞因子FLT3-L相同)。
所述的脐带血造血干细胞为人脐带血造血干细胞；包括人脐带血造血干细胞CD34+细胞、CD34+CD38-细胞。
T1肽在制备促进脐带血造血干细胞增殖的产品中的应用，其中，所述的T1肽的氨基酸序列如下所示：GPANVET。
所述的产品包括药物、试剂盒、培养基等。
一种脐带血造血干细胞的体外无血清扩增方法，为利用含有T1肽的培养基对脐带血造血干细胞进行培养，以提高脐带血造血干细胞的比例和数量，以及提高造血干细胞的分化潜能；其中，所述的T1肽的氨基酸序列如下所示：GPANVET。
所述的脐带血造血干细胞的体外无血清扩增方法，具体包括如下步骤：先采用密度梯度离心对脐带血中的单核细胞进行预富集，然后用免疫磁珠分选法分选单核细胞中的CD34+造血干细胞，再利用含有T1肽的培养基对脐带血造血干细胞进行培养。
所述的培养基中T1肽的浓度为0～20μg/ml(不包括0)；优选为5～20μg/ml；更优选为10μg/ml。
所述的培养基为StemSpan SFEM培养基；优选为含有干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、白介素-6(IL-6)和FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3-L)的StemSpan SFEM培养基；进一步优选为含有10～100ng/ml干细胞因子，10～100ng/ml血小板生成素，10～100ng/mlIL-6和10～100ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体的StemSpan SFEM培养基；再进一步优选为含有100ng/ml干细胞因子，100ng/ml血小板生成素，20ng/ml IL-6和50ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体的StemSpan SFEM培养基。
所述的脐带血造血干细胞为人脐带血CD34+造血干细胞。
所述的脐带血造血干细胞的密度为5×104～105个/ml。
所述的培养的温度为37℃。
所述的培养的时间为7～9天；优选为7天。
一种用于扩增脐带血造血干细胞的药物组合物，包含如下组分：T1肽、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、白介素-6(IL-6)和FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3-L)；其中，T1肽的氨基酸序列如下所示：GPANVET。
所述的药物组合物优选为包含如下组分：0～20μg/ml T1肽(不包括0)，10～100ng/ml干细胞因子，10～100ng/ml血小板生成素，10～100ng/ml IL-6和10～100ng/mlFMS样酪氨酸激酶3配体。
所述的药物组合物更优选为包含如下组分：5～20μg/ml T1肽，100ng/ml干细胞因子，100ng/ml血小板生成素，20ng/ml IL-6和50ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体。
所述的用于扩增脐带血造血干细胞的药物组合物在体外促进脐带血造血干细胞增殖中的应用。
一种用于扩增脐带血造血干细胞的无血清培养基，包括如下组分：StemSpan SFEM培养基+10～100ng/ml干细胞因子+10～100ng/ml血小板生成素+10～100ng/ml IL-6+10～100ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体+0～20μg/ml T1肽(不包括0)；其中，所述的T1肽的氨基酸序列如下所示：GPANVET。
所述的无血清培养基优选为包括如下组分：StemSpan SFEM培养基+100ng/ml干细胞因子+100ng/ml血小板生成素+20ng/ml IL-6+50～100ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体+5～20μg/ml T1肽。
所述的无血清培养基进一步优选为包括如下组分：StemSpan SFEM培养基+100ng/ml干细胞因子+100ng/ml血小板生成素+20ng/ml IL-6+100ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体+10μg/ml T1肽。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明在无血清条件下，对人脐带血中的CD34+造血干细胞进行培养，同时测试T1在人源脐带血造血干细胞体外扩增中的作用，发现T1肽对于人脐带血造血干细胞自我更新具有较好的促进作用，可为日后临床治疗提供新的方法。
(2)本发明在通过对比含有SCF+TPO+IL-6、SCF+TPO+IL-6+FLT3-L、SCF+TPO+IL-6+T1因子的组合培养基，发现含有SCF+TPO+IL-6+FLT3-L+T1因子的组合培养基具有促进造血干细胞扩增和维持干细胞的比例，而且能提高造血干细胞的分化潜能。
(3)本发明提供一种可用于扩增人脐带血造血干细胞的无血清培养基，该培养基以Stemcell StemSpan培养基为基础，还包括其他成分：干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3-L)、白介素-6(IL-6)和T1肽。
附图说明
图1是不同浓度的T1肽联合SCF、TPO、IL-6处理7天后的细胞数量变化图。
图2是不同浓度的T1肽联合SCF、TPO、IL-6处理7天后的CD34+细胞比例变化图。
图3是不同浓度的T1肽联合SCF、TPO、IL-6处理7天后的CD34+CD38-细胞比例变化图。
图4是不同浓度的细胞因子组合培养脐带血的CD34+集落形成结果图。
图5是不同浓度的T1肽联合SCF、TPO、IL-6、FLT3-L处理7天后的细胞数量变化图。
图6是不同浓度的T1肽联合SCF、TPO、IL-6、FLT3-L处理7天后的CD34+细胞比例变化图。
图7是不同浓度的T1肽联合SCF、TPO、IL-6、FLT3-L处理7天后的CD34+CD38-细胞比例变化图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
1、本发明涉及的培养基及其中的成分均为常规市售产品：
①StemSpan SFEM培养基购于广州松鼠生物科技有限公司，货号为09650，STEMCELL；
干细胞因子(Human SCF；简称SCF)、血小板生成素(Human TPO；简称TPO)、白介素-6(Human IL-6；简称IL-6)、FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3-L；)等细胞因子购于广州松鼠生物科技有限公司，货号分别为：300-07-10、300-18-10、200-06-5、AF-300-19-10；
②甲基纤维素钠半固体培养基(MethoCult H4434 Classic)，购于广州聚研生物科技有限公司，货号04414，STEMCELL。
③IMDM培养基，货号C12440500BT，购于广州昂科生物科技有限公司。
2、本发明中涉及的T1短肽(GPANVET)合成于上海淘普生物科技有限公司。
3、本发明提供一种脐带血造血干细胞体外培养基，为含有10～100ng/ml SCF，10～100ng/ml TPO，10～100ng/ml IL-6，10～100ng/ml FLT3-L和0～20μg/ml T1肽的StemSpan SFEM培养基。
实施例1、干细胞因子、血小板生成素、白介素-6联合FLT3-L或不同浓度T1肽对造血干细胞体外增殖的影响
1.1试剂材料：
从暨南大学附属第一医院采集脐带血(UCB)；淋巴细胞分离液，购于广州松鼠生物科技有限公司(货号：07861，STEMCELL)；脐带血稀释buffer，购于广州誉为生物科技仪器有限公司(货号：130-091-221，Miltenyi Biotec)。
1.2实验方法：
1.2.1脐带血CD34+细胞分选和纯度鉴定
将采集的脐带血用脐带血稀释buffer稀释，再用淋巴细胞分离液进行单核细胞分离，得到脐带血单核细胞，然后采用免疫磁珠细胞分选分离出CD34+细胞，并用anti-human-CD34-FITC(广州昂科生物科技有限公司，555821，BD)和anti-human-CD38-APC(广州昂科生物科技有限公司，555462，BD)对分选的细胞进行流式细胞纯度鉴定。
1.2.2脐带血CD34+造血干细胞体外扩增
(1)将免疫磁珠分选后的细胞悬液离心，300g离心8分钟，弃上清。
(2)细胞沉淀用StemSpan SFEM+100ng/ml SCF+100ng/ml TPO+20ng/ml IL-6培养基(均为体系终浓度)重悬，调整细胞浓度为105个/ml。每孔500μL，加入24孔板中，再往孔中加入500μL相同的培养基将培养，共6列，编号A～F，每列3个复孔。
(3)实验设置对照组和实验组，实验组在C～F列培养基加入5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml的T1肽(SITH组)，两个对照组A和B列培养基分别加入等体积的StemSpanSFEM培养基(SIT组)和100ng/ml的FLT3-L(SITF组)，以培养前(Before culture)的细胞为空白对照。轻轻震荡混匀，放入37℃，5％(v/v)CO2培养箱中。
(4)7天后，对培养后的细胞计数，再收集培养的细胞，300g离心5min，标记抗体anti-human-CD34-FITC和anti-human-CD38-APC，室温孵育30分钟，避光。
(5)300g离心5分钟，弃去未结合的抗体，并用200μL FACS buffer重悬，进行流式细胞仪分析。
1.3结果分析
结果如图1～3所示：图1可知，与起始培养的细胞数相比，培养后的细胞数量都得到10倍以上的扩增，其中SITF组为18.28倍，SIT组为11.03倍，SITH中以10μg/ml浓度组最高，达到12.16倍，说明T1肽具有促进脐带血细胞增殖的作用。同时，由图2可知，与SITF组和SIT组相比，SITH组能提高脐带血CD34+细胞的比例，并呈现出浓度依赖性，具有显著性的差异。最后，由图3可知，T1肽在浓度为10μg/ml时，CD34+CD38-细胞的比例达到最大，高于SITF和SIT组。由此可知，T1肽能够提高CD34+CD38-脐带血造血干细胞的比例和数量。
实施例2、脐带血CD34+细胞及其培养物的集落形成实验
2.1试剂材料：
甲基纤维素钠半固体培养基(MethoCult H4434 Classic)；IMDM培养基。
2.2实验方法：
分选后的脐带血CD34+细胞(分选方法同实施例1)及不同因子组合培养后的CD34+细胞用IMDM培养基(含2％(v/v)胎牛血清(FBS))调整细胞密度为1x104个/ml，然后按照100ul细胞悬液+1ml甲基纤维素钠半固体培养基的比例混合，在涡旋器上充分混匀后，静置10～15min，然后转移到35mm培养皿并摊平培养物，放置在100mm培养皿上，每个实验组做3个重复，并在其中加入1个装有无菌水的35mm培养皿以维持整个培养过程高湿度，防止培养物干涸；将100mm皿放置到培养箱(37℃，5％CO2)。培养14天后，取出培养物，倒置显微镜下根据集落的形态学特征进行每种集落的计数，并对代表性集落进行拍照、保存及进一步分析。其中，实验分为3组：SITH：100ng/ml SCF+100ng/ml TPO+20ng/ml IL-6+10μg/ml T1肽培养的CD34+；SITF：100ng/ml SCF+100ng/ml TPO+20ng/ml IL-6+FLT3-L培养的CD34+；fresh:分选后未培养的CD34+；(图中Total:总集落数、CFU-B：红系集落、CFU-GM：粒-巨噬系集落、CFU-GEMM：粒-红-巨核-巨噬系集落)。
2.3结果分析：
结果如图4所示：由图4可知，与分选后的细胞相比，经过SITF和SITH因子组合培养的脐带血CD34+细胞，具有更高形成CFU-B、CFU-GM、CFU-GEMM等集落的能力，而且SITF组和SITH组相比较，无显著性差异，即分化潜能相似。
实施例3、干细胞因子、血小板生成素、白介素-6联合FLT3-L和不同浓度T1肽对造血干细胞体外增殖的影响
3.1试剂材料：同实施例1。
3.2实验方法：
3.2.1脐带血CD34+细胞分选和纯度鉴定：同实施例1。
3.2.2脐带血CD34+造血干细胞体外扩增
(1)将免疫磁珠分选后的细胞悬液离心，300g离心8分钟，弃上清。
(2)细胞沉淀用StemSpan SFEM+100ng/ml SCF+100ng/ml TPO+20ng/ml IL-6培养基(均为体系终浓度)重悬，调整细胞浓度为105个/ml，每孔500μL，加入24孔板中，再往孔中加入500μL相同的培养基将培养，共6列，编号A～F，每列3个复孔。
(3)实验设置对照组和实验组，实验组在C～F列培养基先在每列加入50ng/mlFLT3-L，再分别5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml的T1肽(SITFH组)。两个对照组A和B列培养基分别加入50ng/ml和100ng/ml的FLT3-L(SITF组)，以培养前(Before culture)的细胞为空白对照。轻轻震荡混匀，放入37℃，5％(v/v)CO2培养箱中。
(4)7天后，对培养后的细胞计数，再收集培养的细胞，300g离心5min，标记抗体anti-human-CD34-FITC和anti-human-CD38-APC，室温孵育30分钟，避光。
(5)300g离心5分钟，弃去未结合的抗体，并用200μL FACS buffer重悬，进行流式细胞仪分析。
3.3结果分析：
结果如图5～7所示：由图5可知，与SITF组相比，在SITFH组中，即FLT3-L浓度减半，添加T1肽，可以促进脐带血CD34+细胞的增殖；其中SITFH(0.05,5)增殖细胞数最多，与培养起始细胞数相比，达到15.96倍。由图6可知，所有组别，脐带血CD34+细胞经过培养后，细胞比例都有下降，其中SITF(0.05,0)、SITF(0.1,0)、SITFH(0.05,5)和SITFH(0.05,15)组CD34+细胞无显著性差异，而SITFH(0.05,10)和SITFH(0.05,20)组CD34+细胞比例轻微下降。由图7可知，经过培养后，脐带血造血干细胞CD34+CD38-细胞比例都得到40％左右的提升，其中以SITFH(0.05,10)组提升最大，达到42.47％。由此可知，T1肽可以与FLT3-L协同，促进脐带血造血干细胞的增殖，可以起着FLT3-L的功能。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> T1肽在体外促进脐带血造血干细胞增殖中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T1肽
<400> 1
Gly Pro Ala Asn Val Glu Thr
1 5

Claims (6)

1.一种用于扩增脐带血造血干细胞的药物组合物在体外促进脐带血造血干细胞增殖中的应用，其特征在于：
所述的脐带血造血干细胞为人脐带血造血干细胞CD34+细胞；
所述的用于扩增脐带血造血干细胞的药物组合物包含如下组分：5～20 μg/ml T1肽，100 ng/ml 干细胞因子，100 ng/ml 血小板生成素，20 ng/ml IL-6和50 ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体；
所述的T1肽的氨基酸序列如下所示：GPANVET。
2.根据权利要求书1所述的应用，其特征在于：
所述的T1肽能够提高脐带血造血干细胞的比例和数量，以及提高造血干细胞的分化潜能。
3.一种用于扩增脐带血造血干细胞的药物组合物在制备促进脐带血造血干细胞增殖的产品中的应用，其特征在于：
所述的脐带血造血干细胞为人脐带血造血干细胞CD34+细胞；
所述的用于扩增脐带血造血干细胞的药物组合物包含如下组分：5～20 μg/ml T1肽，100 ng/ml 干细胞因子，100 ng/ml 血小板生成素，20 ng/ml IL-6和50 ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体；
所述的T1肽的氨基酸序列如下所示：GPANVET。
4.一种脐带血造血干细胞的体外无血清扩增方法，其特征在于：利用含有T1肽的培养基对脐带血造血干细胞进行培养，以提高脐带血造血干细胞的比例和数量，以及提高造血干细胞的分化潜能；其中，所述的T1肽的氨基酸序列如下所示：GPANVET；
所述的脐带血造血干细胞为人脐带血造血干细胞CD34+细胞；
所述的培养基中T1肽的浓度为5～20 μg/ml；
所述的培养基为含有100 ng/ml 干细胞因子，100 ng/ml 血小板生成素，20 ng/mlIL-6和50 ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体的StemSpan SFEM培养基。
5.根据权利要求4所述的脐带血造血干细胞的体外无血清扩增方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
先采用密度梯度离心对脐带血中的单核细胞进行预富集，然后用免疫磁珠分选法分选单核细胞中的CD34+造血干细胞，再利用含有T1肽的培养基对脐带血造血干细胞进行培养；
所述的脐带血造血干细胞的密度为5×104～105个/ml；
所述的培养的温度为37℃；
所述的培养的时间为7～9天。
6.一种用于扩增脐带血造血干细胞的无血清培养基，其特征在于，包括如下组分：StemSpan SFEM培养基+100 ng/ml 干细胞因子 + 100ng/ml 血小板生成素 +20 ng/mlIL-6 +50～100 ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体 + 5～20 μg/ml T1肽；
所述的脐带血造血干细胞为人脐带血造血干细胞CD34+细胞；
所述的T1肽的氨基酸序列如下所示：GPANVET。
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