ES2965464T3 - Consorcios microbianos - Google Patents
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Abstract
En el presente documento se describen consorcios microbianos y composiciones que incluyen microbios, por ejemplo, para uso en aplicaciones agrícolas o de biodegradación. En algunas realizaciones, el suelo, las plantas y/o partes de plantas (tales como semillas, plántulas, brotes, raíces, hojas, frutos, tallos o ramas) se ponen en contacto con una composición o consorcio microbiano divulgado que incluye microbios. Los consorcios microbianos o composiciones que contienen microbios se pueden aplicar al suelo, a la planta y/o a partes de la planta solos o en combinación con componentes adicionales (tales como quitina, quitosano, glucosamina, aminoácidos y/o fertilizante líquido). En realizaciones adicionales, los consorcios microbianos o composiciones divulgados que incluyen microbios se usan en métodos de degradación de materiales biológicos, tales como materiales biológicos que contienen quitina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Consorcios microbianos
Campo
Esta divulgación se refiere a consorcios microbianos y métodos de uso de los microbios incluidos en los consorcios, particularmente para la biodegradación y los procesos y usos agrícolas.
Antecedentes
La demanda mundial de alimentos continúa aumentando bajo la presión del creciente crecimiento demográfico. Sin embargo, los trabajadores agrícolas se enfrentan a cantidades cada vez menores de tierra disponible para la agricultura, el agotamiento del suelo y cambios en las condiciones ambientales, entre otros desafíos. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar composiciones y técnicas que puedan aumentar la producción de alimentos. También es necesario hacerlo disminuyendo al mismo tiempo el uso de herbicidas, insecticidas y fungicidas potencialmente dañinos.
Sumario
En el presente documento se divulgan consorcios microbianos y composiciones que incluyen microbios, para uso en aplicaciones agrícolas o de biodegradación. En algunas realizaciones, una composición microbiana de la presente invención es el consorcio microbiano depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA) el 23 de diciembre de 2015 y número de depósito asignado PTA-122728 (denominado en el presente documento A1007), Una composición de la presente divulgación incluye células de cinco o más especies microbianas seleccionadas deBacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp.yCandida spp.Una composición de la presente divulgación incluye células de cinco o más especies microbianas seleccionadas deBacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Streptomyces spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp., yCandida spp.
La composición puede incluir además células de uno o más dePseudomonas spp., Desulfococcus spp., Desulfotomaculum spp., Marinobacter spp., Nitrosopumilus spp., Deinococcus spp., Azospirillum spp., Leptolyngbya spp., Ruminococcus spp., Acidisoma spp., Leptospirillum spp., Rhodoferax spp., Pseudomonas spp., Halorhabdus spp., Microbacterium spp., Sporosarcina spp., Nesterenkonia spp., Agrococcus spp., Xenococcus spp., Cytophaga spp., Actinomyces spp., Devosia spp., Candidatus spp., Aquabacterim spp., Bradyrhizobium spp., Microcoleus spp., Acetobacter spp., Brevibacterium spp., Methanosaeta spp.,yAcremonium spp.
En realizaciones adicionales de la divulgación, la composición incluye células de dos o más (tales como 5, 10, 15, 20, 25 o más) de los microorganismos enumerados en la Tabla 1. Las composiciones divulgadas también pueden incluir componentes adicionales, incluidos, pero sin limitación, quitina, quitosano, glucosamina, aminoácidos, fertilizantes y/o aglutinantes.
También se describen usos agrícolas de los consorcios microbianos o composiciones descritos. En algunas realizaciones, los métodos (usos) incluyen el contacto del suelo, plantas y/o partes de plantas (como semillas, plántulas, brotes, hojas, tallos o ramas) con el consorcio A1007. Los consorcios microbianos o las composiciones que contienen microbios se pueden aplicar al suelo, planta y/o partes de la planta solas o en combinación con componentes adicionales (como quitina, quitosano, glucosamina, aminoácidos y/o fertilizantes, tal como fertilizante líquido).
En realizaciones adicionales, los consorcios o composiciones microbianas divulgadas que incluyen microbios se usan en métodos de degradación de materiales biológicos, tales como materiales biológicos que contienen quitina. En algunos ejemplos, los materiales que contienen quitina se mezclan con un consorcio microbiano A1007 y se fermentan para producir una mezcla fermentada. La mezcla fermentada puede opcionalmente separarse en fracciones sólidas y líquidas. Estas fracciones pueden utilizarse posteriormente en aplicaciones agrícolas, por ejemplo, en combinación con los consorcios microbianos o composiciones divulgados, o puede usarse en procesos de degradación adicionales, por ejemplo, para producir niveles aumentados de productos de degradación en las fracciones sólidas y/o líquidas.
Lo anterior y otras características de la divulgación se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que procede con referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un esquema que muestra un proceso de fermentación de ejemplo utilizado para obtener el consorcio microbiano A1007.
La figura 2 es un esquema que muestra un proceso de ejemplo para la biodegradación de un material biológico que contiene quitina (ilustrado como desechos de gamba) con un consorcio microbiano o una composición microbiana divulgada.
La figura 3 es un esquema que muestra un proceso de ejemplo para la biodegradación de quitina con un consorcio microbiano divulgado (tal como A1007) o una composición microbiana.
Las figuras 4A-4C son gráficos que muestran el efecto sobre el rendimiento de grano (bushels por acre) del tratamiento de maíz con una composición microbiana (figura 4A), HYT B (figura 4B), o una composición microbiana en condiciones de estrés hídrico (figura 4C).
La figura 5 es un gráfico que muestra el rendimiento en plantas de tomate tratadas con A1007 más HYT B sin activación (TRT1), A1007 más HYT B a mitad de tasa sin activación (TRT2), A1007 más HYT B con activación de tres días (TRT3) o control. Para cada tratamiento, las diferentes bandas indican las cosechas 1-10 (de abajo a arriba).
Las figuras 6A y 6B son gráficos que muestran la prevalencia de nematodos (eje izquierdo - línea discontinua) y rendimientos de tubérculos localizados (eje derecho - barras) después del crecimiento con tratamientos que incluyen HYT A (A1007) o Nemathorin (figura 6A), y rendimientos totales de patata por parcela después del cultivo con los tratamientos indicados (figura 6B).
La figura 7 es un gráfico de un ensayo de vigor en pepino que muestra el índice del área de la tercera hoja (LAI) el día 27 en plantas tratadas con HYT A (A1007). Las letras (a, b, c) indican diferencias significativas con p<0,05 mediante análisis ANOVA.
LISTADO DE SECUENCIAS
Todas las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos enumeradas en el presente documento o en la lista de secuencias adjunta se muestran utilizando abreviaturas de letras estándar para bases de nucleótidos y aminoácidos, como se define en el 37 C.F.R. § 1.822. En al menos algunos casos, solo se muestra una cadena de cada secuencia de ácido nucleico, pero se entiende que la cadena complementaria está incluida por cualquier referencia a la cadena que se muestra.
La SEQ ID NO: 1 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado comosLactobacillus sp. (paracasei/casei).
La SEQ ID NO: 2 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado comoClostridium beijerinckii.
La SEQ ID NO: 3 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado comoAcetobacter pasteurianum.
La SEQ ID NO: 4 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado comoLactobacillus buchneri.
La SEQ ID NO: 5 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado comoBacillus subtilis.
La SEQ ID NO: 6 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado comoPaenibacillus cookii.
La SEQ ID NO: 7 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado comoLactobacillus vini.
La SEQ ID NO: 8 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado comoLactobacillus lautus.
La SEQ ID NO: 9 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado comoOceanobacillus oncorhynchi subsp. incaldanensis.
La SEQ ID NO: 10 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado comoBacillus amyloliquefaciens.
SEQ ID NO: 11 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado como muy similar aBacillus pocheonensis.
La SEQ ID NO: 12 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado comoPaenibacillus chibensis.
La SEQ ID NO: 13 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado comoBacillus flexus.
La SEQ ID NO: 14 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado comoClostridium pasteurianum.
La SEQ ID NO: 15 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado comoVirgibacillus halophilus.
La SEQ ID NO: 16 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado comoBacillus licheniformis.
La SEQ ID NO: 17 es una secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de un microbio aislado de A1007 e identificado comoStreptomyces griseus.
Descripción detallada
En la naturaleza, el equilibrio de las especies microbianas en el suelo está influenciado por muchos factores, incluyendo el tipo de suelo, la fertilidad del suelo, la humedad, los microbios competidores y las plantas (Lakshmananet al.,Plant Physiol. 166:689-700, 2014). La interacción entre especies microbianas y plantas se ve afectada aún más por las prácticas agrícolas, que pueden mejorar o degradar el microbioma del suelo (Adairet al.,Environ Microbiol Rep. 5:404-413, 2013; Carbonettoet al.,PLoS One 9:e99949, 2014; Ikedaet al.,Microbes Environ. 29:50-59, 2014). Los suelos fértiles o altamente productivos contienen una composición diferente de microbios nativos que los suelos empobrecidos en nutrientes y vinculados a una baja productividad de los cultivos. Diferentes especies microbianas están estrechamente asociadas con las plantas, en las superficies vegetales aéreas de la filosfera, en la superficie de la raíz en la rizosfera del suelo, o íntimamente como endófitos. El análisis de ADN a gran escala de estas asociaciones de microbios ha revelado una complejidad filogenética inesperada (Rincon-Florezet al.,Diversity 5:581-612, 2013; Lakshmananet al.,Plant Physiol. 166:689-700, 2014). Los estudios han determinado que los microbiomas complejos pueden correlacionarse con la productividad de las plantas, los rendimientos de los cultivos, la tolerancia a las agresiones, la acumulación de metabolitos secundarios y la tolerancia a enfermedades (Bhardwajet al.,Microbial Cell Factories 13:66-75, 2014; Vacheronet al.,Frontiers Plant Science 4:1-19, 2014). Asimismo, las plantas pueden seleccionar específicamente las mezclas microbianas del entorno local y potencialmente ajustar el microbioma al nivel de la variedad de cultivos (Hartmannet al.,Plant Soil 321:235-257, 2009; Doornboset al.,Agron. Sustain. Dev. 32:227-243, 2012; Marascoet al.,PLoS One 7:e48479, 2012; Peifferet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:6548-6553, 2013; Bulgarelliet al.,Ann. Rev. Plant Biol. 64:807-838, 2014).
Los microbios asociados a las raíces pueden promover el crecimiento de las plantas y las raíces al promover el ciclo y la adquisición de nutrientes, mediante fitoestimulación directa, mediando biofertilización u ofreciendo una ventaja de crecimiento a través del biocontrol de patógenos. Las poblaciones agrícolas útiles incluyen rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR), bacterias supresoras de patógenos, micorrizas, cianobacterias fijadoras de nitrógeno, endófitos con tolerancia al estrés, además de microbios con una variedad de capacidades biodegradativas. Los microbios implicados en el ciclo del nitrógeno incluyen los géneros fijadores de nitrógenoAzotobacteryBradyrhizobium, cianobacterias fijadoras de nitrógeno, bacterias que oxidan el amoníaco (p. ej., los génerosNitrosomonasyNitrospira),géneros que oxidan nitritos tales comoNitrospirayNitrobactery bacterias desnitrificantes heterótrofas (p. ej.,los géneros PseudomonasyAzospirillum;Isobe and Ohte, Microbes Environ. 29:4-16, 2014). Las bacterias que se han descrito como activas en la solubilización y en el aumento del acceso de las plantas al fósforo incluyenPseudomonas, Bacillus, MicrococcusyFlavobacterium,además de varios géneros de hongos (Pindiet al.,J. Biofertil. Biopest. 3:4, 2012), mientras que las especies deBacillusyClostridiumayudan a solubilizar y movilizar el potasio (Mohammadiet al.,J. Agric. Biol. Sci. 7:307-316, 2012). La fitoestimulación del crecimiento de las plantas y el alivio del estrés biótico y abiótico se logra mediante numerosas asociaciones bacterianas y fúngicas, directamente a través de la producción de metabolitos secundarios estimulantes o indirectamente al desencadenar respuestas de defensa de bajo nivel de la planta (Gaieroet al.,Amer. J. Bot. 100:1738-1750, 2013; Bhardwajet al.,Microbial Cell Factories 13:66-76, 2014).
Además de la actividad en el medio ambiente, los microbios también pueden ofrecer propiedades biodegradativas únicasin vitro,en condiciones de fermentación dirigida. El uso de mezclas microbianas específicas para degradar la quitina y la proteína total puede producir nuevas moléculas bioactivas como L-aminoácidos libres, L-péptidos, quitina y quitosano, conocidos por mejorar el crecimiento o aumentar la tolerancia al estrés mediante la activación de la inmunidad innata de las plantas (Hillet al.,PLoS One 6:e19220, 2011; Tanakaet al.,Plant Signal Behav. E22598-147, 2013). Las comunidades microbianas específicas pueden cumplir múltiples tareas, ofreciendo productos de degradación de la fermentación únicos, que son por sí mismos biológicamente beneficiosos para los cultivos, más el consorcio microbiano resultante, que puede suministrarse como producto agrícola para mejorar la productividad de los cultivos.
Tal como se describe en el presente documento, se han cofermentado y estabilizado con éxito consorcios de microbios aerobios y/o anaerobios derivados de suelos fértiles y fuentes marinas, ofreciendo beneficios directos de crecimiento y rendimiento a los cultivos. La actividad enzimática de estas mezclas microbianas ha producido además productos de fermentación con quitina, glucosamina, proteínas y/o aminoácidos. En algunas realizaciones, la administración directa de consorcios y/o composiciones microbianas puede permitir la colonización temprana de las raíces y promover la rizosfera o las asociaciones endofíticas. En algunas realizaciones, los beneficios de la administración de consorcios microbianos a las plantas incluyen uno o más de un mayor crecimiento de las raíces, aumento de la producción de pelo radicular, aumento de la superficie de la raíz, plantas más fuertes capaces de soportar el impacto del trasplante, establecimiento más rápido del enraizamiento, resistencia al estrés abiótico y mayor productividad y rendimiento de las plantas. Las mezclas microbianas complejas pueden abarcar especies y genotipos de plantas, interactuar con comunidades microbianas del suelo para ofrecer beneficios a una amplia gama de cultivos que crecen en diferentes condiciones agrícolas.
I. Términos
Salvo que se indique lo contrario, los términos técnicos se usan de acuerdo con su uso convencional. Pueden encontrarse definiciones de términos comunes en biología molecular en Krebset al.,Lewin's Genes XI, publicado por Jones y Bartlett Learning, 2012 (ISBN 1449659853); Kendrewet al.(eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por Wiley, John & Sons, Inc., 2011 (ISBN 8126531789); y George P. Rédei, Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, and Proteomics, 2a edición, 2003 (ISBN: 0-471 26821-6).
Para describir mejor la presente divulgación y para orientar a los expertos habituales en la materia a la hora de poner en práctica la presente divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos y métodos. Las formas en singular "un", "uno/una", "el" y "la" se refieren a uno o más de uno, a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Por ejemplo, la expresión "que comprende una célula" incluye células bacterianas individuales o múltiples y se considera equivalente a la expresión "que comprende al menos una célula". Como se utiliza en el presente documento, "comprende" significa "incluye". Por lo tanto, "que comprende A o B", significa "que incluye A, B, o A y B", sin excluir elementos adicionales. Aunque en la práctica o el ensayo de la tecnología divulgada pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación, se describen métodos y materiales adecuados. Los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones de esta divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos:
Animal acuático: Un animal que vive en agua salada o dulce. En realizaciones particulares divulgadas en el presente documento, un animal acuático incluye artrópodos acuáticos, tales como gamba, kril, copépodos, percebes, cangrejo, langostas y cangrejos de río. En otras realizaciones, un animal acuático incluye peces. Un subproducto de animales acuáticos incluye cualquier parte de un animal acuático, particularmente partes resultantes del procesamiento comercial de un animal acuático. Por lo tanto, en algunos ejemplos, los subproductos de animales acuáticos incluyen uno o más cefalotórax o exoesqueleto de gamba, exoesqueleto de cangrejo o langosta, o piel o escamas de pescado.
Puesta en contacto: Colocación en asociación física directa, incluyendo tanto en forma sólida como líquida. Por ejemplo, el contacto puede ocurrir con uno o más microbios (como los microbios en un consorcio microbiano) y una muestra biológica en solución. El contacto también puede ocurrir con uno o más microbios (como los microbios en un consorcio microbiano) y el suelo, plantas y/o partes de plantas (como follaje, tallo, plántula, raíces y/o semillas).
Cultivo: Crecimiento deliberado de uno o más organismos o células en presencia de fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y sales minerales. En un ejemplo, dicho crecimiento puede tener lugar en un medio nutritivo sólido o semisólido, o en un medio líquido en el que los nutrientes están disueltos o suspendidos. En un ejemplo adicional, el cultivo puede tener lugar en una superficie o mediante cultivo sumergido. El medio nutritivo puede estar compuesto de nutrientes complejos o puede estar definido químicamente.
Fermentación: Un proceso que tiene como resultado la descomposición de compuestos orgánicos complejos en compuestos más simples, por ejemplo, por células microbianas (tales como bacterias y/u hongos). El proceso de fermentación puede ocurrir en condiciones aerobias, condiciones anaerobias, o ambas (por ejemplo, en un volumen grande donde algunas porciones son aerobias y otras anaerobias). En algunas realizaciones no limitantes, la fermentación incluye la descomposición enzimática y/o no enzimática de compuestos presentes en animales acuáticos o subproductos de animales acuáticos, como la quitina.
Fertilizante líquido: Una solución o suspensión acuosa que contiene nitrógeno soluble. En algunos ejemplos, el nitrógeno soluble en un fertilizante líquido incluye una fuente orgánica de nitrógeno tal como urea, o urea derivada de amoníaco anhidro (tal como una solución de urea y nitrato de amonio (UAN)). También se puede utilizar agua amoniacal (20-32 % de amoníaco anhidro). En otros ejemplos, el nitrógeno soluble en un fertilizante líquido incluye sales inorgánicas que contienen nitrógeno tales como hidróxido de amonio, nitrato de amonio, sulfato de amonio, pirofosfato de amonio, tiosulfato de amonio o combinaciones de dos o más de los mismos. En algunas realizaciones, el fertilizante líquido incluye una fuente de nitrógeno de origen no natural (tal como pirofosfato de amonio o tiosulfato de amonio) y/u otros componentes de origen no natural.
Las mezclas comunes de fertilizantes líquidos no naturales se especifican por su contenido de nitrógeno, fosfato y potasio (porcentajes de N-F-K) e incluyen la adición de otros componentes, como azufre o zinc. Ejemplos de mezclas artificiales incluyen 10-34-0, 10-30-0 con 2 % de azufre y 0,25 % de zinc (quelado), 11-37-0, 12-30-0 con 3 % de azufre, 2-4-12, 2-6-12, 4-10-10, 3-18-6, 7-22-5, 8-25-3, 15-15-3, 17-17-0 con 2 % de azufre, 18-18-0, 18-18-0 con 2 % de azufre, 28-0-0 UAN, 9-27-0 con 2 % de azufre y tiosulfato de potasio.
Microbio: Un microorganismo, incluidos, pero sin limitación, bacterias, arqueobacterias, hongos y algas (como microalgas). En algunos ejemplos, los microbios son organismos unicelulares (por ejemplo, bacterias, cianobacterias, algunos hongos o algunas algas). En otros ejemplos, el término microbios incluye organismos pluricelulares, tales como ciertos hongos o algas (por ejemplo, hongos filamentosos pluricelulares o algas pluricelulares).
Composición microbiana: Una composición (que puede ser sólida, líquida, o al menos parcialmente ambas) que incluye al menos un microbio (o una población de al menos un microbio). En algunos ejemplos, una composición microbiana es uno o más microbios (o una o más poblaciones de microbios) en un medio líquido (como un medio de almacenamiento, medio de cultivo o de fermentación), por ejemplo, como suspensión en el medio líquido. En otros ejemplos, una composición microbiana es uno o más microbios (o una o más poblaciones de microbios) en la superficie o incrustados en un medio sólido o gelatinoso (que incluye, entre otros, una placa de cultivo), o una suspensión o pasta.
Consorcio m icrobiano: Una mezcla, asociación o ensamblaje de dos o más especies microbianas, que en algunos casos están en contacto físico entre sí. Los microbios de un consorcio pueden interaccionar entre sí mediante contacto físico directo o mediante interacciones bioquímicas, o ambas. Por ejemplo, los microbios en un consorcio pueden intercambiar nutrientes, metabolitos o gases entre sí. Por lo tanto, en algunos ejemplos, al menos algunos de los microbios de un consorcio pueden ser metabólicamente interdependientes. Estas interacciones interdependientes pueden cambiar de carácter y extensión con el tiempo y con las cambiantes condiciones culturales.
II. Consorcios m icrobianos y composiciones
En el presente documento se describen varios consorcios microbianos. El consorcio microbiano de la presente invención se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA) el 23 de diciembre de 2015 y se le asignó el número de depósito PTA-122728, denominado en el presente documento A1007. El consorcio A1007 incluye al menosBacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Streptomyces spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp.yCandida spp.También divulgados en el presente documento, pero no forman parte de la presente invención, los consorcios o composiciones microbianas que incluyen dos o más (tales como 2 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, o 50 o más) o todos los microbios en A1007. En algunas realizaciones, una composición microbiana divulgada en el presente documento es una composición definida, por ejemplo, una composición que incluye especies microbianas específicas y opcionalmente, componentes no microbianos adicionales (incluidos, entre otros, sales, oligoelementos, quitina, quitosano, glucosamina y/o aminoácidos).
Como se analiza más adelante, la identidad de al menos algunos microbios presentes en A1007 se determinó mediante purificación de colonias y análisis de secuencia de ADN (p. ej., secuenciación de ADNr 16S, Ejemplo 4) y/o análisis de micromatrices (Ejemplo 14). Un experto en la materia conoce técnicas adicionales para identificar microbios presentes en una mezcla o consorcio microbiano, incluyendo 1 ) métodos basados en ácidos nucleicos que se basan en el análisis y la diferenciación del ADN microbiano (como el análisis de micromatrices de ADN de ácidos nucleicos, metagenómica, o hibridaciónin situacoplada a clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)); 2) métodos bioquímicos que se basan en la separación e identificación de una variedad de biomoléculas, incluido el análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME), Análisis de desorción/ionización láser asistida por matrizespectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF), o análisis de ácido micólico celular mediante análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento (MYCO-LCS); y 3) métodos microbiológicos que se basan en herramientas tradicionales (como el crecimiento selectivo y el examen microscópico) para proporcionar características más generales de la comunidad en su conjunto, y/o reducir e identificar sólo un pequeño subconjunto de los miembros de esa comunidad.
En algunos ejemplos, los microbios en una mezcla o consorcio se separan (por ejemplo, usando técnicas de clasificación por tamaño físico y/o células) seguido de una secuenciación profunda del ADN o del genoma completo de los microbios resultantes (o subgrupos o subpoblaciones de microbios). El uso de una micromatriz diferente o el uso de otras técnicas de identificación pueden identificar la presencia de diferentes microbios (más, menos, o diferentes taxones o especies microbianas) debido a diferencias en la sensibilidad y especificidad de la técnica de análisis elegida. Adicionalmente, varias técnicas (incluido el análisis de micromatrices o el análisis de ADN por PCR) pueden no detectar microbios concretos (incluso si están presentes en una muestra), por ejemplo, si en el análisis no se incluyen sondas y/o cebadores capaces de detectar microbios particulares. Adicionalmente, un experto en la materia reconocerá que la clasificación y denominación microbiana puede cambiar con el tiempo y dar como resultado la reclasificación y/o el cambio de nombre de los microbios.
En algunas realizaciones, una composición de la presente divulgación incluye células de cinco o más especies microbianas seleccionadas deBacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp.yCandida spp.En algunos ejemplos, la composición que no forma parte de la presente invención, incluye células seleccionadas de 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, o todos deBacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp.yCandida spp.En realizaciones adicionales, una composición de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, incluye células de cinco o más especies microbianas seleccionadas deBacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Streptomyces spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp.yCandida spp.En algunos ejemplos, la composición incluye células seleccionadas de 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, o todos deBacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Streptomyces spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp.,yCandida spp.
En otras realizaciones, los consorcios microbianos o composiciones divulgados que no forman parte de la presente invención incluyen, consisten esencialmente en, o consisten en dos o más (como 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, 15 o más, 20 o más, o todos) de los microbios enumerados en la Tabla 1. En más realizaciones, los consorcios microbianos o composiciones divulgados incluyen, consisten esencialmente en, o consisten en dos o más (como 5 o más, 10 o más, 15 o más, o todos) los microbios que tienen la secuencia de ADNr 16S con al menos un 95%de identidad (tal como al menos un 96 %, un 97 %), un 98 %, un 99 %, o más) con las SEQ ID NO: 1-17.
Tabla 1. Microbios
Se divulga, pero no se abarca en la presente invención, que la composición microbiana incluya una mayor cantidad de microbios particulares en comparación con A1007. Por ejemplo, el cultivo de A 1007 con fertilizante líquido (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 5) conduce a un aumento en la cantidad de uno o más deBacillus spp.(p. ej., uno o más deBacillus circulans, Bacillus pocheonensis, Bacillus flexus, Bacillus subterraneus, Bacillus firmusoBacillus oceanisediminis), Brevibacillus spp.(p. ej.,Brevibacillus brevis), Lysinibacillus spp.(p. ej.,Lysinibacillus fusiformis), Paenibacillus spp.(p. ej.,Paenibacillus validus, Paenibacillus anaericanus, Paenibacillus agaridevorans, Paenibacillus cineris, Paenibacillus rhizoospherae, Paenibacillus favisporusoPaenibacillus timonensis), Clostridium spp.(p. ej.,Clostridium nitrophenolicum, Clostridium tyrobutyricum o Clostridium sphenoides), Oceanobacillus spp.(p. ej.,Oceanobacillus oncorhynchi subsp. incaldanensis), Rummeliibacillus spp.(p. ej.,Rummeliibacillus stabekisii)y/oVirgibacillus spp.(p. ej.,Virgibacillus halophilus)en la composición microbiana.
En algunos ejemplos, la composición microbiana incluye al menos aproximadamente un 10 % más de uno o más deBacillus spp.(p. ej., uno o más deBacillus circulans, Bacillus pocheonensis, Bacillus flexus, Bacillus subterraneus, Bacillus firmusoBacillus oceanisediminis), Brevibacillus spp.(p. ej.,Brevibacillus brevis), Lisinibacillus spp.(p. ej.,Lysinibacillus fusiformis), Paenibacillus spp.(p. ej.,Paenibacillus valus, Paenibacillus anaericanus, Paenibacillus agaridevorans, Paenibacillus cineris, Paenibacillus rhizoospherae, Paenibacillus favisporusoPaenibacillus timonensis), Clostridium spp.(p. ej.,Clostridium nitrophenolicum, Clostridium tyrobutyricumoClostridium sphenoides), Oceanobacillus spp.(p. ej.,Oceanobacillus oncorhynchi subsp. incaldanensis), Rummeliibacillus spp.(p. ej.,Rummeliibacillus stabekisii),y/oVirgibacillus spp.(p. ej.,Virgibacillus halophilus)comparado con A1007.
Los consorcios o composiciones A1007 pueden incluir opcionalmente células de una o más especies microbianas adicionales, más allá de las enumeradas en la Tabla 1. En algunas realizaciones, los microbios adicionales incluyenAzotobacter spp.(p. ej.,Azotobacter vinelandiiy/oAzotobacter chroococcum)oRhizobium spp.(p. ej.,Rhizobium japonicusy/oRhizobium leguminosarum).Los microbios adicionales incluyen, pero no se limitan a uno o más deDesulfococcus spp., Desulfotomaculum spp., Marinobacter spp.(p. ej.,Marinobacterbriozoorum), Nitrosopumilus spp., Ruminococcus spp.(p. ej.,Ruminococcus flavefaciens), Pseudomonas spp.(p. ej.,Pseudomonas fluorescensoPseudomonas putida), Deinococcus spp., Azospirillum spp., Aquabacterium spp., Clostridium spp.(p. ej.,Clostridium butyricum), Cytophaga spp., Microbacterium spp.(p. ej.,Microbacterium testaceum), Lysinibacillus(p. ej.,Lysinibacillus sphaericus), Sporosarcina spp., Nesterenkonia spp., Agrococcus spp.(p. ej.,Agrococcus terreus), Acremonium spp.(p. ej.,Acremonium bacillisporum), Bacillus spp.(p. ej.,Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus), Lactobacillus spp.(p. ej.,Lactobacillus acidophilus), Acetobacter spp.(p. ej.,Acetobacter aceti), Acidisoma spp., Azotobacter spp.(p. ej.,Azotobacter vinelandiioAzotobacter chroococcum), Treponema spp.(p. ej.,Treponema primitia), Bradyrhizobium spp.(p. ej.,Bradyrhizobium elkanii), Lactococcus spp., Leptolyngbya spp., Leptospirillum spp.(p. ej.,Leptospirillum ferrodiazotrophum),Halorhabdus spp., Xenococcus spp., Paenibacillus spp.(p. ej.,Paenibacillus amyloticus), Pediococcus(p. ej.,Pediococcus pentosceus), Proteus spp.(p. ej.,Proteus vulgaris), Rhizobium(p. ej.,Rhizobium japonicusoRhizobium leguminosarum), Rhodoferax spp., Streptomyces spp.(p. ej.,Streptomyces griseus), Streptococcus spp., Trichoderma spp.(p. ej.,Trichoderma harzianum), Microcoleus spp., Micrococcus spp.(p. ej.,Micrococcus luteus), Nitrobacter spp., Nitrosomonas spp., Nitrospira spp., Actinomyces spp., Devosia spp., Brevibacterium spp., Methanosaeta spp., Saccharomyces spp.(p. ej.,Saccharomyces cerevisiae), Penicillium spp.(p. ej.,Penicillium roqueforti), Monascus(p. ej.,Monascus ruber), Aspergillus spp.(p. ej.,Aspergillus oryzae), Arthrospira spp.(p. ej.,Arthrospira platensis)yAscophyllum spp.(p. ej.,Ascophyllum nodosum).Un experto en la materia puede identificar microbios adicionales adecuados, por ejemplo, en función de las características que se deseen incluir en los consorcios o composiciones.
Las composiciones divulgadas pueden incluir una o más componentes adicionales además de los microbios, incluyendo, pero sin limitación, sales, iones metálicos y/o tampones (por ejemplo, uno o más de KH2PO4, K2HPO4, CaCl2, MgSO4, FeCh, NaMoO4 y/o Na2MoO4), oligoelementos (como azufre, sulfato, sulfito, cobre o selenio), micronutrientes (como boro (B), zinc (Zn), manganeso (Mn), hierro (Fe), cobre (Cu), molibdeno (Mo), cloro (Cl), vitaminas (como vitaminas B o vitamina K), azúcares (tales como sacarosa, glucosa o fructosa), quitina, quitosano, glucosamina, proteínas y/o aminoácidos. Los componentes adicionales que también pueden incluirse en las composiciones incluyen HYT B, HYT C y/o HYT D, uno o más fertilizantes (p. ej., fertilizante líquido), uno o más pesticidas, uno o más fungicidas, uno o más herbicidas, uno o más insecticidas, una o más hormonas vegetales, uno o más elicitores de plantas, o combinaciones de dos o más de estos componentes.
En algunas realizaciones, los consorcios microbianos o composiciones divulgados (tales como aquellos que incluyen cinco o más especies microbianas en los consorcios microbianos descritos en el presente documento) están en un medio líquido (tal como un medio de cultivo o fermentación) o inóculo. En otras realizaciones, los consorcios microbianos o composiciones (por ejemplo, composiciones que incluyen cinco o más especies microbianas enumeradas en la Tabla 1) están presentes en un medio sólido o gelatinoso (tal como una placa de cultivo) que contiene o soporta los microbios.
En otras realizaciones más, los consorcios microbianos o composiciones (tales como una composición que incluye cinco o más especies microbianas enumeradas en la Tabla 1) están presentes en formulaciones secas, como un polvo seco, pellet o gránulo. Las formulaciones secas se pueden preparar añadiendo un osmoprotector (como azúcar, por ejemplo, trehalosa y/o maltodextrina) a una composición microbiana en solución en una proporción deseada. Esta solución se combina con un vehículo seco o agente absorbente, como harina de madera o arcilla, a la concentración deseada de composición microbiana (como 2-30 %, por ejemplo, 2,5-10 %, 5-15 %, 7,5-20 % o 15-30 %). Los gránulos se pueden elaborar incorporando aglutinantes de arcilla o polímeros que sirven para mantener unidos los gránulos u ofrecen propiedades físicas o de degradación específicas. Los gránulos se pueden formar usando granulación rotatoria, granulación en mezcladora o extrusión, como algunos métodos posibles. En otros ejemplos, las formulaciones secas se pueden preparar pulverizando o empapando la composición microbiana líquida sobre/en un vehículo sólido tal como bentonita o recubriendo la composición microbiana líquida directamente sobre un gránulo de fertilizante. Un experto en la materia conoce métodos adicionales para preparar formulaciones secas que incluyen una o más especies microbianas, por ejemplo, como se describe en Formulación de biopesticidas microbianos: Beneficial Microorganisms, Nematodes and Seed Treatments, Burges, ed., Springer Science, 1998; Bashan, Biotechnol. Adv.
16:729-770, 1998; Ratulet al.,Int. Res. J. Pharm. 4:90-95, 2013.
En algunos ejemplos, los consorcios microbianos o las composiciones que incluyen microbios pueden mantenerse a una temperatura que favorezca el crecimiento de los microbios, por ejemplo, a aproximadamente 25-45 °C (como aproximadamente 30-35 °C, aproximadamente 30-40 °C, o aproximadamente 35-40 °C). En otros ejemplos, las composiciones se almacenan a temperaturas a las que los microbios no crecen o están inactivos, como menos de 25 °C (por ejemplo, 4 °C, -20 °C, -40 °C, -70 °C o menos). Un experto en la materia puede formular las composiciones para almacenamiento en frío, por ejemplo, incluyendo estabilizadores (tales como glicerol). En otros ejemplos adicionales, las composiciones se almacenan a temperatura ambiente, tal como aproximadamente 0-35 °C (por ejemplo, aproximadamente 10-30 °C o aproximadamente 15-25 °C).
111. Procesos de biodegradación
Los consorcios microbianos y composiciones divulgados se pueden usar para degradar materiales biológicos, como materiales ricos en quitina, por ejemplo, animales acuáticos o subproductos de animales acuáticos, insectos u hongos. Por lo tanto, en el presente documento se divulgan métodos que incluyen mezclar uno o más de los consorcios microbianos o composiciones descritos con un material biológico que contiene quitina para formar una mezcla y fermentar la mezcla. En algunas realizaciones, los métodos también incluyen separar la mezcla en fracciones sólidas, acuosas y opcionalmente, lipídicas (figura 2) después de la fermentación.
En algunas realizaciones, un proceso de biodegradación divulgado en el presente documento incluye mezclar un consorcio microbiano (tal como A1007, una composición que incluye algunos o todos los microbios en A1007, o una composición que incluye cinco o más de las especies microbianas en la Tabla 1) con uno o más materiales biológicos que contienen quitina. Los materiales biológicos que contienen quitina incluyen, aunque no de forma limitativa, animales acuáticos o subproductos de animales acuáticos, insectos u hongos. En algunos ejemplos, el material biológico que contiene quitina es un animal acuático, como un artrópodo acuático (por ejemplo, un miembro de la Clase Malacostraca). Los artrópodos acuáticos para uso en los métodos divulgados incluyen gamba, cangrejo, langosta, cangrejo de río o kril; se contemplan mezclas de dos o más. En algunos ejemplos, el animal acuático completo (tal como un artrópodo acuático) o subproductos de animales acuáticos se utilizan en los métodos de biodegradación divulgados en el presente documento. Los subproductos de animales acuáticos incluyen cualquier parte de un animal acuático, como cualquier parte producida mediante el procesamiento del animal acuático. En algunos ejemplos, un subproducto de un animal acuático es todo o una parte del exoesqueleto de un animal acuático, tales como gamba, cangrejo, cangrejo de río o caparazón de langosta. En otros ejemplos, un subproducto de un animal acuático es parte de un animal acuático, por ejemplo, los cefalotórax de la gamba.
En otros ejemplos, el material biológico que contiene quitina incluye hongos, tales como los hongos del Phylum Zygomycota, Basidiomycota, Ascomycota o Deuteromycota. Hongos ilustrativos particulares incluyenAspergillus spp., Penicillium spp., Trichoderma spp., Saccharomyces spp.ySchizosaccharomyces spp.Por lo tanto, las corrientes de desechos de panaderías, cervecerías y destilerías pueden proporcionar fuentes de material biológico que contiene quitina. En otros ejemplos adicionales, el material biológico que contiene quitina incluye insectos que contienen quitina en sus exoesqueletos, como saltamontes, grillos, escarabajos y otros insectos. También se contempla que los subproductos del procesamiento de dichos insectos sean fuentes de quitina.
El material biológico que contiene quitina se mezcla con una composición que incluye los microbios descritos en la Sección II anterior (tal como el consorcio microbiano A1007 u otro consorcio o composición descrito en la Sección II) para formar una mezcla sustancialmente homogénea. En algunos ejemplos, el material biológico que contiene quitina se pulveriza, tritura, pica, moltura o dispersa de otro modo antes de mezclarlo con los microbios o consorcios microbianos descritos en el presente documento. En ejemplos particulares, la mezcla contiene aproximadamente 10 50 % (tal como aproximadamente 10-20 %, aproximadamente 20-30 %, aproximadamente 30-40 %, aproximadamente 25-40 %, por ejemplo, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, o aproximadamente 50 %) de material que contiene quitina (tal como cabezas y/o caparazones de gamba) (p/v) en inóculo que contiene aproximadamente 0,1-5 % (tal como aproximadamente 0,1-1 %, aproximadamente 0,5-2%, aproximadamente 1-2%, aproximadamente 2-3%, aproximadamente 0,1%, aproximadamente 0,2%, aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,8%, aproximadamente 1%, aproximadamente 1,25%, aproximadamente 1,5%, aproximadamente 1,75%, aproximadamente 2 %, aproximadamente 2,5 %, aproximadamente 3 %, aproximadamente 4 % o aproximadamente 5 %) de microbios (v/v).
En algunos ejemplos, se mezclan el inóculo, el material biológico que contiene quitina y un azúcar (u otra fuente de carbono), por ejemplo, removiendo o agitando. En otros ejemplos, uno o más de los microbios de la composición o consorcio microbiano se activan opcionalmente antes de mezclarlos con el material biológico que contiene quitina y la fermentación. No se requiere activación para los métodos divulgados en el presente documento. Un experto en la materia puede realizar ajustes al tiempo y/o temperatura de la fermentación, dependiendo de si los microbios se activan antes de la fermentación. La activación de la composición microbiana puede realizarse incubando un inóculo de los microbios con una fuente de carbono (tal como azúcar, por ejemplo, glucosa, sacarosa, fructosa u otro azúcar) a una temperatura y durante un período de tiempo suficiente para que los microbios crezcan. En algunos ejemplos, un inóculo de los microbios (tal como un consorcio microbiano o una composición descrito en el presente documento) tiene una concentración de aproximadamente 0,05-5 % v/v (por ejemplo, aproximadamente 0,5-5 %, aproximadamente 0,5-2 %, aproximadamente 1-2 % o aproximadamente 2-3 %) en un medio líquido. El inóculo se diluye en una solución que contiene aproximadamente 0,1-1 % de azúcar (por ejemplo, aproximadamente 0,1-0,5 %), aproximadamente 0,1 0,3 %, aproximadamente 0,2-0,6 % o aproximadamente 0,5-1 %, tal como aproximadamente 0,1 %, aproximadamente 0,2%, aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,4%, aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,6%, aproximadamente 0,7 %, aproximadamente 0,8 %, aproximadamente 0,9 % o aproximadamente 1 %) y se incuba a temperatura ambiente, por ejemplo, aproximadamente 20-40 °C (tal como aproximadamente 20 °C, aproximadamente 25 °C, aproximadamente 30 °C, aproximadamente 35 °C o aproximadamente 40 °C) durante aproximadamente 1-5 días (tal como aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 96 horas o aproximadamente 120 horas. En otros ejemplos, la activación de la composición microbiana puede activarse incubando un inóculo de los microbios a una temperatura y durante un periodo de tiempo suficiente para que los microbios crezcan, por ejemplo, incubación a aproximadamente 20-40 °C (tal como aproximadamente 25-35 °C) durante 12 horas a 5 días (tal como 1-4 días o 2-3 días). En algunos ejemplos no limitativos, se considera que los microbios están activados cuando el cultivo alcanza una densidad óptica de >0,005 a 600 nm.
Después de mezclar el material biológico que contiene quitina y los microbios o el consorcio microbiano (que opcionalmente están activados), la mezcla se fermenta. En algunos ejemplos, el pH de la mezcla se mide antes de la fermentación. El pH se ajusta a un intervalo seleccionado (por ejemplo, pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 o aproximadamente de 3,5 a 4), si es necesario, antes de la fermentación. La mezcla se incuba a una temperatura de aproximadamente 20-40 °C (por ejemplo, aproximadamente 30°-36 °C, tal como aproximadamente 30 °C, aproximadamente 31 °C, aproximadamente 32 °C, aproximadamente 33 °C, aproximadamente 34 °C, aproximadamente 35 °C, aproximadamente 36 °C, aproximadamente 37 °C, aproximadamente 38 °C, aproximadamente 39 °C o aproximadamente 40 °C) durante aproximadamente 1-30 días (tal como aproximadamente 3-28 días, aproximadamente 7-21 días, aproximadamente 3, 5, 7, 10, 14, 16, 20, 24, 28 o 30 días). La mezcla se agita periódicamente (por ejemplo, agitación no continua). En algunos ejemplos, la mezcla se agita durante un período de tiempo cada 1-7 días, por ejemplo, cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días. En algunos ejemplos no limitativos, la fermentación continúa hasta que la acidez titulable (TTA) es de aproximadamente 3-5 % y el pH es de aproximadamente 4-5.
Después de la fermentación, la mezcla fermentada resultante se separa en al menos fracciones sólidas y líquidas. En algunos ejemplos, la fermentación se pasa del tanque al equipo de decantación. Posteriormente el líquido se decanta y se centrifuga. En un ejemplo no limitante, la mezcla fermentada se centrifuga a 1250 rpm (930 xg) durante 15 minutos a aproximadamente 5 °C para obtener fracciones líquidas y lipídicas (p. ej., pigmento). La fracción líquida (o acuosa) obtenida del proceso de biodegradación se puede almacenar a temperatura ambiente. En algunos ejemplos no limitativos, se añade un azúcar a la fracción líquida, por ejemplo, al 1-10 % v/v.
La fracción líquida puede incluir componentes tales como proteínas, aminoácidos, glucosamina, oligoelementos (tales como calcio, magnesio, zinc, cobre, hierro y/o manganeso) y/o enzimas (tales como enzimas lácticas, proteasas, lipasas y/o quitinasas). En algunos ejemplos no limitativos, la fracción líquida contiene (p/v) aproximadamente 1-5 % del total de aminoácidos, aproximadamente 3-7 % de proteína, aproximadamente 0,1-2% de nitrógeno, menos de aproximadamente 0,2 % de fósforo, aproximadamente 0,5-1 % de potasio, aproximadamente 4-8 % de carbono, aproximadamente 0,2-1 % de calcio, menos de aproximadamente 0,2 % de magnesio, menos de aproximadamente 0,2 % de sodio y/o aproximadamente 0,1-0,4 % de azufre. En ejemplos adicionales no limitantes, la fracción líquida incluye aproximadamente 0,01-0,2 % de glucosamina (por ejemplo, aproximadamente 0,1 % o menos). La fracción líquida también puede contener uno o más microbios (p. ej., del inóculo utilizado para iniciar el proceso de fermentación) y/o trazas de quitosano o quitina. En algunos ejemplos, la fracción líquida se denomina en el presente documento "HYT B".
La fracción sólida obtenida del proceso de biodegradación contiene quitina (por ejemplo, aproximadamente 50-70 % o aproximadamente 50-60 % de quitina). La fracción sólida también puede contener uno o más oligoelementos (tales como calcio, magnesio, zinc, cobre, hierro y/o manganeso), proteínas o aminoácidos y/o uno o más microbios del inóculo utilizado para iniciar el proceso de fermentación. En algunos ejemplos, la fracción sólida se denomina en el presente documento "HYT C". HYT C se microniza opcionalmente para formar quitina micronizada y quitina residual. En algunos ejemplos no limitativos, la fracción sólida contiene (p/v) aproximadamente 9-35 % de aminoácidos totales, aproximadamente 30-50 % de proteína cruda, aproximadamente 5-10 % de nitrógeno, aproximadamente 0,3-1 % de fósforo, menos de aproximadamente 0,3 % de potasio, aproximadamente 35-55 % de carbono, aproximadamente 0,5 2 % de calcio, menos de aproximadamente 0,1 % de magnesio, aproximadamente 0,1 -0,4 % de sodio y/o aproximadamente 0,2-0,5 % de azufre.
En algunos ejemplos, también se separa una fracción lipídica de las fracciones sólida y líquida. La fracción lipídica es la fase superior de la fracción líquida. La fracción lipídica contiene compuestos tales como esteroles, vitamina A y/o vitamina E, ácidos grasos (tales como DHA y/o EHA), y en algunos ejemplos, pigmentos carotenoides (por ejemplo, astaxantina). La fracción lipídica se puede utilizar para una variedad de propósitos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, la producción de cosméticos o productos nutricionales.
En realizaciones adicionales, la quitina se fermenta con un consorcio microbiano A1007. En algunos ejemplos, la quitina (tal como HYT C, o quitina micronizada y/o residual producida como se describe anteriormente) se mezcla con un consorcio microbiano o composición que contiene microbios descritos en el presente documento e hidrolizado de proteínas (p. ej., HYT B), y fermentado para formar una mezcla fermentada. Como resultado de la fermentación se digiere al menos una parte de la quitina de la mezcla de partida. En algunos ejemplos, la mezcla se incuba a una temperatura de aproximadamente 20-40 °C (por ejemplo, aproximadamente 30°-35 °C, tal como aproximadamente 30 °C, aproximadamente 31 °C, aproximadamente 32 °C, aproximadamente 33 °C, aproximadamente 34 °C, aproximadamente 35 °C, aproximadamente 36 °C, aproximadamente 37 °C, aproximadamente 38 °C, aproximadamente 39 °C o aproximadamente 40 °C) durante aproximadamente 1 día a 30 días (tal como aproximadamente 2-28 días, aproximadamente 4-24 días, aproximadamente 16-30 días, aproximadamente 10-20 días o aproximadamente 12-24 días). En algunos ejemplos, la mezcla se agita periódicamente (por ejemplo, agitación no continua). En otros ejemplos, la mezcla se agita continuamente. En un ejemplo no limitante, la mezcla se agita durante aproximadamente 1-12 horas diarias (tal como aproximadamente 2-8 horas o aproximadamente 4-10 horas). El pH de la mezcla de fermentación puede controlarse periódicamente. En algunos ejemplos, el pH se mantiene opcionalmente en aproximadamente 4-5. En algunos ejemplos, la fermentación continúa hasta que la acidez titulable total (TTA) sea al menos aproximadamente 1-10 % (tal como aproximadamente 2-8 %, aproximadamente 4-8 % o aproximadamente 5-10 %).
Después de la fermentación, la mezcla fermentada resultante se separa en al menos fracciones sólidas y líquidas, por ejemplo, por decantación, filtración y/o centrifugación. La fracción líquida resultante de la fermentación de HYT B y quitina con la composición microbiana se denomina en algunos ejemplos en el presente documento "HYT D". En algunos ejemplos no limitativos, la fracción líquida contiene (p/v) aproximadamente 0,5-2 % del total de aminoácidos, aproximadamente 3-7 % de proteína, aproximadamente 0,5-1 % de nitrógeno, menos de aproximadamente 0,1 % de fósforo, aproximadamente 0,4-1 % de potasio, aproximadamente 3-7 % de carbono, menos de aproximadamente 0,5 % de calcio, menos de aproximadamente 0,1 % de magnesio, menos de aproximadamente 0,3 % de sodio y/o aproximadamente menos de aproximadamente 0,3 % de azufre. Adicionalmente, HYT D contiene menos de aproximadamente 50%de quitina (tal como menos de aproximadamente 45 %, menos de aproximadamente 40 %, menos de aproximadamente 35 %, o menos de aproximadamente 30 % de quitina) y menos de aproximadamente 2 % de glucosamina (tal como menos de aproximadamente 1,5 % o menos de aproximadamente 1 % de glucosamina). En otros ejemplos, HYT D contiene aproximadamente 25-50 % de quitina y aproximadamente 0,5-2 % de glucosamina.
IV. Procesos para el tratamiento del suelo, Plantas y/o Semillas
Los consorcios microbianos divulgados, las composiciones que contienen microbios y/o productos divulgados en el presente documento (tales como HYT B, HYT C y/o HYT D) se pueden utilizar para tratar el suelo, plantas o partes de plantas (como raíces, tallos, follaje, semillas o plántulas). En algunos ejemplos, el tratamiento con los consorcios microbianos, las composiciones que contienen microbios y/o productos mejora el crecimiento de las plantas, mejora la tolerancia al estrés y/o aumenta el rendimiento del cultivo. Los métodos de producción de HYT B, HYT C y HYT D se han descrito anteriormente y también en la patente de EE. UU. n.° 8.748.124 y en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 20l2/175738.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen poner en contacto el suelo, plantas (tal como el follaje de las plantas, tallos, raíces, plántulas u otras partes de plantas), o semillas con un consorcio (tal como A1007) o una composición que incluye los microbios presentes en uno o más de los consorcios microbianos o composiciones divulgados. Los métodos también pueden incluir cultivar las plantas tratadas, partes de plantas, o semillas y/o plantas cultivadas, partes de plantas o semillas en el suelo tratado.
Opcionalmente, los microbios se activan antes de la aplicación. En algunos ejemplos, la activación de los microbios es como se describe en la Sección III anterior. En otros ejemplos, los microbios se activan mezclando 100 partes de agua y 1 parte de consorcio o composición microbiana e incubando a aproximadamente 15-40 °C (tal como aproximadamente 20-40 °C, aproximadamente 15-30 °C o aproximadamente 25-35 °C) durante aproximadamente 12 horas-14 días (tal como aproximadamente 1-14 días, 3-10 días, 3-5 días o 5-7 días. La mezcla de activación opcionalmente también puede incluir 1 parte de HYT B, si el consorcio o composición microbiana se va a aplicar en combinación con HYT B.
En otras realizaciones, los métodos incluyen el contacto con el suelo, plantas (o partes de plantas) o semillas con un producto de los consorcios microbianos o composiciones divulgados, tal como HYT B, HYT C, HYT D, o combinaciones de los mismos. Incluso en otras realizaciones, los métodos incluyen el contacto con el suelo, plantas o semillas con un consorcio o composición microbiana divulgada que incluye los microbios divulgados y uno o más de HYT B, HYT C y HYT D (tal como uno, dos, o todos los HYT B, HYT C y HYT D). HYT B, HYT C y/o HYT D pueden aplicarse por separado al suelo, plantas (o partes de plantas) y/o semillas, por ejemplo, secuencialmente, simultáneamente, o sustancialmente simultáneamente con los consorcios microbianos o composiciones que contienen microbios divulgados.
En algunos ejemplos, los métodos incluyen además el contacto con el suelo, plantas (o parte de la planta), o semillas con uno o más componentes adicionales que incluyen, entre otros, quitina, quitosano, glucosamina, proteína, aminoácidos, fertilizantes líquidos, uno o más pesticidas, uno o más fungicidas, uno o más herbicidas, uno o más insecticidas, una o más hormonas vegetales, uno o más elicitores de plantas, o combinaciones de dos o más de los mismos. Los componentes adicionales pueden incluirse en la composición que incluye los microbios o en los consorcios microbianos divulgados en el presente documento, o pueden aplicarse por separado al suelo, plantas (o partes de plantas) y/o semillas, por ejemplo, secuencialmente, simultáneamente, o sustancialmente simultáneamente con los consorcios o composiciones que contienen microbios divulgados.
En realizaciones particulares, se combina un consorcio o composición microbiana con un fertilizante líquido (por ejemplo, una solución o suspensión que contiene nitrógeno soluble). En algunos ejemplos, el fertilizante líquido incluye una fuente orgánica de nitrógeno tal como urea, o una sal inorgánica que contiene nitrógeno tal como hidróxido de amonio, nitrato de amonio, sulfato de amonio, pirofosfato de amonio, tiosulfato de amonio o combinaciones de los mismos. También se puede utilizar hidróxido de amonio (20-24,6 % de amoníaco anhidro) como el nitrógeno soluble. En algunos ejemplos, el consorcio microbiano o composición se combina con el fertilizante líquido (por ejemplo, mezclado con el fertilizante líquido) inmediatamente antes de su uso o poco antes de su uso (tal como entre 10 minutos y 24 horas antes de su uso, por ejemplo, aproximadamente 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas o 24 horas antes de su uso). En otros ejemplos, el consorcio microbiano o composición se combina con el fertilizante líquido (por ejemplo, mezclado con el fertilizante líquido) al menos 24 horas antes de su uso (tal como de 24 horas a 6 meses, por ejemplo, al menos 36 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas, al menos una semana, al menos de dos semanas, al menos de cuatro semanas, al menos ocho semanas, o al menos 12 semanas antes de su uso).
En algunos ejemplos, se calcula la cantidad de la composición(es) a aplicar (por ejemplo, por acre o hectárea) y la composición se diluye en agua (o en algunos ejemplos, fertilizante líquido) hasta una cantidad suficiente para pulverizar o irrigar el área a tratar (si la composición es un líquido, tal como consorcios microbianos o composiciones, HYT B o HYT D). En otros ejemplos, la composición se puede mezclar con herbicidas diluidos, insecticidas, pesticidas o productos químicos que regulan el crecimiento de las plantas. Si la composición a aplicar es un sólido (tal como una formulación seca de microbios, HYT C, quitina, glucosamina, quitosano o aminoácidos), el sólido se puede aplicar directamente al suelo, plantas, o partes de plantas, o pueden suspenderse o disolverse en agua (u otro líquido) antes de su uso. En algunos ejemplos, HYT C se seca y microniza antes de su uso.
Las composiciones microbianas divulgadas (solas o en combinación con otros componentes divulgados en el presente documento, tal como HYT B, HYT C y/o HYT D) se pueden administrar de diversas formas en diferentes estadios de desarrollo de la planta, dependiendo de la situación del cultivo y las prácticas agrícolas. En algunos ejemplos, una composición microbiana divulgada y HYT B se mezclan y diluyen con fertilizante líquido y se aplican en el momento de la siembra de las semillas a una tasa de 0,5 a 1 a 2 litros cada uno por acre (0,40 ha), o como alternativa se aplican individualmente. En otros ejemplos, una composición microbiana divulgada y HYT B se mezclan y diluyen y se aplican en la plantación de semillas, y también se aplican al suelo cerca de las raíces en múltiples momentos durante el crecimiento de la planta, a una tasa de 0,5 a 1 a 2 litros cada uno por acre, o como alternativa se aplican individualmente. En otros ejemplos adicionales, una composición microbiana divulgada y HYT B se diluyen y administran juntos mediante riego por goteo en baja concentración a medida que se establecen plántulas o trasplantes, se administran en riego por inundación, o se dispensan como una mezcla diluida con nutrientes en riego por aspersión o por goteo en invernaderos para plántulas o plantas establecidas, o como alternativa se aplican individualmente. En ejemplos adicionales, se añade una composición microbiana divulgada a otros tratamientos del suelo en el campo, tal como la adición a tratamientos insecticidas, para permitir la facilidad de uso. En otros ejemplos, tales como invernaderos, una composición microbiana divulgada y HYT B se usan individualmente o conjuntamente, combinado con fertilizante líquido (tal como fertilizante para peces) y otros nutrientes e inyectado en sistemas de riego por aspersión con agua o líneas de riego por goteo durante el transcurso del crecimiento de la planta. En un ejemplo de invernadero, una composición microbiana divulgada y HYT B se usan conjuntamente, por ejemplo, diluido y aplicado durante riego por aspersión o fertirrigación a una tasa de 0,25 a 1 litro en el momento de la germinación de las plántulas, seguido de 0,25 a 1 litro durante el ciclo de crecimiento medio con fertirrigación, y finalmente de 0,25 a 1 litro de fertirrigación 5 a 10 días al final del ciclo de crecimiento.
En algunas realizaciones, una composición o consorcio microbiano divulgado (tal como A1007) y HYT B se aplican juntos o individualmente (por ejemplo, secuencialmente) para promover el rendimiento, vigor, tipología, calidad, desarrollo radicular o tolerancia al estrés en los cultivos. En un ejemplo específico donde el cultivo es maíz, se agregan de 1 a 2 l/acre de composición microbiana en el surco con fertilizante líquido en el momento de la siembra de semillas, o se aplican como complemento durante la fertilización después del estadio V3, seguido de 0,5 a 2 l/acre de HYT B como pulverización foliar después del estadio V5, añadido y diluido con herbicidas, pesticidas foliares, micronutrientes o fertilizantes.
En otro ejemplo específico donde el cultivo es patata, se diluyen de 1 a 3 l/acre de composición microbiana y se usan solos o con 1 a 3 l/acre de HYT B en la siembra de tubérculos; esto puede ir seguido de aplicaciones posteriores al suelo de la composición microbiana y HYT B antes de la tuberización, ya sea solos (por ejemplo, secuencialmente) o juntos. Después de la emergencia de la planta, se pueden realizar aplicaciones foliares de la patata de HYT B de 1 a 2 l/acre, ya sea diluido solo o mezclado con herbicida, pesticida foliar, tratamientos de micronutrientes y/o fertilizantes, y se aplican durante la temporada de crecimiento una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces o más.
En otro ejemplo específico donde el cultivo es algodón, se aplican de 1 a 2 l/acre de composición microbiana en el surco en el momento de la siembra, como complemento, o 2 x 2 [2 pulgadas (5 cm) a los lados y 2 pulgadas (5 cm) debajo de la semilla], con o sin fertilizante. En la primera floración del algodón blanco, se pueden aplicar tratamientos foliares de 0,5 a 2 l/acre de HYT B, diluidos solos o combinados con otros nutrientes, tratamientos herbicidas o pesticidas.
En otro ejemplo particular donde el cultivo es trigo, la composición microbiana (1 a 2 l/acre) se aplica después de la latencia invernal (estadio S4) y HYT B se aplica foliarmente (0,5 a 2 l/acre; estadio S4 a S10).
En un ejemplo donde el cultivo es caña de azúcar, un método de aplicación utiliza una composición microbiana descrita y HYT B de 2 a 4 l/acre cada uno, aplicado al suelo durante la siembra de caña o como complemento, con HYT B foliar aplicado de 1 a 2 l/acre, mezclado con agua o fertilizantes o micronutrientes.
HYT B se puede utilizar solo como tratamiento foliar en todos los cultivos para mejorar rasgos como la tolerancia al estrés de las plantas, vigor vegetativo, calidad de la cosecha y rendimiento. En un ejemplo donde el cultivo es maíz, HYT B se puede aplicar a una tasa de A a 1 l/acre, una o varias veces, mezclado con agua o pesticidas o herbicidas. En otro ejemplo, HYT B se puede utilizar para tratar el trigo como pulverización foliar, mezclado con agua o pesticidas o herbicidas, a una tasa de A a 1 l/acre, aplicando una o varias veces.
En todos los cultivos, Se puede agregar HYT C al suelo a una tasa de aproximadamente 0,5-2 kg/acre (tal como aproximadamente 0,5 kg/acre, aproximadamente 1 kg/acre, aproximadamente 1,5 kg/acre, o aproximadamente 2 kg/acre) en el momento del establecimiento del cultivo o la siembra. En otros ejemplos, HYT C se agrega a una solución de riego por goteo de una composición microbiana divulgada y HYT B o se agrega a aplicaciones de fertilización que contienen una composición microbiana divulgada y HYT B en invernaderos, tal como los ejemplos anteriores.
En realizaciones adicionales, HYT D (solo o en combinación con los microbios u otros componentes divulgados en el presente documento) se usa a aproximadamente 1-20 l/hectárea (tal como aproximadamente 1-15 l/hectárea, aproximadamente 3-10 l/hectárea, o aproximadamente 3-5 l/hectárea). En otros ejemplos, HYT D (solo o en combinación con los microbios u otros componentes divulgados en el presente documento) se usa como tratamiento de semillas para mejorar el rendimiento y los resultados del cultivo (por ejemplo, aproximadamente 1-10 l/kg de semilla, tal como aproximadamente 1-3 l/kg, aproximadamente 3-5 l/kg, o aproximadamente 5-10 l/kg). De manera alternativa, HYT D se puede usar en el suelo (solo o en combinación con los microbios u otros componentes divulgados en el presente documento) a aproximadamente 1-3 l/hectárea para aumentar el crecimiento de las plantas, por ejemplo, para ayudar a las plantas a seguir siendo productivas en condiciones de estrés.
En algunos ejemplos, el tratamiento del suelo, semillas, plantas, o partes de plantas con una composición que comprende los microbios en un consorcio microbiano divulgado aumenta el crecimiento de las plantas (tal como el tamaño total de la planta, la cantidad de follaje, número de raíces, diámetro de la raíz, longitud de la raíz, producción de brotes, producción de frutos, producción de polen o producción de semillas) en al menos aproximadamente 5 % (por ejemplo, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 100 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, o más). En otros ejemplos, los métodos divulgados dan como resultado una mayor producción de cultivos de aproximadamente 10-75 % (tal como aproximadamente 20-60 % o aproximadamente 30-50 %) en comparación con cultivos no tratados. Otras medidas del rendimiento del cultivo incluyen calidad de la fruta, rendimiento, contenido de almidón o sólidos, contenido de azúcar o brix, vida útil de la fruta o producto cosechable, producción de rendimiento comercializable o tamaño objetivo, calidad de la fruta o del producto, macollamiento de la hierba y resistencia al tránsito peatonal en el césped, polinización y cuajado de frutos, floración, número de flores, vida útil de las flores, calidad de la floración, enraizamiento y masa radicular, resistencia del cultivo al encamado, tolerancia al estrés abiótico por calor, sequía, frío y recuperación después del estrés, adaptabilidad a suelos pobres, nivel de fotosíntesis y enverdecimiento, y sanidad vegetal. Para determinar la eficacia de los productos, los controles incluyen las mismas prácticas agronómicas sin adición de microbios, realizado en paralelo.
Los métodos y composiciones divulgados se pueden usar en relación con cualquier cultivo (por ejemplo, para el tratamiento directo del cultivo o para el tratamiento del suelo antes o después de la siembra). Los cultivos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, alfalfa, almendra, plátano, cebada, brócoli, colza, zanahorias, cultivos de cítricos y árboles frutales, maíz, algodón, pepino, flores y ornamentales, ajo, uvas, lúpulo, plantas hortícolas, puerro, melón, palma aceitera, cebolla, cacahuete y legumbres, piña, chopo, pinos y árboles madereros, patata, frambuesa, arroz, sésamo, sorgo, soja, calabacita, fresa, caña de azúcar, girasol, tomate, césped y pastos forrajeros, sandía, trigo y eucalipto.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar determinadas características y/o realizaciones particulares. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes de la divulgación a las características o realizaciones particulares descritas.
Ejemplo 1
Consorcio m icrobiano A1007
Este ejemplo describe la producción del consorcio microbiano A1007.
A1007 se produjo a partir de un lote de semillas de microbios que originalmente se obtuvieron de suelos fértiles y microbios adicionales (tales comoBacillusspp.) (ver, p. ej., patente de los Estados Unidos n.° 8.748.124). El cultivo de "siembra" se mezcló con una suspensión que contenía 5,5 % p/p de proteína de suero y 1,2 % p/p de yogur en agua ("C vat") y una suspensión que contenía 0,1 % p/p de espirulina y 0,1 % p/p de extracto de algas marinas en agua ("A vat"). Las suspensiones de A vat y C vat se prepararon individualmente cada una 3 días antes de mezclarlas con el cultivo de siembra y se incubaron a temperatura ambiente. El cultivo de siembra, C vat y A vat se mezclaron en una proporción de aproximadamente 81:9:9. Después de mezclar, una suspensión de componentes adicionales que contenía aproximadamente 70 % v/v de melaza, 0,5 % v/v de HYT B, 0,003 % p/v de goma arábiga y 0,02 % p/v de levadura de cerveza (S.cerevisiae)se mezclaron con la mezcla del cultivo de siembra, C vat y A vat y agua adicional en una proporción de aproximadamente 16:34:50. La mezcla se fermentó durante aproximadamente 7 días a temperatura ambiente (aproximadamente 19-35 °C). Después de 7 días, los tanques se airearon durante 30 minutos cada dos días. Se añadió agua adicional (aproximadamente un 10 % más v/v) y se continuó la fermentación en las mismas condiciones durante aproximadamente 10 días más. Se añadió agua adicional (aproximadamente un 4 % más v/v) y la fermentación continuó durante aproximadamente 7 días más, momento en el que se recolectaron muestras para su análisis y depósito en la ATCC. El consorcio resultante (denominado A1007) se almacenó posteriormente en contenedores a temperatura ambiente. En la figura 1 se muestra un diagrama esquemático que muestra un ejemplo ilustrativo para la producción de A1007.
Ejemplo 2
Análisis del recuento m icrobiano en A1007 mediante sembrado en placa
Este ejemplo describe el análisis de la carga microbiana viable presente en A1007 mediante extensión en placa en condiciones aerobias y anaerobias.
Se recogieron muestras (de 1 litro a 5 litros) de un recipiente bien mezclado de A1007 utilizando una bomba de tambor de sifón manual desinfectada. El análisis del recuento microbiano se realizó utilizando una metodología de extensión en placa para determinar las unidades formadoras de colonias (UFC) en las muestras. Todas las muestras se almacenaron a temperatura ambiente en recipientes ligeros y herméticos. Después de mezclar vigorosamente la muestra para asegurar que el contenido se dispersara uniformemente, se retuvo 1 ml. De esta alícuota, se recogieron asépticamente 0,1 ml y se mezclaron con 9,9 ml de agua estéril en un tubo de cultivo (dilución 10-2). A continuación, se mezcló en vórtex el tubo (p. ej., 60 segundos a 2000 rpm) y se prepararon diluciones en serie de 10 veces en agua (hasta una dilución 1:109). Posteriormente se esparcieron cien microlitros de cada dilución sobre medios semisólidos en placas Petri de 100 mm utilizando un esparcidor estéril en forma de L. Se usaron placas que contienen agar para método estándar (SMA; BD n.° 247940), Agar nutritivo (NA; BD n.° 213000) u otro medio de crecimiento seleccionado (Tabla 2). A continuación, las placas inoculadas se incubaron en cámaras de temperatura controlada entre 22 °C y 35 °C. Para la evaluación de los recuentos de microbios anaerobios, las placas se colocaron primero en cajas anaerobias (p. ej., BD GasPak™ EZ Container Systems, BD Diagnostics) antes de la incubación a la temperatura deseada. En algunos casos, la alícuota que se iba a analizar se incubó primero en agua peptonada estéril durante un período de hasta 3 días a temperaturas de hasta 35 °C antes de realizar diluciones en serie y sembrar en placas como se ha descrito anteriormente.
T l 2. M i mi li iliz r i l r mi r i A1 7
Después de la incubación, todas las colonias en placas seleccionadas se contaron usando un contador de colonias tal como Quebec® Dark-Field Colony Counter (Reichert) y las UFC)/ml. Para A1007 tratado con peptona, la siembra en placa mostró 8,73 * 109 UFC/ml en condiciones aerobias y 1,4 * 109 UFC/ml en condiciones anaerobias. Para A1007 que no se incubó con peptona, la siembra en placa mostró 3,28 * 105 UFC/ml en condiciones aerobias y 3,55 * 105 UFC/ml en condiciones anaerobias.
Ejemplo 3
Análisis de m icrobios en A1007 mediante purificación de colonias
Este ejemplo describe la purificación de colonias y el análisis de un subconjunto de microbios presentes en A1007.
Después de mezclar vigorosamente la muestra de A1007 para garantizar que el contenido se dispersara uniformemente, se obtuvo una alícuota de 1 ml. De esta alícuota, se sembraron directamente 0,1 ml en medios semisólidos utilizando el método de extensión en placa descrito anteriormente. Se seleccionaron medios de diversas composiciones para condiciones de crecimiento tanto selectivas como no selectivas. La Tabla 2 resume los medios utilizados para el aislamiento de microorganismos de A1007. Las placas se incubaron en condiciones aerobias o anaerobias como se describe en el Ejemplo 2 a temperaturas que variaron de 22 °C a 35 °C.
La selección de cepas microbianas para investigaciones adicionales se basó en las características macroscópicas y microscópicas clásicas de las colonias que crecen en medios semisólidos (Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria; Editor(es): William B. Whitman, 2012). Se usaron criterios tales como el color de la colonia, la densidad o la morfología. Adicionalmente, se utilizó la morfología celular y la tinción diferencial, como la tinción de Gram, para estudiar células individuales derivadas de colonias utilizando un microscopio digital de campo brillante.
Ejemplo 4
Análisis de m icrobios en A1007 mediante secuenciación
Este ejemplo describe el análisis de microbios en A1007 mediante la secuenciación del ADNr 16S.
Se extrajo ADN genómico de colonias aisladas obtenidas como se describe en el Ejemplo 3. El ADNr 16S se amplificó mediante PCR y se secuenció, por ejemplo, utilizando el sistema de identificación microbiana MICROSEQ ID (Applied Biosystems/Life Technologies, Grand Island, NY). Se analizaron los datos de secuenciación, por ejemplo, utilizando el software SHERLOCK DNA (MIDI Labs, Newark, DE). Las secuencias se compararon con bases de datos públicas para identificar los microbios. Las secuencias de ADNr 16S obtenidas se proporcionan en el presente documento como SEQ ID NO: 1-17.
Ejemplo 5
Crecimiento de m icrobios en fertilizantes nitrogenados
Este ejemplo describe la selección de subpoblaciones del consorcio microbiano utilizando diferentes condiciones de crecimiento, tal como la exposición a fertilizantes líquidos. Este ejemplo también demuestra la tolerancia de los microbios a altas concentraciones de fertilizantes nitrogenados y la utilidad de combinar el consorcio de microbios con fertilizantes utilizados en la agricultura.
A1007 se combinó con fertilizante líquido de urea, amoníaco y nitrógeno (UAN 32) en una proporción de 80:1 (fertilizante:microbios) en tubos de cultivo de 50 ml mantenidos a temperatura ambiente y en la oscuridad. Se recogieron pequeñas alícuotas (0,1 ml) hasta 3 semanas desde el inicio de la incubación y se procesaron para el aislamiento de colonias usando el método de extensión en placa/dilución en serie descrito en el Ejemplo 3. El cultivo en placas y el aislamiento de las colonias se realizó como se ha descrito anteriormente utilizando medios tanto selectivos como no selectivos. Las colonias microbianas se seleccionaron según la morfología de la colonia, color, tamaño y condiciones de crecimiento, incluida la tinción de Gram. Se enviaron colonias limpiamente separadas a MIDI Labs Inc. (Newark, DE) para la secuenciación del ADN ribosómico de la región variable 16S para la identificación de especies (como se describe en el Ejemplo 4).
Se identificaron aislados purificados y se enumeran en la Tabla 3, lo que indica la recuperación de estas cepas en condiciones de crecimiento no UAN o UAN. Se asignó una coincidencia a nivel de especie si el % DG (diferencia genérica) entre la coincidencia desconocida y la más cercana era menor que el % DG promedio aproximado entre especies dentro de esa familia genética en particular, que suele ser del 1 %. Se asignó una coincidencia a nivel de género cuando la secuencia no cumplía con los requisitos para una coincidencia a nivel de especie, pero seguía agrupada dentro de la ramificación de un género bien definido (1 %< % DG <3 %).
Tabla 3. Microbios identificados mediante secuenciación de colonias de A1007 cultivadas en presencia o ausencia de UAN.
continuación
Ejemplo 6
Biodegradación de materiales que contienen quitina
Este ejemplo describe métodos ilustrativos para la biodegradación de materiales biológicos que contienen quitina utilizando el consorcio microbiano A1007. Sin embargo, un experto en la materia apreciará que también se pueden usar métodos que se desvían de estos métodos específicos para la biodegradación exitosa de materiales biológicos que contienen quitina.
Los subproductos de la gamba se obtienen de plantas procesadoras de gambas y se transportan en contenedores cerrados, refrigerados. Después de la inspección de la calidad de la materia prima, los subproductos de la gamba se procesan para reducir el tamaño de las partículas hasta aproximadamente 3-5 mm. Los cultivos microbianos A1007 (aproximadamente 0,2-100 ml/l) preactivados, p. ej., con azúcar (aproximadamente 2,5 g/l) y sacarosa (aproximadamente 5 g/l) se mezclan con el subproducto de gamba homogeneizado (aproximadamente 50 g/l) y se agita hasta que mezcla es homogénea. Con agitación continua, la temperatura se mantiene a temperatura ambiente (aproximadamente 19-35 °C) y el pH se ajusta a 3,5-4,0 con ácido cítrico. Los ingredientes mezclados se transfieren a un tanque de fermentación desinfectado (25.000 l) y se fermentan a 30-36 °C durante 120 horas. La agitación se aplica durante 30 minutos al menos dos veces al día. Durante el proceso de fermentación, se controla el pH y la acidez titulable total (TTA, %) se determina mediante valoración con NaOH 0,1 N. La fermentación se detiene cuando la TTA es aproximadamente del 3,5 % y/o el pH es aproximadamente 4-5.
Los cultivos fermentados se alimentan a un decantador continuo. La capa sólida separada de la etapa de decantación se somete a centrifugación para eliminar la capa lipídica. El líquido purificado (HYT B) se mezcla con azúcar (tal como melaza, 10 % v/v), a continuación, se almacena en tanques de retención o se dispensa en contenedores. Los materiales sólidos de la etapa de decantación se secan con aire sobrecalentado a 120 °C hasta que su contenido de humedad sea inferior al 8 %, a continuación, se trituran usando una malla 200. El producto seco (HYT C) se envasa en bolsas o sacos.
Ejemplo 7
Biodegradación de la quitina
Este ejemplo describe métodos ilustrativos para la biodegradación de quitina utilizando el consorcio microbiano A1007. Sin embargo, un experto en la materia apreciará que también se pueden usar métodos que se desvíen de estos métodos específicos para una biodegradación exitosa de la quitina.
El cultivo microbiano A1007 se preactiva con azúcar (aproximadamente 2,5 g/l) en un tanque de 10.000 litros durante tres días. El inóculo activado se mezcla con hidrolizado de proteínas, tal como HYT B (aproximadamente 500 ml/l) y quitina (HYT C, p. ej., producido como se describe en el Ejemplo 6). La mezcla se mezcla suavemente durante 1 hora para lograr una homogeneización completa. La mezcla se fermenta durante 20 días a temperatura ambiente (p. ej., aproximadamente 19-35 °C) con agitación durante aproximadamente 8 horas diarias y control del pH (pH 4,0-5,0). Se pueden recoger muestras periódicamente, por ejemplo, cada dos días, para la cuantificación de glucosamina y opcionalmente quitosano. Una vez completada la fermentación, la mezcla se filtra a través de un filtro que retiene partículas de malla 300, principalmente la quitina restante. El filtrado se retiene y se embotella después de la caracterización del producto.
Ejemplo 8
Tratamiento del maíz de campo con composiciones microbianas
Este ejemplo describe un método representativo para obtener un mayor rendimiento del cultivo de maíz de campo, utilizando un consorcio microbiano. Un experto en la materia apreciará que también se pueden usar métodos que se desvían de estos métodos específicos para aumentar el rendimiento de los cultivos.
El tratamiento del maíz de campo con una composición microbiana similar a A1007, o con HYT B, mostró un fuerte aumento en el rendimiento final cosechable. Todas las prácticas agronómicas de fertilización, cultivo, control de malezas y control de plagas, fueron idénticas y paralelas para las parcelas tratadas con composición microbiana o HYT B (Prueba) y las parcelas de control (Verificación).
El ensayo A demostró que, cuando se evalúa en un ensayo de diseño de parcela replicado, una única inoculación en el suelo del maíz con la composición microbiana a 1 l/acre en surco en el estadio V6, administrada con 28 % de fertilizante nitrogenado mediante riego por goteo, produjo un aumento del rendimiento del 14 % respecto al control no tratado en cinco parcelas replicadas (figura 4A).
El ensayo B mostró que HYT B, cuando se usa solo como tratamiento foliar en maíz, también produjo un aumento del rendimiento del 9,5 % en comparación con el control no tratado cuando se ensayaba en un ensayo aleatorizado con diseño de parcelas replicadas. HYT B se pulverizó en las hojas en dos aplicaciones de 1 l/acre cada aplicación, en los estadios V8 y VT (figura 4B).
El ensayo C también fue un ensayo aleatorizado con diseño de parcelas replicadas en maíz, realizado en condiciones de estrés hídrico. En este estudio, la cantidad de riego se limitó a 11 pulgadas (28 cm) de agua, en comparación con las parcelas adecuadamente regadas que recibieron 17 pulgadas (43 cm) de riego. Un único tratamiento con la composición microbiana de 1 l/acre, administrado en el estadio V6 con 28 % de fertilizante nitrogenado mediante riego por goteo (Tratado), produjo un aumento del rendimiento del 38 % en comparación con las parcelas tratadas solo con fertilizante (Verificación no tratado). El aumento de cosecha observado con el tratamiento con la composición microbiana representa un potencial de 31 Bu/acre mayor de rendimiento (figura 4C).
Ejemplo 9
Tratamiento del tomate con A1007
Este ejemplo describe el efecto de las composiciones microbianas de A1007 sobre el rendimiento del cultivo de tomate. El tratamiento del tomate con la composición microbiana mostró un fuerte aumento en el rendimiento final cosechable. Todas las prácticas agronómicas de fertilización, cultivo, control de malezas y control de plagas, fueron idénticas y paralelas para las parcelas tratadas con composición microbiana (Prueba) y de control (Verificación).
El consorcio microbiano A1007 (denominado en este ejemplo "HYT A") se ensayó en un ensayo de invernadero completamente aleatorizado con diseño de parcelas replicadas de un cultivar de tomate indeterminado, comparando la frecuencia y dosis de aplicación microbiana y el impacto en el rendimiento. En todos los casos, se emplearon prácticas agrícolas estándar idénticas, incluido el aporte nutricional, la polinización y el control de plagas. El suelo fue pretratado con HYT A (2 l/ha) más HYT B (6 l/ha), con una dosis adicional al momento de la siembra (HYT A 1 l/ha, HYT B 3 l/ha). Durante el crecimiento de las plantas, el tratamiento se aplicó en tres réplicas, cada parcela de 30 metros cuadrados, con HYT A y HYT B aplicado mediante riego por goteo a intervalos de tres semanas, con la primera dosis duplicada (HYT A 2 l/ha, HYT B 4 l/ha) y las dosis posteriores a la mitad de esa tasa (HYT A 1 l/ha y HYT B 2 l/ha). El rendimiento se midió en cada cosecha de fruta durante un ciclo de cosecha de seis meses.
El tratamiento 1 no fue activado ni preincubado antes de la exposición de la planta, mientras que el Tratamiento 3 representa HYT A/HYT B que se preincubaron conjuntamente y se activaron, durante tres días antes de la aplicación. En este caso, los rendimientos de tomate tanto para los activados como para los no activados fueron casi idénticos: 370 kg/parcela y 369 kg/parcela. En comparación con el control (Tratamiento 4), este aumento de rendimiento es de aproximadamente 50 kg/parcela de 30 metros cuadrados (aumento de rendimiento del 15 %), lo que representa un potencial de aumento del rendimiento de 16.600 kg/ha. Incluso a mitad de la tasa de HYT A y HYT B (Tratamiento 2) aumenta la productividad general en 25 kg/parcela o aproximadamente un 8 % de aumento del rendimiento (figura 5).
Ejemplo 10
Mayor tolerancia al estrés en la patata
Este ejemplo describe un método representativo para obtener una mayor calidad de los tubérculos de patata tratándolos con una composición microbiana similar a A1007 y HYT B durante el crecimiento en condiciones de campo estresantes.
Se cultivó patata de la variedad Russet Burbank en condiciones convencionales en un ensayo de parcela replicado (cuatro réplicas) y se trató (composición microbiana más HYT B, 1 litro de cada por acre, en el momento de la siembra, en surco, seguido de dos aplicaciones foliares de HYT B de 1 l/acre a los 55 días y nuevamente 85 días después de la siembra) o no se trató (control). La variedad Russet Burbank tiende a tener una calidad inferior en condiciones de estrés hídrico, térmico o nutricional. En este ensayo, la composición microbiana y el tratamiento con HYT B mejoraron la tolerancia a un defecto de calidad inducido por el estrés llamado corazón hueco. Las parcelas tratadas con composición microbiana tuvieron una incidencia de 1,68 % de tubérculos cosechados con corazón hueco en comparación con el control que presentó 8,35 % de defectos de corazón hueco (Tabla 4).
T l 4. D f li l r z n h l
Ejemplo 11
Mayor tolerancia a los nematodos en la patata
Se plantaron grandes franjas de ensayo (0,12 ha/tratamiento) de la variedad de patata Nectar en tierras con alta incidencia de infestación por nematodos del quiste de la patata (PCN). Al principio del ensayo, se efectuaron los recuentos de huevos y quistes de PCN en el suelo en 8 ubicaciones GPS múltiples por parcela, de los cuales se tomaron 20 muestras independientes y se combinaron en una muestra amalgamada en cada ubicación, que representa los niveles iniciales de infección por PCN. Estos recuentos de huevos y quistes se repitieron al final del ensayo en la misma ubicación del GPS en el momento de la cosecha para evaluar el impacto del tratamiento en la replicación de PCN durante toda la temporada. Se cosecharon de 10 a 24 plantas, dependiendo del sitio, por parcela en cada ubicación GPS para medir el rendimiento próximo a mediciones específicas de PCN. Adicionalmente, se cosecharon tubérculos de toda la franja de ensayo de 0,12 ha para cada tratamiento para obtener el rendimiento total de la parcela. Se compararon cinco tratamientos diferentes, incluidos A1007 ("HYT A") más HYT B (una vez en la siembra y otra en la emergencia) a una tasa de 4 l/ha de HYT A y 2,5 l/ha de HYT B, con o sin 4 l adicionales de HYT D (dos veces, aplicados en la siembra y en la emergencia) o 1,5 kg/ha de HYT C (dos veces, aplicados en la siembra y en la emergencia). Las parcelas de control en este estudio utilizaron la práctica agrícola convencional de tratar con el nematicida fostiazato (Nemathorin 10G que contiene 10 % p/p de fostiazato, 30 kg/ha) o la parcela de control no tratada.
Cuando se evalúa en las ubicaciones GPS específicas, el tratamiento con Nemathorin redujo significativamente los recuentos de huevos/quistes de nematodos en comparación con los otros tratamientos (figura 6<a>). Cuando se compara la cosecha total de cada tratamiento, el tratamiento con la combinación HYT A-HYT B-HYT D produjo un 15 % más de rendimiento que el control sin tratar y aproximadamente un 25 % más de rendimiento que el tratamiento con Nemathorin (figura 6B). Estos resultados sugieren que un tratamiento combinado HYT A-HYT B-HYT D no es nematicida, pero puede ayudar a que las plantas sigan siendo productivas en presencia de nematodos, por ejemplo, al favorecer potencialmente la absorción de nutrientes, manteniendo así la salud de las plantas.
Ejemplo 12
Mayor v igor de las plantas en sistemas de plantas modelo
Se pueden utilizar ensayos funcionales rápidos basados en plantas para evaluar rápidamente la respuesta de las plantas a nuevas composiciones microbianas. Utilizando un ensayo de vigor y crecimiento de plantas de pepino, este ejemplo demuestra que A1007 mejora la tasa de crecimiento y expansión de las hojas de las plantas.
La composición microbiana A1007 se diluyó 1:2000 en un medio fertilizante nutritivo. Después de la pregerminación de plántulas de pepino en papel de germinación enrollado empapado en nutrientes durante cuatro días, se trataron plantas establecidas y sincronizadas con la mezcla diluida de fertilizante líquido y A1007. Las plántulas se trasplantaron a un medio de crecimiento sin suelo preparado y pretratado con fertilizante y A1007. Como tratamientos de control, se comparó una cantidad equivalente de agua añadida a un medio nutritivo o una dilución 1:2000 de A1007 esterilizado mediante un filtro de 0,2 |jm. Al menos 18 plantas de cada tratamiento cultivadas en macetas, incluyendo las plantas de control, fueron distribuidas al azar en semilleros y cultivadas en condiciones de crecimiento definidas, controlando la temperatura y la luz. Después de 17 días, se midió el Índice de área foliar (LAI) de la primera hoja verdadera de cada planta. Se realizó una segunda medición del LAI de la tercera hoja verdadera alrededor del día 28. También se registró el peso húmedo total de la planta. Los datos se analizaron mediante ANOVA (análisis de la varianza) unidireccional y con la prueba post-hoc de Tukey para comparar muestras dentro del experimento.
El día 17, las clasificaciones del LAI de la primera hoja de los tres tratamientos mostraron diferencias menores. El día 27, el mayor crecimiento de la tercera hoja (LAI) promovido por A1007 fue significativamente mayor que el de los controles de agua o A1007 esterilizado por filtración (figura 7).
Ejemplo 13
Análisis de m icrobios en A1007 mediante micromatrices
Este ejemplo describe el análisis de micromatrices de microbios presentes en A1007.
Se utilizó una muestra de 1 ml de solución A1007 bien mezclada para la preparación del ADN genómico utilizando PowerSoil® DNA isolation kit (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA). La comunidad microbiana de A1007 se analizó con el ensayo PhyloChip (Second Genome, South San Francisco, CA) utilizando el ADN genómico aislado. Mediante este análisis se identificaron un total de 578 Unidades Taxonómicas Operativas (OTU) de A1007. Los datos del análisis de micromatrices se usaron para seleccionar microbios para su inclusión en las composiciones descritas en el presente documento, en combinación con los datos descritos en los Ejemplos 2-4. En particular, el análisis de micromatrices identificó la presencia deStreptomyces spp.de A1007, que fue seleccionado para su inclusión en algunas de las composiciones microbianas descritas en el presente documento.
El alcance de la invención se define exclusivamente por las siguientes reivindicaciones.
Claims (12)
1. Una composición que comprende los microbios del Depósito de Patente ATCC PTA-122728.
2. La composición de la reivindicación 1, que comprende además células de uno o más deBacillus subterraneus, Bacillus oceanis ediminis, Bacillus firmus, Virgibacillus halophilus, Brevibacillus brevis, Paenibacillus validus, Paenibacillus timonensis, Paenibacillus cineris, Paenibacillus rhizoospherae, Paenibacillus favisporus, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium sphenoides, Lysinibacillus fusiformisyRummeliibacillus stabekisii.
3. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además células de uno o más deAzotobacter spp.yRhizobium spp.
4. La composición de la reivindicación 3, en dondeAzotobacter spp.comprendeAzotobacter vinelandiiy/oAzotobacter chroococcumoRhizobium spp.comprendeRhizobium japonicusy/oRhizobium leguminosarum.
5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además uno o más de quitina, quitosano, glucosamina y aminoácidos.
6. Un método que comprende:
mezclar una fuente biológica que contiene quitina con la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para formar una mezcla;
fermentar la mezcla; y
separar la mezcla fermentada en fracciones sólidas, acuosas y lipídicas.
7. El método de la reivindicación 6, en donde la fuente biológica que contiene quitina comprende un animal marino o un subproducto de un animal marino, un insecto o un hongo.
8. El método de la reivindicación 7, en donde el animal marino es un artrópodo marino.
9. El método de la reivindicación 8, en donde el artrópodo marino es gamba, cangrejo o kril.
10. Un método que comprende poner en contacto suelo, plantas, o partes de plantas con la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
11. El método de la reivindicación 10, que comprende además poner en contacto el suelo, plantas o partes de plantas con uno o más de quitina, quitosano, glucosamina y aminoácidos.
12. El método de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, que comprende además poner en contacto el suelo, plantas o partes de plantas con un fertilizante líquido y/o uno o más pesticidas, uno o más fungicidas, uno o más herbicidas, uno o más insecticidas, una o más hormonas vegetales, uno o más elicitores de plantas, o combinaciones de dos o más de los mismos.
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