CN114317317A - 一株耐盐并高产脂肽的贝莱斯芽孢杆菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供了提供了一株耐盐并高产脂肽的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)及应用。所述贝莱斯芽孢杆菌筛选自东北传统自然发酵的豆酱，保藏编号为CGMCC No.23402。该菌株能高产脂肽，且能有效抑制金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、青霉菌、大肠杆菌和沙门氏菌等食品中常见的致病菌，可广泛应用于食品生产领域。

Description

一株耐盐并高产脂肽的贝莱斯芽孢杆菌及应用

技术领域

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一株新型耐盐并高产脂肽的贝莱斯芽孢杆菌及应用。

背景技术

脂肽是芽孢杆菌的次级代谢产物，由一定功能模块组合而成的非核糖体多肽合成酶系生产合成。脂肽具有低毒性、等电点高、理化性质稳定、耐热性以及酸碱性好、安全无毒和稳定性高等特点。脂肽有较强的生物作用，如植物疾病控制、抗肿瘤、抗病毒活性和广泛的抗菌谱，因此脂肽在食品、生物医药、农业和工艺等领域广泛被应用。脂肽根据其氨基酸组成以及脂肪酸链长度可分为不同类型，其主要类型为表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和芬荠素(Fengycin)。Surfactin型脂肽是一类具有较强生物表面活性的物质，能降低植物根的表面张力，还可作为生物膜的洗涤剂，另外它还具有抵抗溃疡，降低胆固醇，抗击炎症的功效。Iturin型脂肽对植物病原菌具有良好抑制作用，对大部分真菌和少部分细菌有抑菌作用，因其安全无毒且不会破坏生态环境，因此在农业中该型脂肽可作为生产农业的成分，将代替传统的化学农药，使农产品更安全。Fengycin型脂肽具有很强的溶血活性和抑制真菌作用，因此具有良好的生防价值。

脂肽最显著的特点和优势就是其具有良好的抑菌特性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒和支原体均有一定抑制效果。在食品加工过程中经常发生食源性微生物污染，人们误食后引起食物中毒，危害人体健康。在所有食品安全事件中，金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌是引起食源性疾病的两种主要的食源性致病微生物。目前，杀灭两种食源性致病微生物的方法大多数采用抗生素治疗，但是随着抗生素的滥用，出现了多种耐药菌，不断危害人类的健康。有研究表明，脂肽的抑菌机制和抗生素抑菌机理完全不同，脂肽通过拮抗作用破坏细胞壁结构或改变细胞膜的通透性来产生抑菌效果。另外，在2018年《nature》期刊中刊登了fengycins型脂肽与金黄色葡萄球菌agr群体感应通路AIP信号传导分子结构相似，可以通过竞争性结合金黄色葡萄球菌Agr C受体蛋白，进而抑制金黄色葡萄球菌毒素合成及肠道定殖。所以脂肽的应用可有望高效代替传统抗生素的治疗，对有耐药性的金黄色葡萄球菌产生抑菌作用，有效地抑制了食源性疾病污染的问题，保障了食品安全。

目前，产生脂肽的微生物主要有芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷菌属(Serratia)和伯克菌属(Burkholderia)等。其中芽孢杆菌属被认为是产脂肽的主要菌属，其产生脂肽的数量和种类均多于其他微生物菌属。而且芽孢杆菌自身安全低毒，没有致病性，对人类和家畜无毒无害，对环境不会造成污染并且能够产生具有较强抑菌脂肽，因此芽孢杆菌被认为是一种安全益生性微生物，已在食品中广泛应用。在食品加工领域中可产生脂肽的芽孢杆菌主要有有枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)等。这些芽孢杆菌产生的脂肽产量较低、抑菌谱窄，抑菌效果不太明显，使脂肽在食品生产中的应用范围和应用效果受到了极大的限制。因此，筛选出可高产并具有良好抑菌效果脂肽的芽孢杆菌是当前食品加工领域的研究热点。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一株耐盐并高产脂肽的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)及应用。所述贝莱斯芽孢杆菌筛选自东北传统自然发酵的豆酱，能高产脂肽，且能有效抑制金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、青霉菌、大肠杆菌和沙门氏菌等食品中常见的致病菌，可广泛应用于食品生产领域。

本发明一方面提供了一株贝莱斯芽孢杆菌，命名为贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20(Bacillus velezensis SNBV-20)，已于2021年09月13日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23402。

所述贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20的16s rDNA序列为SEQ ID NO：1。

本发明一方面提供了贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20在制备食品发酵剂中的应用。

本发明一方面提供了贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20在制备抗菌组合物中的应用。

本发明还提供了贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20在脂肽生产中的应用。

本发明还提供了一种脂肽的生产方法，包含下列步骤：

(1)将活化后的贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20接种于LB液体培养基中，33℃恒温培养24h，得发酵液；

(2)将贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20发酵液在4℃、10000rpm条件下离心10min，保留上清液；

(3)用盐酸调节发酵上清液pH值至2.0，4℃冰箱中放置12h；

(4)将酸沉后的发酵液在4℃、10000rpm条件下离心10min，去除上清液，收集沉淀；

(5)将沉淀用甲醇反复萃取抽提3次，合并提取液，氢氧化钠调节溶液pH值至中性；

(6)选用0.22μm针式滤膜过滤器对甲醇提取液进行过滤，得到脂肽粗提液；

(3)将脂肽粗提液经减压式旋转蒸发仪在45-55℃条件下对甲醇溶液减压悬蒸，获得棕黄色固体物质，即为脂肽。

所述脂肽中包含表面活性素(Surfactin)、芬荠素(fengycins)和伊枯草菌素(Iturin)，对金黄色葡萄球菌均有显著的抑制效果。

本发明还提供了一种抗菌组合物，包含上述脂肽。

本发明还提供了上述抗菌组合物在制备食品或药品中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20筛选自东北自然发酵豆酱，耐盐性能性强，在10％浓度高盐环境中生长良好。该菌株对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、青霉菌、大肠杆菌和沙门氏菌五种食品中常见的致病菌具有显著的抑制效果，其中对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和青霉菌抑制作用最强，平均抑菌圈直径均超过15mm。

贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20能发酵高产脂肽，其发酵液中脂肽提取量高达0.135g/L，即每g菌体的脂肽提取量约为0.11g，取得了意料不到的技术效果。贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20产脂肽中具有抑菌功效的组分为表面活性素(Surfactin)、芬荠素(fengycins)和伊枯草菌素(Iturin)。所述三种类型的脂肽对金黄色葡萄球菌有显著的抑制效果。扫描电镜下观察可见，脂肽可以使金黄色葡萄球菌部分细胞壁破损，形成孔洞，甚至使细胞断裂，抑菌效果非常显著。贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20可广泛应用于天然脂肽的生产，生产周期短、产量高，且安全无毒副作用，符合食品行业要求。

贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20、其发酵产物或提取到的脂肽可单独或组合用于抗菌组合物的生产，广泛用于制备食品或药品。

附图说明

图1为革兰氏染色镜检图片；

图2为PCR产物电泳检测图；

图3为菌落形态图；

图4为***进化树；

图5为贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20产脂肽的薄层层析显色结果；

图6为贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20产脂肽的MALDI-TOF-MS及分析表；

图7为贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20产脂肽对金黄色葡萄球菌抑制效果的扫描电镜照片。

具体实施方式

本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明实施例使用的培养基及其配方如下：

LB固体培养基：10g氯化钠，10g胰蛋白胨，5g酵母浸粉，1000mL蒸馏水，pH值3.0-3.2；20g琼脂；

LB液体培养基：10g氯化钠，10g胰蛋白胨，5g酵母浸粉，1000mL蒸馏水，pH值3.0-3.2。

实施例1产脂肽菌株的分离与筛选

1、样品来源

在辽宁省沈阳市采集的传统发酵豆酱。

2、芽孢杆菌初筛

取豆酱样品1g，放入含9ml浓度为0.9％的生理盐水的试管中，充分混合。为只保留芽孢杆菌，将混合均匀后的试管，放入85℃水浴锅，水浴加热20-25min后取出。试管取出后依次进行10倍的梯度稀释，稀释液为灭好菌的0.9％生理盐水，连续稀释6次。从稀释梯度为10^-5和10^-6的两个试管中各吸取100μL稀释样品，接入LB固体平板中，使用灭过菌的涂布棒进行涂布。培养18-36h后观察平板，挑取部分单菌落转入液体LB培养基进行培养，同时将另外相同部分的单菌落进行革兰氏染色镜检，观察其形态特征。

镜检时挑选出蓝色、细长且呈杆状的单独或成链状排列、部分能有类似芽孢的物质、芽孢位于菌体中间呈圆形的菌体，共24株，镜检结果如图1所示。将各菌连续活化培养三代，直至为纯菌。

使用细菌DNA提取试剂盒提取各菌株的DNA，提取后通过超微量核酸蛋白定量仪测算各菌体的DNA浓度，再根据浓度计算配置PCR体系。

表1 PCR体系

添加提取的DNA体积根据超微量核酸蛋白定量仪测算，要求添加DNA总量为100ng，但添加体积最大为10ul。添加后将剩余提出的DNA放入-20℃冰箱中保藏，为后续复筛产脂肽的芽孢杆菌时备用。

以菌株DNA为模板，利用细菌通用上下游引物23F和1492R(由生工生物工程股份有限公司合成)进行PCR扩增。反应程序：94℃预变性5min，30个循环：94℃30s，56℃30s，32℃1min，32℃10min。

23F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；

1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。

PCR扩增产物的凝胶电泳检测结果如图2所示。

将1500bp左右对应的电泳条带送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果登入NCBI网站，进行BLAST分析。序列比对结果显示为芽孢杆菌(Bacillus sp.)的菌株共11株。

3、产脂肽芽孢杆菌的复筛

采用PCR技术进行芽孢杆菌环状脂肽合成的相关基因检测，将初筛得到的11株芽孢杆菌进行复筛，目的是筛选出主要产表面活性素、芬荠素和伊枯草菌素类型脂肽的芽孢杆菌。

(1)配置PCR扩增反应体系

设计合成3对PCR引物fen B、sfp和itu A，分别以初筛得到的11株芽孢杆菌菌株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物是由上海派森诺生物医药科技有限公司进行合成。

引物序列如下：

Sfp-F：GGCCGTATGATAGGATGGTT；

Sfp-R：GAAGTCGAGCGGCTGTTTCA；

fenB-F：CTATAGTTTGTTGACGGCTC；

fenB-R：CAGCACTGGTTCTTGTCGCA；

ituA-F：ATGTATACCAGTCAATTCC；

ituA-R：GATCCGAAGCTGACAATAG。

表2 PCR扩增反应体系(50μL)

表3 PCR扩增反应程序

(2)PCR产物的回收：

PCR产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Boyao，ASJ0013)回收，具体操作按试剂盒说明书进行。

(3)复筛结果

根据扩增结果显示，本发明初筛获得的11株芽孢杆菌中，只有一株芽孢杆菌同时产表面活性素、芬荠素和伊枯草菌素类型脂肽，并命名为SNBV-20。

实施例2SNBV-20菌株的鉴定

1、菌落形态鉴定

SNBV-20菌株的菌落形态如图3所示，菌落为小菌落，白色，呈圆形、凸起，表面光滑、光亮、不透明，湿润，边缘整齐。

2、生理生化鉴定

将SNBV-20菌株活化三代后，参照《伯杰氏细菌鉴定手册(第九版)》和东秀珠与蔡妙英(2001)编著的《常见细菌***鉴定手册》对菌株生理生化特征鉴定。具体结果见表4。

表4生理生化鉴定结果

注：“+”表示反应阳性或者生长，“–”表示反应阴性或者不生长。

3、分子生物学鉴定

(1)基因组DNA的提取：

利用细菌基因组试剂盒(Solarbio D1600)提取SNBV-20菌株的基因组DNA。

(2)PCR扩增：

设计PCR上游引物23F和下游引物1492R，由上海生物工程有限公司合成。

23F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(5'---3')；

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT(5'---3')。

PCR反应条件为：95℃预热5min，94℃变性1min，50℃退火1min，32℃延伸1min20s，循环36次；32℃保持8min，4℃保温。

(3)PCR产物的回收：

PCR产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Boyao，ASJ0013)回收，具体操作按试剂盒说明书进行。

(4)16S rDNA测序及序列比对

将阳性PCR产物送样至上海派森诺生物科技股份有限公司进行测序，获得SNBV-20菌株的16s rDNA序列为SEQ ID NO：1，如下所示。

cgtggcggggtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttaggagccagccgccgaagggggatcagag。

将SEQ ID NO：1在NCBI数据库中应用BLAST工具与GenBank数据库已有序列进行比对。结果显示，SNBV-20菌株的16s rDNA序列SEQ ID NO：1与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)的相似性最高。进一步，使用MEGA3.0构建***进化树，结果如图4所示，本发明所述SNBV-20菌株与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的同源性最高。

综上，结合菌株的菌落形态、生理生化特性和分子生物学鉴定结果，可以得出结论，本发明筛选到的SNBV-20菌株为一株新型的贝莱斯芽孢杆菌，命名为贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20(Bacillus velezensis SNBV-20)。

申请人于2021年9月13日将贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20(Bacillus velezensisSNBV-20)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.23402。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌的耐盐性分析

在LB液体培养基中按比例加入NaCl，配制成盐浓度(w/v)分别为1％、10％、15％和20％的培养基。

按2％(v/v)接种量分别将贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20接种于上述不同盐浓度的LB液体培养基中，33℃摇床转速160r/min，培养24h，同时以未接种菌体的培养基作为空白对照组。培养结束后，使用酶标仪在波长为240nm处分别测定各组的吸光值。

结果显示：盐浓度为15％和20％的培养基较为清澈，吸光值偏小镜检时未发现菌体。而盐浓度为10％的培养基浑浊，吸光值大于盐浓度为15％和20％的培养基，镜检时发现菌体，生长良好。从而说明，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20菌株有较强的耐盐性，可在高盐环境下生长。

实施例4贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20的抑菌功能测定

将贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20LB液体培养基中，33℃，摇床转速160r/min，培养24h。将活化好的芽孢杆菌于15300×g，离心10min，经0.22μm针式滤膜过滤器过滤，得上清液。

将金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌和青霉菌五种致病菌分别按照3％的接种量接种于LB液体培养基中，活化三代后使用。

用移液枪分别吸取100μL致病菌培养液，打入装有LB固体培养基的平板中进行涂布，每个致病菌重复平行重复三次，共计15个平板。将灭好菌的滤纸片剪成直径为0.3cm的圆形，并在涂布致病菌的平板中均匀摆放五处滤纸片，每处为4层。四处滤纸片添加20μL的贝莱斯芽孢杆菌的上清液，33℃培养24h。培养后利用游标卡尺测算各处牛津杯的抑菌圈直径大小。

结果显示：贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20对五种致病菌有不同抑制效果，其中对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和青霉菌抑制作用最强，平均抑菌圈直径均超过20mm；对大肠杆菌和沙门氏菌也有一定抑制效果，但抑菌圈直径达到12mm以上。

实施例5贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20的发酵生产方法

将贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20进行活化培养，以试管斜面液体LB培养基为起点，通过种子扩大化培养，恒温培养环节扩大到二级种子罐培养，以发酵罐为终点，为生产提供充足的液体菌种，满足生产需要。

将活化后的贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20菌种接种至1kg LB液体培养基中，33℃恒温培养24h成为一级种子；将一级种子接种至装有10kg LB液体培养基的二级种子罐中，调节液体培养基的pH至3，33℃恒温培养24h。发酵结束后，将发酵液在4℃、5000rpm条件下离心5min，测定发酵液中菌体重量。

结果显示：经过种子扩大化培养，恒温培养环节扩大到二级种子罐培养后，二级种子罐中含有菌种的重量为356g。

实施例6贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20产脂肽的提取

本发明釆用酸沉淀分离和有机溶剂萃取的方法，对贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20发酵液中的脂肽进行提取。具体方法如下：

将实施例5获得的贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20发酵液在4℃、10000rpm条件下离心10min，保留上清液。用盐酸调节发酵上清液pH值至2.0，4℃冰箱中放置12h。再将酸沉后的发酵液继续离心，离心条件为10min、4℃、10000rpm，去除上清液，收集沉淀。用甲醇反复萃取抽提3次，合并萃取抽取液，氢氧化钠调节溶液pH值至中性，选用0.22μm针式滤膜过滤器对甲醇提取液进行过滤，得到脂肽粗提液。粗提液经减压式旋转蒸发仪在45-55℃条件下对甲醇溶液减压悬蒸，获得的棕黄色固体物质即为提取的脂肽，进行称重，计算脂肽的提取量。称重后将脂肽重新溶于甲醇中，放入4℃冰箱保存。

脂肽的提取量＝提取后瓶的重量－提取前空瓶的重量。

结果显示：经过计算，贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20发酵液中脂肽提取量高达0.135g/L，即每g菌体预计脂肽提取量为0.11g，取得了意料不到的技术效果。

实施例7贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20产脂肽的分离纯化与组分鉴定

1、薄层层析分析

取A和B两组硅胶GF254薄层层析板，105℃加热30min活化，将实施例5提取到的贝莱斯芽孢杆菌脂肽10μL点样于薄板上，以体积比氯仿：甲醇：水(65：25：4)为展层剂层析，干燥后喷含0.5％茚三酮溶液显色观察。B组采用原位酸水解-茚三酮显色法对薄板进行处理，将展层完毕干燥后的薄板放入装有2mL浓盐酸的耐高温的密封容器中，烘箱110℃熏蒸1h，通风橱中冷却待盐酸挥发后茚三酮试剂显色，计算迁移率(Rf)值。

迁移率(Rf)＝d1/d2。

d1：原点到斑点中心的距离；d2：原点到溶剂前沿的距离。

薄层层析显色结果如图6所示，通过迁移率的判断，可知本发明所述贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20产脂肽的成分不单一，既包含环型脂肽，又含有开环或线状小分子肽类。

2、HPLC分析

利用岛津高效液相色谱仪，用C₁₈反相柱分离纯化贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20产脂肽中的组分。

以水/TFA为流动相A，以甲醇/TFA为流动相B，按照B的浓度在10min内从30％升高到30％，之后在25min内最终升高到100％的洗脱梯度进行分离纯化。手动收集HPLC各组分，用离心旋转蒸发仪浓缩，再采用滤纸片法将各组分分别进行金黄色葡萄球菌抑菌活性测定，发现只有一种组分对金黄色葡萄球菌有抑制效果。将该组分进行第二次分离纯化，纯化后再次收集到四种组分，分别再次进行抑制金黄色葡萄球菌活性测定。从抑菌效果以看出，有一种组分对金黄色葡萄球菌的抑制效果，其中一组组分抑菌圈直径达到11mm，因其有良好的抑菌效果，说明该组分可能含有脂肽物质。

2、MALDI-TOF-MS鉴定

采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser DesorptionIonization Time of Flight Mass，MALDI-TOF-MS)对经过第二次纯化后有良好抑菌效果的二种组分进行鉴定。

将CHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)基质溶解在含0.1％TFA(三氟乙酸)的30％乙腈水溶液中，基质浓度为16mg/mL，样品浓度为10mg/mL，对样品进行处理，1μL基质溶液混合1μL样品溶液，取其中0.5μL混合液点在样品靶上，自然晾干。采用正离子反射模式获得谱图，检测范围800-3000Da，电压20kV，反射电压18KV。8kV脉冲离子。结合质谱图(图6)和质谱分析表(表5)以及相关参考文献中的芽孢杆菌脂肽的分子量信息(表5)，分析确定脂肽中抑菌组分的种类。

表5质谱分析表

结果显示，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20产脂肽中具有抑菌功效的脂肽组分为表面活性素(Surfactin)、芬荠素(fengycins)和伊枯草菌素(Iturin)。所述三种类型的脂肽对金黄色葡萄球菌有显著的抑制效果。

实施例8贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20产脂肽的抑菌功能测定

1、贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20产脂肽在扫描电镜下对金黄色葡萄球菌抑菌观察

取活化后的金黄色葡萄球菌菌种，按照2％接种量接种于100mL LB液体培养基中，向其中加入贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20产生的脂肽，使其终浓度为0.8×MIC(脂肽对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为1.25mg/mL)，33℃、摇床转速160r/min，培养12h，同时设置对照组。

离心收集菌体保证菌量，用0.9％生理盐水洗涤菌体2次，于4℃条件下2.5％戊二醛固定12h，涂片风干，镀膜后在扫描电镜下观察脂肽对金黄色葡萄球菌的抑制影响，结果如图3所示。

从图3中可明显看出脂肽对金黄色葡萄球菌有良好抑制作用，脂肽可以使金黄色葡萄球菌部分细胞壁破损，形成孔洞，甚至使细胞断裂，表明本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌SNBV-20产生的脂肽有良好的抑菌效果。

除了金黄色葡萄球菌外，本发明所述脂肽还能有效抑制单增李斯特菌、青霉菌、大肠杆菌和沙门氏菌，效果显著。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 一株耐盐并高产脂肽的贝莱斯芽孢杆菌及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1455

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 1

cgtggcgggg tgcctaatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg 60

ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120

ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg 180

cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240

caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300

acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360

acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 420

agaacaagtg ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480

taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540

gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600

gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta 660

gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt 720

aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780

cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac 840

gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900

gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960

ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca 1020

ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080

cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga 1140

caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200

cacgtgctac aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca 1260

aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag 1320

taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380

acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccttttagga gccagccgcc 1440

gaagggggat cagag 1455

Claims (9)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述的贝莱斯芽孢杆菌已于2021年09月13日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.23402。

2.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌的16s rDNA序列为SEQ ID NO：1。

3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备食品发酵剂中的应用。

4.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备抗菌组合物中的应用。

5.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在脂肽生产中的应用。

6.一种脂肽，其特征在于，所述脂肽的生产方法包括如下步骤：

(1)将活化后的权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，33℃恒温培养24h，得发酵液；

(2)将贝莱斯芽孢杆菌发酵液在4℃、10000rpm条件下离心10min，保留上清液；

(3)用盐酸调节发酵上清液pH值至2.0，4℃冰箱中放置12h；

(4)将酸沉后的发酵液在4℃、10000rpm条件下离心10min，去除上清液，收集沉淀；

(5)将沉淀用甲醇反复萃取抽提3次，合并提取液，氢氧化钠调节溶液pH值至中性；

(6)选用0.22μm针式滤膜过滤器对甲醇提取液进行过滤，得到脂肽粗提液；

(3)将脂肽粗提液经减压式旋转蒸发仪在45-55℃条件下对甲醇溶液减压悬蒸，获得棕黄色固体物质，即为脂肽。

7.如权利要求6所述的脂肽，其特征在于，所述的脂肽中包含表面活性素、芬荠素和伊枯草菌。

8.一种抗菌组合物，其特征在于，所述的抗菌组合物包含权利要求6或3所述的脂肽。

9.权利要求8所述的抗菌组合物在制备食品或药品中的应用。

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