CN114276938B

CN114276938B - 拟青霉属ejks菌株、镰刀菌属e-9菌株及其应用

Info

Publication number: CN114276938B
Application number: CN202210022353.6A
Authority: CN
Inventors: 宋利沙; 张占江; 蒋妮; 万凌云; 韦树根; 潘丽梅; 白隆华
Original assignee: Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants
Current assignee: Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants
Priority date: 2022-01-10
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2023-09-05
Anticipated expiration: 2042-01-10
Also published as: CN114276938A

Abstract

本发明公开了拟青霉属EJKS菌株，被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：61996，保藏时间为：2021年10月18日，保藏单位地址为：广东省科学微生物研究所。本发明还公开了镰刀菌属E‑9菌株，保藏号为：GDMCC No：62167，保藏时间为：2021年12月28日。本发明还公开了拟青霉属EJKS菌株和/或镰刀菌属E‑9菌株于植株拮抗叶斑病或科学研究中的应用。本发明为解决广西莪术大面积栽培中的病害问题奠定了研究基础，保护了野生资源，保证了广西莪术的可持续利用，对恢复和发展广西莪术产业具有重要意义。

Description

拟青霉属EJKS菌株、镰刀菌属E-9菌株及其应用

技术领域

本发明属于植物抗病技术领域，涉及拟青霉属EJKS菌株、镰刀菌属E-9菌株及其应用。

背景技术

广西莪术(Curcuma kwangsiensis)是姜科(Zingberaceae)姜黄属(Curauma L)植物，药用历史悠久，中国药典中记载其具有行气破血，消积止痛功效，与姜黄、莪术、温郁金、川郁金并称为我国五大最有价值的姜黄属药用植物。随着莪术的药用价值被的开发利用得越来越多，广西莪术已成为一种发展潜力巨大、市场前景广阔的药材，广西各地均开始种植莪术。但近年来，由于种植产地面积扩大、常年连种，周边环境的变化以及栽培管理不规范等因素，广西莪术病害越来越严重，目前关于引起广西莪术叶斑病的病原菌只有蒋妮等^[3]报道的由大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsis longicolla)侵染引起广西隆安县的莪术叶斑病，该病害多在叶尖部或叶缘部出现黄褐色斑点。目前，对广西莪术的病害防治仍以化学防治为主，不仅污染环境，而且化学农药还会对土壤中有益的微生物造成损害，而且还会破坏土壤中原有的生物链，进而导致生态***不平衡。化学农药在对抗中药材病害防治，保障农业生产方面贡献巨大，但是不科学的使用方式，会严重破坏生态环境，对人类的健康造成威胁。植物内生真菌(endophytic fungi)是指在健康植物组织内的某一周期或者全部周期中，对植物组织不会造成明显的病害症状的一类真菌，它是植物微生物群落的重要组成部分。内生真菌具有丰富的生物多样性，可以无症状地在植物的茎、叶和根等不同健康组织中生长，在温带和热带雨林中自然存在，分布着约30万种陆地寄主植物。内生真菌产生的生物活性化合物(不含寄主植物的活性化合物)对于提高内生真菌和寄主植物的适应性，如对生物和非生物胁迫的耐受性等具有重要意义。此外，这些化合物可以诱导产生大量已知和新颖的生物活性次级代谢物，且具有多样的功能，能促进植物生长，提高苗木抗旱、抗盐、抗病、抗虫能力，以及积累的生物活性成分等对药用植物药效的产生具有重要作用药用价值等特性。因此，利用内生真菌的抗菌活性，开发生物源农药是目前研究的热点。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一株拟青霉属EJKS菌株。

本发明再有一个目的是提供拟青霉属真菌EJKS的培养方法。

本发明另有一个目的是提供一株镰刀菌属E-9菌株。

本发明再有一个目的是提供镰刀菌属E-9菌株的培养方法。

本发明另有一个目的是提供所述的拟青霉属EJKS菌株和/或所述的镰刀菌属E-9菌株于植株拮抗叶斑病或科学研究中的应用。

为此，本发明提供的技术方案为：

拟青霉属EJKS菌株，拟青霉属Simplicillium sympodiophoum EJKS菌株被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：61996，保藏时间为：2021年10月18日，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。

优选的是，所述的拟青霉属EJKS菌株，所述拟青霉属EJKS菌株的28S rRNA基因部分序列如SEQ ID NO:5所示。

拟青霉属EJKS菌株的培养方法，包括如下步骤：

1)将所述的拟青霉属真菌EJKS菌丝接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中进行培养。

优选的是，所述的拟青霉属EJKS菌株的培养方法中，拮抗真菌EJKS的培养温度为约28℃，培养时间为5-7天。

镰刀菌属E-9菌株，镰刀菌属Fusariumincarnatum E-9菌株，被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：62167，保藏时间为：2021年12月28日，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。

镰刀菌属E-9菌株的培养方法，将所述的镰刀菌属E-9菌株的菌丝接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中进行培养。

所述的拟青霉属EJKS菌株和/或所述的镰刀菌属E-9菌株于植株拮抗叶斑病或科学研究中的应用。

优选的是，所述的应用中，所述应用包括制备生物源农药，所述生物源农药包括所述的拟青霉属EJKS菌株。

优选的是，所述的应用中，所述植株为广西莪术。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明首先为解决广西莪术大面积栽培中的病害问题奠定了研究基础，最直接的社会效益是使得广西莪术的大面积栽培得到保障，从而满足了医疗卫生行业的需要，保护野生资源，保证了广西莪术的可持续利用。其次，本发明中关于拮抗真菌对广西莪术叶斑病的病原菌抑制作用进行了研究，为研制防治该病害的生防制剂奠定基础，对恢复和发展广西莪术产业具有重要意义。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明其中一个实施例中病原菌镰刀菌属E-9菌株的***发育树。

图2为本发明其中一个实施例中病原菌镰刀菌属E-9菌落形态特征，其中，a为镰刀菌属E-9菌落正面，b为镰刀菌属E-9菌落反面，c为镰刀菌属E-9大型孢子；d为镰刀菌属E-9小型孢子。

图3为本发明其中一个实施例中病原菌镰刀菌属E-9致病性测定结果，其中，a为叶片正面病害症状，b为叶片反面病害症状。

图4为本发明其中一个实施例中拟青霉属真菌EJKS菌落生长图，其中，A：EJKS菌株菌落正面；B：EJKS菌株菌落背面；C：孢子。

图5为本发明其中一个实施例中拮抗真菌拟青霉属EJKS菌株的***发育树。

图6为本发明其中一个实施例中菌株EJKS侵染广西莪术叶斑病病原菌实验图，其中，A为未加入。

图7为图6的菌株EJKS侵染广西莪术叶斑病病原菌实验中的菌丝生长的图，其中A为对照的病原菌E-9正常菌丝，B为病原菌E-9的畸形菌丝。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

植物内生真菌(endophytic fungi)是指在健康植物组织内的某一周期或者全部周期中，对植物组织不会造成明显的病害症状的一类真菌，它是植物微生物群落的重要组成部分。内生真菌具有丰富的生物多样性，可以无症状地在植物的茎、叶和根等不同健康组织中生长，在温带和热带雨林中自然存在，分布着约30万种陆地寄主植物。内生真菌产生的生物活性化合物(不含寄主植物的活性化合物)对于提高内生真菌和寄主植物的适应性，如对生物和非生物胁迫的耐受性等具有重要意义。此外，这些化合物可以诱导产生大量已知和新颖的生物活性次级代谢物，且具有多样的功能，能促进植物生长，提高苗木抗旱、抗盐、抗病、抗虫能力，以及积累的生物活性成分等对药用植物药效的产生具有重要作用药用价值等特性。因此，利用内生真菌的抗菌活性，开发生物源农药是目前研究的热点。

本发明提供了拟青霉属EJKS菌株，拟青霉属Simplicillium sympodiophoum EJKS菌株被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：61996，保藏时间为：2021年10月18日，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，所述的拟青霉属EJKS菌株，所述拟青霉属EJKS菌株的28S rRNA基因部分序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明还提供拟青霉属EJKS菌株的培养方法，包括如下步骤：

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，拮抗真菌EJKS的培养温度为约28℃，培养时间为5-7天。

本发明还提供了镰刀菌属E-9菌株，镰刀菌属Fusariumincarnatum E-9菌株，被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：62167，保藏时间为：2021年12月28日，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。

本发明还提供了镰刀菌属E-9菌株的培养方法，将所述的镰刀菌属E-9菌株的菌丝接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中进行培养。

本发明还提供了所述的拟青霉属EJKS菌株和/或所述的镰刀菌属E-9菌株于植株拮抗叶斑病或科学研究中的应用。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，所述应用包括制备生物源农药，所述生物源农药包括所述的拟青霉属EJKS菌株。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，所述的应用中，所述植株为广西莪术。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试菌株

供试病原菌广西莪术镰刀菌属E-9病株于2021年7月采自广西壮族自治区宾阳县种植区，镰刀菌属Fusariumincarnatum E-9菌株被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：62167，保藏时间为：2021年12月28日，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。

供试拮抗真菌菌株EJKS(Simplicillium sympodiophoumr EJKS)分离自健康的广西莪术叶片，为广西壮族自治区药用植物园植物病理研究室保存鉴定的菌株，在NCBI的菌株登录号OK175703。菌株保藏号为GDMCC No：61996，保藏时间为：2021年10月18日，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。

1.1.2供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)：马铃薯(从中提取浸出粉)300g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L、最终pH5.6±0.2。

1.1.3主要试验试剂

0.1％升汞溶液、75％乙醇、无菌水、琼脂糖、1×TAE溶液，鉴定病原菌分子所用的总试剂盒购自于宝日医生物技术有限公司，其试剂详情见表1。

表1分子试剂

1.2试验方法

1.2.1关于病原菌的分离、纯化和鉴定

1.2.1.1病原菌分离和纯化

选取广西莪术叶片的病健交界处病组织，切成5mm×5mm小块，用75％乙醇浸泡30s，0.1％升汞消毒2min，再用无菌水漂洗3次，置于PDA培养基上28℃培养，待长出菌丝后，挑取菌落边缘进行纯化，纯化后的菌落通过单孢分离获得纯培养分离物。

1.2.1.2病原菌的致病性测定

用针刺法将分离和纯化的菌丝块(1cm×1cm)接种于无病健康且长势相近的广西莪术叶部，同时以接种无菌PDA培养基(1cm×1cm)作为对照，每个处理三个重复，放置于具有湿润的滤纸片的培养皿中，保湿培养，定期观察发病情况。适时对发病组织进行病原菌分离和纯化，观察该病原菌是否与接种菌株相同。

1.2.1.3病原菌形态鉴定

观察病原菌在PDA培养基上的菌落特征，用光学显微镜观察菌丝、分生孢子等形态特征，对病原菌进行形态鉴定。

1.2.1.4分子生物学鉴定

将纯化好的病原菌菌株移植于PDA平板培养基上，培养5d，收集菌丝，采用SDS裂解法用DNA提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取真菌基因组DNA。ITS扩增引物序列为通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)(SEQ ID NO:1)和ITS4(5’-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3’)(SEQ ID NO:2)(White et al.1990)和β-微管蛋白基因(beta-tubulin)TUB1和TUB2(Weir et al.2012)扩增病原菌的rDNA-TUB序列。扩增反应在25μL反应体系中进行，Template(基因组DNA 20-50ng/μL)为0.5μL，10×Buffer(with Mg²⁺)为2.5μL，dNTP(各2.5mM)为1μL，酶0.2μL，引物各0.5μL，加双蒸H₂O至25μL。热循环反应程序设置如下：94℃下初始变性4min，接下来为94℃下变性45sec，55℃下引物退火45sec，72℃下延伸60sec，30个循环结束后在72℃下修复延伸10min。扩增中利用水代替DNA模板为空白对照。用凝胶电泳法检测PCR反应结果，吸取4μL PCR产物加入1％(W/V)琼脂糖凝胶，凝胶置于1×TBE缓冲液(0.9M Tris-Borate,0.01M EDTA,pH＝8.3)中，在110V下电泳40min。将扩增后的DNA产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化测序。并且把测序结果与GenBank中的序列进行blast比对。以ITS相似序列，利用MEGA4.0软件的Neighbor-Joining法构建病原菌***发育树。

1.2.2关于拮抗真菌的分离、纯化和鉴定

1.2.2.1拮抗真菌的分离

选取健康无病的来自不同植株的广西莪术叶片，采用常规组织分离法(方中达,1998)，将组织切成5cm片段依次用75％乙醇和0.1％升汞表面消毒2.5min，无菌水冲洗3次；用无菌镊子和手术刀将其切成约5mm大小组织块，放在PDA(含有链霉素的培养基)平板上，采用五点取样法，每平皿放来自不同植株的7块广西莪术组织，每个实验重复处理5皿，采用超净工作台无菌检测法、漂洗液的无菌检测法和组织印迹无菌检测法检测表面消毒是否彻底，以确保广西莪术叶片内生真菌准确分离(朱宏建等，2012)。在28℃恒温培养箱培养，待组织块边缘长出菌丝，再转接至PDA平板上培养，经反复纯化得到单一的纯菌落，将其转移斜面培养基4℃冰箱保存。据菌落培养特征将分离、纯化的内生真菌划分为不同的形态类型。

(1)形态学鉴定

把纯化后的病原菌菌株转接在新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，放置在28℃、RH65％的光照培养箱培养，按时观察菌落的形态(菌丝形态及颜色等)，并对其记录和描述，待菌落长满8.5cm平板培养皿后拍照记录。培养10天后，挑取孢子在光学显微镜下观察孢子形态，对病原菌进行初步鉴定。

(2)分子生物学鉴定

将纯化后的待测菌株在光照培养箱培养5天后，采用分子试剂盒28S rDNA序列，委托生工生物工程(上海)股份有限公司对扩增产物进行测序，把测定得到序列与NCBI中的核苷酸序列中进行blast比对分析相关真菌的序列同源性，然后利用MEGA4.0软件构建拮抗真菌的***发育树。具体步骤如下：

①PCR产物的制备

PCR反应体系的总体积为50μL(见表2)

表2PCR反应体系组成

②PCR扩增步骤98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火45s，68℃延伸1min，68℃保存10min，进行35个循环。

③PCR产物跑电泳

使用2.5μl DL 2000DNA Marker与2.5μl 6×Loading buffer混匀(作为参照标准)，2.5μl的PCR产物与2.5μl 6×Loading buffer混匀，分别点样进1％琼脂糖胶，放在1xTAE电极缓冲液中，设置电压为130V跑电泳30min，经过电泳检测后在暗箱式紫外反射仪302nm处观察目的条带，把显示清晰明亮的条带的PCR产物随后送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

④产物序列分析

将检测得出的序列用NCBI(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中的核苷酸序列进行blast比对分析相关真菌的序列同源性，从结果中找序列覆盖率较高的真菌分离物的序列，并下载保存。

⑤***发育分析

将菌株序列与下载的相关菌株序列存至txt文本，为了使所有序列的同源性达到最大，使用clustalx软件进行序列比对，把不整齐的两端序列删除，将文件另外保存为txt文本，用MEGA4.0构建拮抗真菌菌株的***发育树。

1.3菌株EJKS对广西莪术叶斑病病原菌的抑制作用测定

采用平板对峙法测定菌株EJKS对广西莪术叶斑病病原菌的抑菌效果。平板对峙法：将直径为0.5cm的病原菌组织块置入PDA培养基一侧，在其另一侧等距离处接种菌株EJKS组织块，以只接种病原菌为对照，每处理3个重复；待对照长满整个平皿时，测量菌落直径，计算抑制率。抑制率(％)＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/对照菌落直径×100。

2结果与分析

2.1关于病原菌

1)把测得的病原菌基因序列在NCBI上进行核苷酸比对相关真菌的序列同源性，结果显示，菌株E-9与镰刀菌Fusariumincarnatum(NCBI登录号：MH85768.1)的相似性高达100％。分别将本实验测得的序列提交给NCBI数据库，获得各基因登录序列号，查找并下载含有ITS和TUB基因的镰刀菌属菌株序列，联合代表菌株的两个基因(ITS和TUB)联合构建病原菌的多基因***发育树，结果表明E-9与半裸镰刀菌相聚为同进化支，且支持率为99％，如图1所示。依据病原菌的形态学特征与多基因***发育树，确定引起广西莪术叶斑病的病原菌为镰刀菌属的Fusariumincarnatum，其登录号分别是OK175677和OK326873。该镰刀菌属FusariumincarnatumE-9菌株被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCCNo：62167，保藏时间为：2021年12月28日，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。

SEQ ID NO:3：

>Seq Fusariumincarnatum isolate E-9 18S ribosomal RNA gene,partialsequence；internal transcribed spacer 1,5.8S ribosomal RNA gene,and internaltranscribed spacer 2,complete sequence；and 28S ribosomal RNA gene,partialsequence

TGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTATACGTTGCCTCG

GCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGACGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACTCTGTTTTTAG

TGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGC

ATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAAT

CTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCC

TCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGATTGGCGGTCACGT

CGAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTAAAAC

CCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA

SEQ ID NO:4

>Seq Fusariumincarnatum strain E_9T beta-tubulin(tub)gene,partial cds

CCACCCTGTTCACCTTCAGACCGGTCAGTGCGTTTTCAGGTCCACGTCAGGTCGGCCAATGTGTA

AGGCTTACCCACCAAAAAACTGTTTTGAGGGAAATGTGTTGAGTTGATGATTTTTGCAGGGCAAC

CAAGTCGGTTCCAGCTTCTGGTAGGTGTTTTACAGCTTGAATTAACTTTTCAACAGTCAATTGAGC

TTTTGCTAACGTGTTTTCAGGAACACCGTCGGTAACCAAATTGGTGCTGCTTTCTGGCAAACCATC

TCTGGCGAGCACGGTCTCGACAGCAATGGTGTTTACAACGGTACCTCCGAGCTCCAGCTCGAGCG

TATGAGCGTCTACTTCAACGAGAGCGCATCAACGTCTACTTCGCTGAGGTAAGCTAACCGCAAAC

TCTTATGAGTTTGTTTACTAACGTATCCAGCGTTCCGGTAACAAGTATGTTCCCCGTGCCGTCCTCG

TCGATCTCGAGCCCGGTACCATGGACGCCGTCCGTGCCGGTCCTTTCGGACAGCTTTTCCGTCCCG

ACAACTTCGTTTTCGGTCAATCCGGTGCCGGAAACAACTGGGCCAAGGGGCCCTACACTGAGGGT

ACTTACAACCCCCCCCCCTTTTTAA

2)E-9菌落为规则圆形生长，菌丝羊绒状，初为白色、背部为淡黄色，后期菌丝变为淡粉色，背面为中间为橙黄色，外圈为粉色。大小分生孢子在气生菌丝上无明显的界限，多数为中型孢子，镰刀状，3-5隔，小型分生孢子长椭圆形，1-3隔.根据上述形态特征，初步认为病原菌E-9为镰刀菌属(Fusarium)真菌，如图2所示。

3)致病性测定病原菌E-9回接叶片后2-3天开始发病，嫩叶和老叶都被侵染，一般先浸染嫩叶。病害发生早期症状表现为叶片出现水渍状淡黄色病斑，并且病健相间处明显，随着病原菌的继续侵染，病斑不断扩大，后期形成边缘黄褐色而中心暗褐色的不规则病斑，此外病斑外环绕黄色晕圈，严重时病斑会连接成片，导致整片叶片发黄，如图3中所示。依据柯赫氏法则，由此确定菌株E-9是引起莪术叶斑病的病原菌。

2.2关于拮抗真菌

2.2.1菌株EJKS形态特征及分子鉴定

菌株EJKS菌落呈白色至淡黄色，边缘整齐，质地呈绒毛状，菌落背面呈黄色，生长缓慢；菌株EJKS孢子形态特征为分生孢子呈圆球形，大小1-2μm。如图4所示。

分子生物学特征，EJKS菌株用通用引物28S rDNA序列进行PCR扩增和测序，获得583bp核苷酸序列。将该序列与NCBI中GenBank的序列进行BLAST比对，结果发现EJKS菌株与Simplicillium sympodiophoumr同源性很高，相似度达100.0％。采用MEGA 4.0对EJKS菌株的28S rDNA序列进行***发育进化树构建，如图5所示，结果表明，EJKS菌株与S.sympodiophoumr NG068548菌株序列在***发育进化树上处于同一个分支，属S.sympodiophoumr，序列登录号OK175703。

SEQ ID NO:5

>Seq Simplicillium sympodiophorum EJKS28S rRNA gene,partial sequence

CAATTGGCATTGCCCCAGTACGGCGAGTGAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCCTAGAGTCCGAATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTTTGATGCGGTGCCTTCCGAGTTCCCTGGAACGGGACGCCATAGAGGGTGAGAGCCCCGTCTGGTCGGATGCCAAATCTCTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCTAAATGGGAGGTATATGTCTTCTAAAGCTAAATATTGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGGGTTAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCCTATGACCAGACTTGGGCCCGGTGAATCATCCAGCGTTCTCGCTGGTGCACTTTGCCGGGCACAGGCCAGCATCAGTTTGGCTCGGGGGAAAAAGGCTTTGGGAATGTAGCTCCCCTCGGGGAGTGTTATAGACCATTGCACAATACCCTGGGCCGGACTGAGGTTCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAGCGATCCGTCTTGAAACCACGGACCACTG

2.3菌株EJKS对广西莪术叶斑病病原菌的拮抗作用

从图6和图7可看出，菌株EJKS对广西莪术叶斑病病原菌E-9有明显的抑制作用，抑菌率达56.47％。在光学显微镜下，观察到受菌株EJKS影响的病原菌E-9菌丝生长畸形，菌丝膨大***，呈串珠形状，而正常菌丝光滑、细直，表明菌株EJKS对病原菌菌丝的抑制作用明显。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

附参考文献

Weir BS,Johnston PR,Damm U(2012)The Colletotrichum gloeosporioidesspecies complex.Stud Mycol 73:115–180.

White TJ,Bruns T,Lee S,Taylor J(1990)Amplification anddirectsequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.In:Innis MA,Gelfand DH,Sninsky JJ,WhiteTJ(eds)PCR protocols,a guide to methods andapplications.Academic Press,San Diego,pp 315–322.

国家药典委员会.2020.中华人民共和国药典一部[M].北京：中国医药科技出版社.马瑞.海南省温郁金两种病害的病原鉴定、生物学特性及室内药剂筛选[D].海南大学,2018.蒋妮,刘丽辉,胡凤云,刘威,刘凡.广西莪术叶斑病病原鉴定及生物学特性研究[J].中国现代中药,2016,18(05):616-619.

霍焕燃.青蒿提取物对四种植物病原镰刀菌的抑菌活性研究[D].西北师范大学,2021.刘才.农作物病虫害防治中农药使用污染问题及治理对策[J].种子科技,2021,39(02):75-76.

SEQUENCE LISTING

<110> 广西壮族自治区药用植物园

<120> 拟青霉属EJKS菌株、镰刀菌属E-9菌株及其应用

<130> 2020

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 523

<212> DNA

<213> Fusarium incarnatum E-9

<400> 3

tgcggaggga tcattaccga gtttacaact cccaaacccc tgtgaacata cctatacgtt 60

gcctcggcgg atcagcccgc gccccgtaaa acgggacggc ccgcccgagg acccctaaac 120

tctgttttta gtggaacttc tgagtaaaac aaacaaataa atcaaaactt tcaacaacgg 180

atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg cagcaaaatg cgataagtaa tgtgaattgc 240

agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg cccgccagta ttctggcggg 300

catgcctgtt cgagcgtcat ttcaaccctc aagctcagct tggtgttggg actcgcggta 360

acccgcgttc cccaaatcga ttggcggtca cgtcgagctt ccatagcgta gtaatcatac 420

acctcgttac tggtaatcgt cgcggccacg ccgtaaaacc ccaacttctg aatgttgacc 480

tcggatcagg taggaatacc cgctgaactt aagcatatca ata 523

<210> 4

<211> 615

<212> DNA

<213> fusarium incarnatum E-9

<400> 4

ccaccctgtt caccttcaga ccggtcagtg cgttttcagg tccacgtcag gtcggccaat 60

gtgtaaggct tacccaccaa aaaactgttt tgagggaaat gtgttgagtt gatgattttt 120

gcagggcaac caagtcggtt ccagcttctg gtaggtgttt tacagcttga attaactttt 180

caacagtcaa ttgagctttt gctaacgtgt tttcaggaac accgtcggta accaaattgg 240

tgctgctttc tggcaaacca tctctggcga gcacggtctc gacagcaatg gtgtttacaa 300

cggtacctcc gagctccagc tcgagcgtat gagcgtctac ttcaacgaga gcgcatcaac 360

gtctacttcg ctgaggtaag ctaaccgcaa actcttatga gtttgtttac taacgtatcc 420

agcgttccgg taacaagtat gttccccgtg ccgtcctcgt cgatctcgag cccggtacca 480

tggacgccgt ccgtgccggt cctttcggac agcttttccg tcccgacaac ttcgttttcg 540

gtcaatccgg tgccggaaac aactgggcca aggggcccta cactgagggt acttacaacc 600

cccccccctt tttaa 615

<210> 5

<211> 583

<212> DNA

<213> Simplicillium sympodiophorum EJKS

<400> 5

caattggcat tgccccagta cggcgagtga gcggcaacag ctcaaatttg aaatctggct 60

cctagagtcc gaattgtaat ttgcagagga tgcttttgat gcggtgcctt ccgagttccc 120

tggaacggga cgccatagag ggtgagagcc ccgtctggtc ggatgccaaa tctctgtaaa 180

gctccttcga cgagtcgagt agtttgggaa tgctgctcta aatgggaggt atatgtcttc 240

taaagctaaa tattggccag agaccgatag cgcacaagta gagtgatcga aagatgaaaa 300

gcactttgaa aagagggtta aaaagtacgt gaaattgttg aaagggaagc gcctatgacc 360

agacttgggc ccggtgaatc atccagcgtt ctcgctggtg cactttgccg ggcacaggcc 420

agcatcagtt tggctcgggg gaaaaaggct ttgggaatgt agctcccctc ggggagtgtt 480

atagaccatt gcacaatacc ctgggccgga ctgaggttcg cgcatctgca aggatgctgg 540

cgtaatggtc atcagcgatc cgtcttgaaa ccacggacca ctg 583

Claims

1.拟青霉属EJKS菌株，拟青霉属Simplicillium sympodiophoum EJKS菌株被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：61996，保藏时间为：2021年10月18日，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。

2.如权利要求1所述的拟青霉属EJKS菌株，其特征在于，所述拟青霉属EJKS菌株的28SrRNA基因部分序列如SEQ ID NO:1所示。

3.拟青霉属EJKS菌株的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将如权利要求1所述的拟青霉属EJKS菌丝接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中进行培养。

4.如权利要求3所述的拟青霉属EJKS菌株的培养方法，其特征在于，培养温度为28℃，培养时间为5-7天。

5.如权利要求1所述的拟青霉属EJKS菌株于拮抗广西莪术叶斑病病原菌镰刀菌属Fusariumincarnatum E-9中的应用，其特征在于，镰刀菌属Fusariumincarnatum E-9菌株被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：62167，保藏时间为：2021年12月28日，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。