CN114306581B - 一种融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物制剂领域。本发明涉及融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒及其制备方法。本发明制备得到的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒可以增加尿酸酶的稳定性,提高尿酸酶抗蛋白酶水解的能力,提高生物利用度,增强炎症趋化能力,降低毒副作用。
Description
技术领域
本发明属于医药制剂领域,涉及融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒及其制备方法。
背景技术
高尿酸血症是由尿酸的产生速率和***速率之间的不平衡引起的。长期的高尿酸血症可导致痛风,同时持续性高尿酸血症与诱发心血管疾病、肾脏疾病、关节炎、胰岛素抵抗和糖尿病等密切相关。目前临床治疗高尿酸血症主要手段通过抑制黄嘌呤氧化酶阻止尿酸合成,促进尿酸***。而治疗高尿酸血症的化学药物有明显的肝肾毒性,会对机体产生严重的不良反应。尿酸酶是一种高效的氧化酶,可以将体内尿酸氧化为异丙烷素和过氧化氢,能够快速有效降低血清尿酸水平,专一性高。利用尿酸酶降低尿酸浓度所产生的过氧化氢,具有细胞毒性,促进细胞凋亡,而过氧化氢酶可促进过氧化氢分解为氧分子和水,清除体内蓄积的过氧化氢。过氧化氢酶分解产物氧气也是尿酸酶的底物,故尿酸酶和过氧化氢酶同时包裹于脂质纳米粒中,能更有效地提高尿酸酶的治疗效果,并降低其毒副作用。但尿酸酶和过氧化氢酶稳定性差、半衰期短和免疫原性强等缺点,极大限制了其临床应用。脂质纳米粒是将药物包封在类脂质双分子层内而形成的微型囊泡体,具有增强药物稳定性,延长药物体内滞留时间及提高生物利用度等优点。红细胞膜具有与脂质体相同的双亲性磷脂双分子层结构,可包载小分子及大分子药物(如酶、蛋白质、核酸等),能延长药物在体内的半衰期,增强药物在体内的稳定性,降低免疫***对药物的免疫活性,提高药物的生物相容性,减小不良反应等优点。巨噬细胞属于免疫细胞的重要组成部分,可载带小分子药物、酶、多肽等,使药物逃离体内免疫检测,避免网状内皮***的吞噬,延长血液循环时间,并对炎症部位具有趋化能力的特性。两种细胞膜的融合,使包裹的脂质纳米粒同时具备两种细胞膜生物特性,更好地增强药物的稳定性,最终大大提高药物的疗效并降低毒副作用。
经查询专利及文献,目前尚无红细胞/巨噬细胞融合细胞膜载带小分子药物纳米粒,尚无红细胞/巨噬细胞融合细胞膜载带酶类和基因类药物纳米粒,当然,目前也尚无红细胞/巨噬细胞融合细胞膜载带尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的任何报道,本发明制备得到的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒可以增加尿酸酶的稳定性,提高尿酸酶抗蛋白酶水解的能力,提高生物利用度,增强炎症趋化能力,可以用于高尿酸血症的治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒及其制备方法。融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒克服了尿酸酶稳定性差、易被酶降解、生物利用度低、低靶向性等缺点,可保持较长时间的血药浓度,具有缓释作用,可以减少给药次数,提高患者的顺应性,降低毒副作用。本发明提供的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒制备工艺简单,成本较低,易于控制,易于工业化生产。本研究为尿酸酶提供了可供选择的新型制剂,可用于高尿酸血症治疗。
本发明提供的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒,其特征在于,包括尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和红细胞及巨噬细胞融合细胞膜包裹层,包括硼酸-硼砂缓冲液、N,N-二羟乙基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液、三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的一种,制剂中尿酸酶含量为0.05-0.3mg/mL,过氧化氢酶含量为0.05-0.3mg/mL,缓冲液浓度为50-160mM、缓冲液pH为7-10.5,制剂中其余各组分重量比为:卵磷脂2-9.5份,胆固醇1-6.8份,缓冲液200-800份。本发明提供的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒,制备步骤如下:(1)尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的制备方法:将尿酸酶与过氧化氢酶以质量比(1:2至2:1,优选1:1)溶解于处方量的缓冲液中,形成尿酸酶/过氧化氢酶溶液,称取处方量的卵磷脂和胆固醇溶解于10-30mL二氯甲烷、三氯甲烷、无水乙醇、甲醇、***中的一种或多种有机溶剂中,旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜,加入尿酸酶/过氧化氢酶溶液,10-30℃水浴震荡1-3小时,过0.22-0.45μm微孔滤膜得到尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒;(2)红细胞膜的制备方法:取全血置含有肝素浸润的离心管,离心5-10分钟除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3-5次,加入pH 7.4磷酸盐缓冲盐溶液使红细胞膜充分溶血破裂,离心5-10分钟,除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3-10次,去离子水重悬红细胞膜,测定膜蛋白浓度;(3)巨噬细胞膜的制备方法:用乙二胺四乙酸消化巨噬细胞,收集巨噬细胞重悬于磷酸盐缓冲盐溶液(细胞密度为(1E+7)至(4E+7)个/mL),离心3-5分钟,除去上清液,再与磷酸盐缓冲液混匀,离心2-5分钟,去除上清液,再用含0.01-0.25M蔗糖的低渗溶液与下层沉淀混匀,离心10-30分钟,重复2-3次,超声10-30秒,离心10-30分钟,得到的沉淀即为巨噬细胞膜,去离子水重悬巨噬细胞膜,测定膜蛋白浓度;(4)融合细胞膜的制备方法:按红细胞膜与巨噬细胞膜蛋白浓度比为(1:2至2:1,优选1:1),将步骤(2)得到的一种红细胞膜加入到步骤(3)得到的巨噬细胞膜悬浮液中,在30-40℃下搅拌10-20分钟,混匀后备用;(5)将尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和融合细胞膜(浓度比为1:2至2:1,优选1:1)混合均匀,使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出,来回挤出次数10-30次,即得红细胞/巨噬细胞融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒。
本发明提供的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒平均粒径小于200nm(图1)。本发明提供的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒提高了尿酸酶对炎症的趋化能力。细胞膜对纳米粒进行伪装,能够使纳米粒具有生物膜的表面特征蛋白和特殊功能。本发明制备的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒与红细胞膜、红细胞/巨噬细胞膜融合膜的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果相比较,均有红细胞膜特征蛋白CD47(52KD);本发明制备的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒与巨噬细胞膜、红细胞/巨噬细胞膜融合膜的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果相比较,巨噬细胞膜上CD16(50-70KD)、CD44(86-160KD)蛋白在红细胞与巨噬细胞膜融合膜及融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的蛋白条带上均有显示(图2)。融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒提高酶对炎症的趋化能力的原因分析如下:(1)巨噬细胞具有天然的炎症趋化能力,可产生大量趋化因子,对单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等产生趋化作用;(2)本巨噬细胞膜包裹脂质纳米粒继承了生物膜的表面特异蛋白,使纳米粒子实现仿生化,提高了药物对炎症的趋化能力。
本发明提供的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒能增加尿酸酶的稳定性。4℃放置稳定性实验中,融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒中尿酸酶的活性始终高于游离的尿酸酶。第2天,游离尿酸酶的相对活性下降至90%,而融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒中尿酸酶的相对活性保持在98%左右,直至第7天,其仍保持约92%的活性。在第10天时,游离尿酸酶相对活性已经低于80%,而融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒相对催化活性约为90%。第28天时,游离尿酸酶的相对活性已降至60%以下,而融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒相对催化活性仍保留80%左右(图3)。融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒增加酶稳定性的原因可能有:(1)脂质纳米粒的类细胞膜双分子层结构对酶起保护作用,使酶更好地维持自身活性,稳定性得到提高;(2)红细胞膜具有与脂质体相同的双亲性磷脂双分子层结构,且属于人体内源性物质,将脂质纳米粒包载于红细胞形成一个相对隔离的空间,从而保护药物不受体内内源性物质的干扰,提高药物在体内的稳定性;(3)巨噬细胞属于免疫细胞的一种,胞内脂质纳米粒药物借助细胞的保护减弱其免疫原性,延长药物在体内的循环时间。本发明提供的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒在抗胰蛋白酶水解实验中,游离的尿酸酶在120分钟时,活性消失,而融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒还保留约27.44±0.81%活性(图4)。可能是因为脂质纳米粒及细胞融合膜的双重保护,使尿酸酶免受蛋白酶的破坏。
本发明提供的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒体内给药后,活性-时间曲线图下面积相对于游离尿酸酶有明显提高(图5),为游离酶的3.30倍,活性最大值为游离酶的1.11倍,体内平均滞留时间为游离药的1.24倍。结果表明,将尿酸酶/过氧化氢酶制备成融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒后,能显著提高尿酸酶的生物利用度,同等剂量下能使药物在更长时间内保持较高活性,延长药物在体内的作用时间。本发明的制剂生物利用度明显提高的原因可能包括:(1)融合细胞膜和脂质纳米粒的双重保护作用,使其免受蛋白酶水解和吞噬细胞清除;(2)融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒能增强酶的稳定性,使其在长时间内保持较高活性;(3)融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒能改善酶的体内行为,提高生物利用度。
本发明的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒递送***,具有稳定性好、降低酶的免疫原性和生物相容性好的特点,为高尿酸血症治疗中的大分子治疗药物递送提供了一种有效的手段。所述融合膜修饰的尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒,采用红细胞膜和巨噬细胞膜,红细胞膜能延长药物在体内的半衰期,增强药物在体内的稳定性,降低免疫***对药物的免疫活性,提高药物的生物相容性。巨噬细胞同样具有以上特性,在这四个方面具有协同增效的作用。除此以外,巨噬细胞对炎症部位还具有趋化能力,能使尿酸酶/过氧化氢酶纳米粒对高尿酸血症所导致的痛风性关节炎等疾病治疗效果增强。融合后的红细胞膜与巨噬细胞膜双膜纳米平台体系,相比于单纯脂质纳米粒以及各单一膜体系更好,不仅有效结合两种细胞膜的特性,还单独发挥各单一膜的优点。
本发明不同于通常研究报道的尿酸酶/过氧化氢酶的递送载体和制备工艺。尿酸酶/过氧化氢酶的递送载体研究报道的有:常规脂质体及自组装纳米囊等。本发明中的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒是一种新型纳米粒。目前有少量细胞融合膜载带小分子药物的报道,如:白细胞/血小板融合膜载带盐酸阿霉素(主要用于抗肿瘤)树枝状介孔硅纳米粒、肿瘤干细胞及血小板膜双膜融合载带四氧化三铁磁性纳米粒(主要用于头颈鳞癌光热治疗)等。目前有其他类型细胞膜融合载带小分子药物的报道,尚未见红细胞/巨噬细胞融合细胞膜载带小分子药物或大分子蛋白质药物的研究,当然,也尚未见红细胞/巨噬细胞融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒。本发明首次将红细胞/巨噬细胞融合膜包裹大分子尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒。该脂质纳米粒能增加可以增加尿酸酶的稳定性,提高尿酸酶抗蛋白酶水解的能力,提高生物利用度,增强炎症趋化能力。
附图说明
图1为本发明制得的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的粒径。
试验条件:采用马尔文激光粒度仪测定融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的粒径。
结果显示:融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒粒径为(154.43±0.67)nm,PDI为0.13±0.01。
图2为本发明制得的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒、红细胞、巨噬细胞和红细胞/巨噬细胞融合膜的表面膜蛋白表征。
试验条件:将制备所得融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒样品溶液、红细胞膜、巨噬细胞膜、红细胞/巨噬细胞融合膜溶液分别和蛋白上样缓冲液混合,100℃高温下加热10分钟使蛋白变性,12000转速下离心10min,随后吸取上清液,作为电泳上样液品。配制12%分离胶、5%浓缩胶。蛋白上样,电泳至胶底部,取下胶板,用0.25%考马斯亮蓝染色40分钟,而后分别用纯水、脱色液反复洗涤、脱色,直至凝胶背景清晰,在凝胶成像***下拍照。
结果显示:融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和红细胞膜、红细胞/巨噬细胞膜融合膜的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果相比较,均有红细胞膜特征蛋白CD47(52KD),说明红细胞膜提取后其蛋白结构并没有被破坏,进而表明膜上生理功能也没有被破坏;本发明制备的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒与巨噬细胞膜、红细胞/巨噬细胞膜融合膜的SDS-PAGE结果相比较,巨噬细胞膜上CD16(50-70KD)、CD44(86-160KD)蛋白在红细胞/巨噬细胞膜融合膜及融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的蛋白条带上均有显示,说明提取后巨噬细胞的膜蛋白结构依然完整,不影响其生理功能。
图3为本发明制得的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的4℃放置稳定性。
试验条件:将游离尿酸酶、融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒样品溶液放置于4℃的冰箱中,分别于第0、1、2、4、7、10、14、20、28天时测定样品溶液中尿酸酶的活性。尿酸酶的初始酶活性被定为100%,计算各时间点酶的相对活性。
结果显示:随着贮存时间的延长,融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒中尿酸酶的活性始终高于游离的尿酸酶,在贮存时间达到28天时,尿酸酶和融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒中尿酸酶在贮存前后过程中活性分别下降41.02%和20.57%,融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒酶活性较游离尿酸酶活性下降幅度更低。
图4为本发明制得的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的抗胰蛋白酶水解的能力。
试验条件:取游离尿酸酶、融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒与等体积的胰蛋白酶溶液混匀,于37℃水浴中保存,分别于0、15、30、45、60、90、120、180分钟测定混合溶液中尿酸酶的活性。尿酸酶的初始酶活性被定为100%,计算各时间点游离酶的相对活性。
结果显示:在胰蛋白处理120分钟后,游离的尿酸酶活性消失,而融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒还保留27.44±0.81%活性,说明融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒显著提高了尿酸酶抗胰蛋白酶水解的能力。
图5为本发明制得融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒活性-时间曲线图。
试验条件:12只SD大鼠(在给药前禁食12小时,但不禁水),随机分为2组,每组6只,分别尾静脉注射尿酸酶、本发明提供的融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒,给药剂量相同(以尿酸酶计)。给药后定时采血,进行药代动力学研究。
结果显示:给药后融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的尿酸酶活性始终高于游离尿酸酶,活性最大值是游离酶的1.11倍,同时在大鼠体内的滞留时间也明显高于尿酸酶,为游离药的1.24倍。活性-时间曲线图下面积相对于游离酶有明显提高,是游离酶的3.30倍,说明融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒明显提高了尿酸酶的生物利用度。
具体实施方式
为了进一步说明本发明及其优点,给出了下列特定的实施例,应理解这些实施例仅有于具体说明而不是作为本发明范围的限制。
实施例1:
融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒包括尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和红细胞/巨噬细胞融合细胞膜包裹层。尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒配方中各组分的重量比为:卵磷脂2份,胆固醇1份,硼酸-硼砂缓冲液200份,缓冲液浓度为50mM,缓冲液pH为7,尿酸酶含量为0.1mg/mL,过氧化氢酶含量为0.05mg/mL。
制备方法:(1)尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的制备方法:将尿酸酶与过氧化氢酶以质量比(2:1)溶解于处方量的缓冲液中,形成尿酸酶/过氧化氢酶溶液,称取处方量的卵磷脂和胆固醇溶解于10mL二氯甲烷有机溶剂中,旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜,加入尿酸酶/过氧化氢酶溶液,20℃水浴震荡1小时,过0.22μm微孔滤膜得到尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒;(2)红细胞膜的制备方法:取全血置含有肝素浸润的离心管,离心5分钟除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3次,加入pH 7.4磷酸盐缓冲盐溶液使红细胞膜充分溶血破裂,离心5分钟,除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3次,去离子水重悬红细胞膜,测定膜蛋白浓度;(3)巨噬细胞膜的制备方法:用乙二胺四乙酸消化J774A.1巨噬细胞,收集巨噬细胞重悬于磷酸盐缓冲盐溶液(细胞密度为1E+7个/mL),离心3分钟,除去上清液,再与磷酸盐缓冲液混匀,离心2分钟,去除上清液,再用含0.01M蔗糖的低渗溶液与下层沉淀混匀,离心10分钟,重复2次,超声10秒,离心10分钟,得到的沉淀即为巨噬细胞膜,去离子水重悬巨噬细胞膜,测定膜蛋白浓度;(4)融合细胞膜的制备方法:按红细胞膜与巨噬细胞膜蛋白质量比为(1:2),将步骤(2)得到的一种红细胞膜加入到步骤(3)得到的巨噬细胞膜悬浮液中,在30℃下搅拌10分钟,混匀后备用;(5)将尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和融合细胞膜(浓度比为1:2)混合均匀,使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出,来回挤出次数10次,即得融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒。
实施例2:
融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒包括尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和红细胞/巨噬细胞融合细胞膜包裹层。尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒配方中各组分的重量比为:卵磷脂2.7份,胆固醇2.1份,N,N-二羟乙基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液418.2份,缓冲液浓度为120mM,缓冲液pH为7.3,尿酸酶含量为0.07mg/mL,过氧化氢酶含量为0.14mg/mL。
制备方法:(1)尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的制备方法:将尿酸酶与过氧化氢酶以质量比(1:2)溶解于处方量的缓冲液中,形成尿酸酶/过氧化氢酶溶液,称取处方量的卵磷脂和胆固醇溶解于15mL三氯甲烷有机溶剂中,旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜,加入尿酸酶/过氧化氢酶溶液,20℃水浴震荡1.5小时,过0.45μm微孔滤膜得到尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒;(2)红细胞膜的制备方法:取全血置含有肝素浸润的离心管,离心7分钟除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3次,加入pH 7.4磷酸盐缓冲盐溶液使红细胞膜充分溶血破裂,离心8分钟,除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤4次,去离子水重悬红细胞膜,测定膜蛋白浓度;(3)巨噬细胞膜的制备方法:用乙二胺四乙酸消化P338D1巨噬细胞,收集巨噬细胞重悬于磷酸盐缓冲盐溶液(细胞密度为1.5E+7个/mL),离心4分钟,除去上清液,再与磷酸盐缓冲液混匀,离心3分钟,去除上清液,再用含0.03M蔗糖的低渗溶液与下层沉淀混匀,离心15分钟,重复2次,超声10秒,离心15分钟,得到的沉淀即为巨噬细胞膜,去离子水重悬巨噬细胞膜,测定膜蛋白浓度;(4)融合细胞膜的制备方法:按红细胞膜与巨噬细胞膜蛋白质量比为(2:1),将步骤(2)得到的一种红细胞膜加入到步骤(3)得到的巨噬细胞膜悬浮液中,在30℃下搅拌15分钟,混匀后备用;(5)将尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和融合细胞膜(浓度比为1:1.5)混合均匀,使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出,来回挤出次数15次,即得融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒。
实施例3:
融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒包括尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和红细胞/巨噬细胞融合细胞膜包裹层。尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒配方中各组分的重量比为:卵磷脂3.4份,胆固醇2.6份,碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液527.3份,缓冲液浓度为130mM,缓冲液pH为7.6,尿酸酶含量为0.1mg/mL,过氧化氢酶含量为0.15mg/mL。
制备方法:(1)尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的制备方法:将尿酸酶与过氧化氢酶以质量比(1:1.5)溶解于处方量的缓冲液中,形成尿酸酶/过氧化氢酶溶液,称取处方量的卵磷脂和胆固醇溶解于20mL无水乙醇有机溶剂中,旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜,加入尿酸酶/过氧化氢酶溶液,20℃水浴震荡2小时,过0.22μm微孔滤膜得到尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒;(2)红细胞膜的制备方法:取全血置含有肝素浸润的离心管,离心10分钟除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤4次,加入pH 7.4磷酸盐缓冲盐溶液使红细胞膜充分溶血破裂,离心10分钟,除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤4次,去离子水重悬红细胞膜,测定膜蛋白浓度;(3)巨噬细胞膜的制备方法:用乙二胺四乙酸消化RAW264.7巨噬细胞,收集巨噬细胞重悬于磷酸盐缓冲盐溶液(细胞密度为3E+7个/mL),离心5分钟,除去上清液,再与磷酸盐缓冲液混匀,离心4分钟,去除上清液,再用含0.05M蔗糖的低渗溶液与下层沉淀混匀,离心20分钟,重复3次,超声20秒,离心15分钟,得到的沉淀即为巨噬细胞膜,去离子水重悬巨噬细胞膜,测定膜蛋白浓度;(4)融合细胞膜的制备方法:按红细胞膜与巨噬细胞膜蛋白质量比为(1:1.3),将步骤(2)得到的一种红细胞膜加入到步骤(3)得到的巨噬细胞膜悬浮液中,在40℃下搅拌15分钟,混匀后备用;(5)将尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和融合细胞膜(浓度比为1.4:1)混合均匀,使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出,来回挤出次数20次,即得融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒。
实施例4:
融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒包括尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和红细胞/巨噬细胞融合细胞膜包裹层。尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒配方中各组分的重量比为:卵磷脂4份,胆固醇3.1份,三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液581.8份,缓冲液浓度为140mM,缓冲液pH为8,尿酸酶含量为0.12mg/mL,过氧化氢酶含量为0.12mg/mL。
制备方法:(1)尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的制备方法:将尿酸酶与过氧化氢酶以质量比(1:1)溶解于处方量的缓冲液中,形成尿酸酶/过氧化氢酶溶液,称取处方量的卵磷脂和胆固醇溶解于25mL甲醇有机溶剂中,旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜,加入尿酸酶/过氧化氢酶溶液,25℃水浴震荡2.5小时,过0.22μm微孔滤膜得到尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒;(2)红细胞膜的制备方法:取全血置含有肝素浸润的离心管,离心8分钟除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤4次,加入pH 7.4磷酸盐缓冲盐溶液使红细胞膜充分溶血破裂,离心7分钟,除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤6次,去离子水重悬红细胞膜,测定膜蛋白浓度;(3)巨噬细胞膜的制备方法:用乙二胺四乙酸消化S774A.1巨噬细胞,收集巨噬细胞重悬于磷酸盐缓冲盐溶液(细胞密度为4E+7个/mL),离心4分钟,除去上清液,再与磷酸盐缓冲液混匀,离心4分钟,去除上清液,再用含0.07M蔗糖的低渗溶液与下层沉淀混匀,离心20分钟,重复3次,超声15秒,离心20分钟,得到的沉淀即为巨噬细胞膜,去离子水重悬巨噬细胞膜,测定膜蛋白浓度;(4)融合细胞膜的制备方法:按红细胞膜与巨噬细胞膜蛋白质量比为(1.6:1),将步骤(2)得到的一种红细胞膜加入到步骤(3)得到的巨噬细胞膜悬浮液中,在37℃下搅拌18分钟,混匀后备用;(5)将尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和融合细胞膜(浓度比为1.8:1)混合均匀,使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出,来回挤出次数18次,即得融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒。
实施例5:
融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒包括尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和红细胞/巨噬细胞融合细胞膜包裹层。尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒配方中各组分的重量比为:卵磷脂4.7份,胆固醇4.2份,三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液636.4份,缓冲液浓度为150mM,缓冲液pH为8.3,尿酸酶含量为0.23mg/mL,过氧化氢酶含量为0.14mg/mL。
制备方法:(1)尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的制备方法:将尿酸酶与过氧化氢酶以质量比(1.6:1)溶解于处方量的缓冲液中,形成尿酸酶/过氧化氢酶溶液,称取处方量的卵磷脂和胆固醇溶解于25m***中有机溶剂中,旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜,加入尿酸酶/过氧化氢酶溶液,30℃水浴震荡2.5小时,过0.22μm微孔滤膜得到尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒;(2)红细胞膜的制备方法:取全血置含有肝素浸润的离心管,离心9分钟除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤4次,加入pH 7.4磷酸盐缓冲盐溶液使红细胞膜充分溶血破裂,离心10分钟,除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤10次,去离子水重悬红细胞膜,测定膜蛋白浓度;(3)巨噬细胞膜的制备方法:用乙二胺四乙酸消化P338D1巨噬细胞,收集巨噬细胞重悬于磷酸盐缓冲盐溶液(细胞密度为2.5E+7个/mL),离心3分钟,除去上清液,再与磷酸盐缓冲液混匀,离心4分钟,去除上清液,再用含0.09M蔗糖的低渗溶液与下层沉淀混匀,离心20分钟,重复3次,超声25秒,离心15分钟,得到的沉淀即为巨噬细胞膜,去离子水重悬巨噬细胞膜,测定膜蛋白浓度;(4)融合细胞膜的制备方法:按红细胞膜与巨噬细胞膜蛋白质量比为(1:1.7),将步骤(2)得到的一种红细胞膜加入到步骤(3)得到的巨噬细胞膜悬浮液中,在35℃下搅拌10分钟,混匀后备用;(5)将尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和融合细胞膜(浓度比为1:1.1)混合均匀,使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出,来回挤出次数17次,即得融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒。
实施例6:
融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒包括尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和红细胞/巨噬细胞融合细胞膜包裹层。尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒配方中各组分的重量比为:卵磷脂5.8份,胆固醇3.9份,碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液500份,缓冲液浓度为100mM,缓冲液pH为9,尿酸酶含量为0.16mg/mL,过氧化氢酶含量为0.16mg/mL。
制备方法(1)尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的制备方法:将尿酸酶与过氧化氢酶以质量比(1:1)溶解于处方量的缓冲液中,形成尿酸酶/过氧化氢酶溶液,称取处方量的卵磷脂和胆固醇溶解于15mL二氯甲烷有机溶剂中,旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜,加入尿酸酶/过氧化氢酶溶液,30℃水浴震荡1.5小时,过0.22μm微孔滤膜得到尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒;(2)红细胞膜的制备方法:取全血置含有肝素浸润的离心管,离心5分钟除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3次,加入pH 7.4磷酸盐缓冲盐溶液使红细胞膜充分溶血破裂,离心5分钟,除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3次,去离子水重悬红细胞膜,测定膜蛋白浓度;(3)巨噬细胞膜的制备方法:用乙二胺四乙酸消化培养皿中的RAW264.7巨噬细胞,收集巨噬细胞重悬于磷酸盐缓冲盐溶液(细胞密度为2.5E+7个/mL),离心3分钟,除去上清液,再与磷酸盐缓冲液混匀,离心2分钟,去除上清液,再用含0.11M蔗糖的低渗溶液与下层沉淀混匀,离心15分钟,重复2次,超声10秒,离心15分钟,得到的沉淀即为巨噬细胞膜,去离子水重悬巨噬细胞膜,测定膜蛋白浓度;(4)融合细胞膜的制备方法:按红细胞膜与巨噬细胞膜蛋白质量比为(1:1),将步骤(2)得到的一种红细胞膜加入到步骤(3)得到的巨噬细胞膜悬浮液中,在37℃下搅拌10分钟,混匀后备用;(5)将尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和融合细胞膜(浓度比为1:1)混合均匀,使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出,来回挤出次数10次,即得融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒。
实施例7:
融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒包括尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和红细胞/巨噬细胞融合细胞膜包裹层。尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒配方中各组分的重量比为:卵磷脂6.1份,胆固醇4.7份,硼酸-硼砂缓冲液690.9份,缓冲液浓度为90mM,缓冲液pH为8.6,尿酸酶含量为0.11mg/mL,过氧化氢酶含量为0.19mg/mL。
制备方法:(1)尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的制备方法:将尿酸酶与过氧化氢酶以质量比(1:1.7)溶解于处方量的缓冲液中,形成尿酸酶/过氧化氢酶溶液,称取处方量的卵磷脂和胆固醇溶解于20mL三氯甲烷、***有机溶剂中,旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜,加入尿酸酶/过氧化氢酶溶液,20℃水浴震荡1-3小时,过0.45μm微孔滤膜得到尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒;(2)红细胞膜的制备方法:取全血置含有肝素浸润的离心管,离心5分钟除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3次,加入pH 7.4磷酸盐缓冲盐溶液使红细胞膜充分溶血破裂,离心9分钟,除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤6次,去离子水重悬红细胞膜,测定膜蛋白浓度;(3)巨噬细胞膜的制备方法:用乙二胺四乙酸消化S774A.1巨噬细胞,收集巨噬细胞重悬于磷酸盐缓冲盐溶液(细胞密度为3.5E+7个/mL),离心3分钟,除去上清液,再与磷酸盐缓冲液混匀,离心5分钟,去除上清液,再用含0.13M蔗糖的低渗溶液与下层沉淀混匀,离心30分钟,重复3次,超声10秒,离心20分钟,得到的沉淀即为巨噬细胞膜,去离子水重悬巨噬细胞膜,测定膜蛋白浓度;(4)融合细胞膜的制备方法:按红细胞膜与巨噬细胞膜蛋白质量比为(1.8:1),将步骤(2)得到的一种红细胞膜加入到步骤(3)得到的巨噬细胞膜悬浮液中,在30℃下搅拌18分钟,混匀后备用;(5)将尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和融合细胞膜(浓度比为2:1)混合均匀,使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出,来回挤出次数22次,即得融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒。
实施例8:
融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒包括尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和红细胞/巨噬细胞融合细胞膜包裹层。尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒配方中各组分的重量比为:卵磷脂6.8份,胆固醇5.2份,N,N-二羟乙基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液745.5份,缓冲液浓度为80mM,缓冲液pH为9.2,尿酸酶含量为0.21mg/mL,过氧化氢酶含量为0.12mg/mL。
制备方法:(1)尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的制备方法:将尿酸酶与过氧化氢酶以质量比(1.8:1)溶解于处方量的缓冲液中,形成尿酸酶/过氧化氢酶溶液,称取处方量的卵磷脂和胆固醇溶解于25mL甲醇有机溶剂中,旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜,加入尿酸酶/过氧化氢酶溶液,10℃水浴震荡3小时,过0.22μm微孔滤膜得到尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒;(2)红细胞膜的制备方法:取全血置含有肝素浸润的离心管,离心5分钟除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3次,加入pH 7.4磷酸盐缓冲盐溶液使红细胞膜充分溶血破裂,离心7分钟,除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤5次,去离子水重悬红细胞膜,测定膜蛋白浓度;(3)巨噬细胞膜的制备方法:用乙二胺四乙酸消化J774A.1巨噬细胞,收集巨噬细胞重悬于磷酸盐缓冲盐溶液(细胞密度为2.8E+7个/mL),离心4分钟,除去上清液,再与磷酸盐缓冲液混匀,离心5分钟,去除上清液,再用含0.15M蔗糖的低渗溶液与下层沉淀混匀,离心25分钟,重复2次,超声25秒,离心20分钟,得到的沉淀即为巨噬细胞膜,去离子水重悬巨噬细胞膜,测定膜蛋白浓度;(4)融合细胞膜的制备方法:按红细胞膜与巨噬细胞膜蛋白质量比为(1:1.4),将步骤(2)得到的一种红细胞膜加入到步骤(3)得到的巨噬细胞膜悬浮液中,在30℃下搅拌13分钟,混匀后备用;(5)将尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和融合细胞膜(浓度比为1:1.9)混合均匀,使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出,来回挤出次数23次,即得融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒。
实施例9:
融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒包括尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和红细胞/巨噬细胞融合细胞膜包裹层。尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒配方中各组分的重量比为:卵磷脂7.5份,胆固醇5.7份,三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液363.6份,缓冲液浓度为70mM,缓冲液pH为9.5,尿酸酶含量为0.23mg/mL,过氧化氢酶含量为0.23mg/mL。
制备方法:(1)尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的制备方法:将尿酸酶与过氧化氢酶以质量比(1:1)溶解于处方量的缓冲液中,形成尿酸酶/过氧化氢酶溶液,称取处方量的卵磷脂和胆固醇溶解于10mL甲醇、***有机溶剂中,旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜,加入尿酸酶/过氧化氢酶溶液,30℃水浴震荡1.33小时,过0.45μm微孔滤膜得到尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒;(2)红细胞膜的制备方法:取全血置含有肝素浸润的离心管,离心5分钟除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤5次,加入pH 7.4磷酸盐缓冲盐溶液使红细胞膜充分溶血破裂,离心8分钟,除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤8次,去离子水重悬红细胞膜,测定膜蛋白浓度;(3)巨噬细胞膜的制备方法:用乙二胺四乙酸消化S774A.1巨噬细胞,收集巨噬细胞重悬于磷酸盐缓冲盐溶液(细胞密度为1.8E+7个/mL),离心4分钟,除去上清液,再与磷酸盐缓冲液混匀,离心4分钟,去除上清液,再用含0.17M蔗糖的低渗溶液与下层沉淀混匀,离心22分钟,重复2次,超声25秒,离心10分钟,得到的沉淀即为巨噬细胞膜,去离子水重悬巨噬细胞膜,测定膜蛋白浓度;(4)融合细胞膜的制备方法:按红细胞膜与巨噬细胞膜蛋白质量比为(1.5:1),将步骤(2)得到的一种红细胞膜加入到步骤(3)得到的巨噬细胞膜悬浮液中,在40℃下搅拌20分钟,混匀后备用;(5)将尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和融合细胞膜(浓度比为1.6:1)混合均匀,使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出,来回挤出次数16次,即得融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒。
实施例10:
融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒包括尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和红细胞/巨噬细胞融合细胞膜包裹层。尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒配方中各组分的重量比为:卵磷脂8.1份,胆固醇6.3份,三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液309.1份,缓冲液浓度为60mM,缓冲液pH为9.9,尿酸酶含量为0.19mg/mL,过氧化氢酶含量为0.25mg/mL。
制备方法:制备方法:(1)尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的制备方法:将尿酸酶与过氧化氢酶以质量比(1:1.3)溶解于处方量的缓冲液中,形成尿酸酶/过氧化氢酶溶液,称取处方量的卵磷脂和胆固醇溶解于30mL无水乙醇有机溶剂中,旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜,加入尿酸酶/过氧化氢酶溶液,25℃水浴震荡2小时,过0.45μm微孔滤膜得到尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒;(2)红细胞膜的制备方法:取全血置含有肝素浸润的离心管,离心6分钟除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤4次,加入pH 7.4磷酸盐缓冲盐溶液使红细胞膜充分溶血破裂,离心8分钟,除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3次,去离子水重悬红细胞膜,测定膜蛋白浓度;(3)巨噬细胞膜的制备方法:用乙二胺四乙酸消化P338D1巨噬细胞,收集巨噬细胞重悬于磷酸盐缓冲盐溶液(细胞密度为2.4E+7个/mL),离心5分钟,除去上清液,再与磷酸盐缓冲液混匀,离心4分钟,去除上清液,再用含0.19M蔗糖的低渗溶液与下层沉淀混匀,离心25分钟,重复2次,超声20秒,离心10分钟,得到的沉淀即为巨噬细胞膜,去离子水重悬巨噬细胞膜,测定膜蛋白浓度;(4)融合细胞膜的制备方法:按红细胞膜与巨噬细胞膜蛋白质量比为(1.8:1),将步骤(2)得到的一种红细胞膜加入到步骤(3)得到的巨噬细胞膜悬浮液中,在40℃下搅拌20分钟,混匀后备用;(5)将尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和融合细胞膜(浓度比为1.2:1)混合均匀,使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出,来回挤出次数22次,即得融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒。
实施例11:
融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒包括尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和红细胞/巨噬细胞融合细胞膜包裹层。尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒配方中各组分的重量比为:卵磷脂8.8份,胆固醇1.5份,碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液254.5份,缓冲液浓度为110mM,缓冲液pH为10.2,尿酸酶含量为0.28mg/mL,过氧化氢酶含量为0.34mg/mL。
制备方法:(1)尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的制备方法:将尿酸酶与过氧化氢酶以质量比(1:1.2)溶解于处方量的缓冲液中,形成尿酸酶/过氧化氢酶溶液,称取处方量的卵磷脂和胆固醇溶解于20mL二氯甲烷、***有机溶剂中,旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜,加入尿酸酶/过氧化氢酶溶液,15℃水浴震荡2小时,过0.22μm微孔滤膜得到尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒;(2)红细胞膜的制备方法:取全血置含有肝素浸润的离心管,离心10分钟除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3次,加入pH 7.4磷酸盐缓冲盐溶液使红细胞膜充分溶血破裂,离心6分钟,除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤8次,去离子水重悬红细胞膜,测定膜蛋白浓度;(3)巨噬细胞膜的制备方法:用乙二胺四乙酸消化RAW264.7巨噬细胞,收集巨噬细胞重悬于磷酸盐缓冲盐溶液(细胞密度为3.6E+7个/mL),离心3分钟,除去上清液,再与磷酸盐缓冲液混匀,离心3分钟,去除上清液,再用含0.21M蔗糖的低渗溶液与下层沉淀混匀,离心12分钟,重复2次,超声12秒,离心20分钟,得到的沉淀即为巨噬细胞膜,去离子水重悬巨噬细胞膜,测定膜蛋白浓度;(4)融合细胞膜的制备方法:按红细胞膜与巨噬细胞膜蛋白质量比为(1.3:1),将步骤(2)得到的一种红细胞膜加入到步骤(3)得到的巨噬细胞膜悬浮液中,在35℃下搅拌20分钟,混匀后备用;(5)将尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和融合细胞膜(浓度比为1:1.5)混合均匀,使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出,来回挤出次数17次,即得融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒。
实施例12:
融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒包括尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和红细胞/巨噬细胞融合细胞膜包裹层。尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒配方中各组分的重量比为:卵磷脂9.5份,胆固醇6.8份,三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液800份,缓冲液浓度为160mM,缓冲液pH为10.5,尿酸酶含量为0.3mg/mL,过氧化氢酶含量为0.15mg/mL。
制备方法:(1)尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的制备方法:将尿酸酶与过氧化氢酶以质量比(2:1)溶解于处方量的缓冲液中,形成尿酸酶/过氧化氢酶溶液,称取处方量的卵磷脂和胆固醇溶解于28mL三氯甲烷有机溶剂中,旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜,加入尿酸酶/过氧化氢酶溶液,25℃水浴震荡1.3小时,过0.22μm微孔滤膜得到尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒;(2)红细胞膜的制备方法:取全血置含有肝素浸润的离心管,离心9分钟除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤4次,加入pH 7.4磷酸盐缓冲盐溶液使红细胞膜充分溶血破裂,离心6分钟,除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3次,去离子水重悬红细胞膜,测定膜蛋白浓度;(3)巨噬细胞膜的制备方法:用乙二胺四乙酸消化J774A.1巨噬细胞,收集巨噬细胞重悬于磷酸盐缓冲盐溶液(细胞密度为4E+7个/mL),离心3分钟,除去上清液,再与磷酸盐缓冲液混匀,离心5分钟,去除上清液,再用含0.25M蔗糖的低渗溶液与下层沉淀混匀,离心30分钟,重复3次,超声30秒,离心30分钟,得到的沉淀即为巨噬细胞膜,去离子水重悬巨噬细胞膜,测定膜蛋白浓度;(4)融合细胞膜的制备方法:按红细胞膜与巨噬细胞膜蛋白质量比为(1:1.9),将步骤(2)得到的一种红细胞膜加入到步骤(3)得到的巨噬细胞膜悬浮液中,在40℃下搅拌15分钟,混匀后备用;(5)将尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和融合细胞膜(浓度比为1:1.4)混合均匀,使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出,来回挤出次数20次,即得融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒。
Claims (1)
1.一种融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒,其特征在于,包括尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和红细胞/巨噬细胞融合细胞膜包裹层;
所述的尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒中尿酸酶含量为0.05-0.3mg/mL,过氧化氢酶含量为0.05-0.3mg/mL,缓冲液浓度为50-160mM、缓冲液pH为7-10.5,其余各组分重量比为:
卵磷脂2-9.5份,
胆固醇1-6.8份,
缓冲液200-800份;
所述的缓冲液,包括硼酸-硼砂缓冲液、N,N-二羟乙基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液、三(羟甲基)甲基甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的一种;
所述的一种融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的制备包括下列步骤:(1)尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒的制备方法:将尿酸酶与过氧化氢酶以质量比1:2至2:1,溶解于处方量的缓冲液中,形成尿酸酶/过氧化氢酶溶液,称取处方量的卵磷脂和胆固醇溶解于10-30mL二氯甲烷、三氯甲烷、无水乙醇、甲醇、***中的一种或多种有机溶剂中,旋转蒸发除去有机溶剂形成均匀脂质薄膜,加入尿酸酶/过氧化氢酶溶液,10-30℃水浴震荡1-3小时,过0.22-0.45μm微孔滤膜得到尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒;(2)红细胞膜的制备方法:取全血置含有肝素浸润的离心管,离心5-10分钟除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3-5次,加入pH 7.4磷酸盐缓冲盐溶液使红细胞膜充分溶血破裂,离心5-10分钟,除去上清液,下层沉淀用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3-10次,去离子水重悬红细胞膜,测定膜蛋白浓度;(3)巨噬细胞膜的制备方法:用乙二胺四乙酸消化巨噬细胞,收集巨噬细胞重悬于磷酸盐缓冲盐溶液,离心3-5分钟,除去上清液,再与磷酸盐缓冲液混匀,离心2-5分钟,去除上清液,再用含0.01-0.25M蔗糖的低渗溶液与下层沉淀混匀,离心10-30分钟,重复2-3次,超声10-30秒,离心10-30分钟,得到的沉淀即为巨噬细胞膜,去离子水重悬巨噬细胞膜,测定膜蛋白浓度;(4)融合细胞膜的制备方法:按红细胞膜与巨噬细胞膜蛋白浓度比为1:2至2:1,将步骤(2)得到的一种红细胞膜加入到步骤(3)得到的巨噬细胞膜悬浮液中,在30-40℃下搅拌10-20分钟,混匀后备用;(5)将尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒和融合细胞膜以浓度比为1:2至2:1,混合均匀,使用脂质体挤出器分别通过400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出,来回挤出次数10-30次,即得红细胞/巨噬细胞融合细胞膜包裹尿酸酶/过氧化氢酶脂质纳米粒。
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