CN114276405B - 五环三萜类化合物、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物医药领域，具体公开了一种五环三萜类化合物、其制备方法及应用。五环三萜类化合物的分子式为C₂₉H₄₂O₆，分子量为486.65，结构式为：

；其制备方法包括：S1，提取：对干燥翼首草药材进行乙醇浸提得到提取物；S2，萃取：使用萃取溶剂对提取物进行萃取，旋干，得到萃取物；S3，纯化：将萃取物依次使用大孔树脂柱、硅胶柱Ⅰ、硅胶柱Ⅱ、MCI柱、硅胶柱Ⅲ、凝胶柱层析，收集洗脱液，旋干，即得。本申请的五环三萜类化合物具有降血糖活性和抗炎活性，且20μmol/L浓度以下对细胞存活无影响；采用本申请的制备方法，每20kg干燥翼首草药材可提取9mg该五环三萜类化合物，纯度≥98%。

Description

五环三萜类化合物、其制备方法及应用

技术领域

本申请涉及生物医药领域，更具体地说，它涉及五环三萜类化合物、其制备方法及应用。

背景技术

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害和功能障碍。糖尿病已成为继心血管疾病、恶 性肿瘤之后导致人类死亡的第三大“健康杀手”。

目前，针对糖尿病，多以西药控制症状为主，其中，阿卡波糖是应用十分广泛的降血糖药物。阿卡波糖是一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，长期服用，可降低空腹血糖和糖化血红蛋白的浓度。但因阿卡波糖在小肠内分解，且吸收缓慢，停留时间延长，经肠道细菌的酵解而产气增多，会引起腹胀、腹痛及腹泻等不适症状。我国早在二千多年前就有关于中医药的医学典籍《黄帝内经》，中医药治疗疾病历史悠久，积累了丰富的经验，而且中药还具有作用缓和持久、毒副作用小、适合患者长期服用等特点，有着其他药物不可替代的综合优势，已引起医药界越来越多的关注。因此，从中药中寻找具有降血糖活性的天然活性物质具有十 分广阔的发展前景。

翼首草为川续断科植物匙叶翼首草Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)Hoeck.的干燥全 草，为藏族习用药材，其用药历史悠久。翼首草性寒味苦，具有解毒除瘟，清热止痢，祛风 通痹之功效，多用于瘟病时疫、感冒发热、痢疾、关节炎等疾病的治疗。有研究表明，翼首 草的主要活性成分包括三萜及其苷、环烯醚萜、黄酮等。但目前，在对翼首草的药学研究 中，大多都集中在对翼首草抗类风湿性关节炎和抗肿瘤方面的研究，而并没有关于翼首草降 血糖活性和相关活性物质的研究报告。

发明内容

为了进一步探究翼首草的药学性能，特别是降血糖活性，并确定相应的天然活性物 质，本申请提供一种五环三萜类化合物、其制备方法及应用。

第一方面，本申请提供一种五环三萜类化合物，采用如下的技术方案：

一种五环三萜类化合物，所述五环三萜类化合物的分子式为C₂₉H₄₂O₆，分子量为486.65，结 构式如式Ⅰ所示：

优选的，所述五环三萜类化合物在翼首草中提取获得。

发明人采用乙醇浸提的方式对翼首草中药进行了提取，然后经过萃取和纯化步骤， 得到了一种翼首草的活性物质。经过MS、¹H NMR、¹³C NMR、DEPT、¹H-¹H COSY、¹H- ¹HNOESY、HMBC分析后，确定了该活性物质的分子式为C₂₉H₄₂O₆，分子量为486.65，结 构式如上述式Ⅰ所示。

进一步的，使用RAW 264.7细胞为试验样本，对式Ⅰ化合物进行细胞毒性研究，结果表明，当给药浓度在20μmol/L以下时，式Ⅰ化合物对于细胞存活无影响。在此之后，对 式Ⅰ化合物进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性的相关研究，并以阿卡波糖作为阳性对照，结果 表明，浓度为500μmol/L的阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率为50.37％，而式Ⅰ化合物在 浓度为10μmol/L时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率就达到了60.31％。由此可见，在式Ⅰ化合 物浓度仅为阿卡波糖浓度2％的情况下，本申请式Ⅰ化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制率就可超 过阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率，为阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制率的119.7％。表明式Ⅰ化合物具有十分优异的降血糖活性。另外，通过使用RAW 264.7细胞为试验样本，对 式Ⅰ化合物进行抗炎活性研究，结果表明，式Ⅰ化合物可明显减少培养液中的一氧化氮含量 和炎症因子IL-6含量，表明式Ⅰ化合物还具有十分优异的抗炎活性。

第二方面，本申请提供上述五环三萜类化合物的制备方法，采用如下的技术方案：上述五环三萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：

S1，提取：以干燥翼首草药材为原料，通过乙醇浸提的方式提取得到提取物；

S2，萃取：依次使用萃取溶剂Ⅰ和萃取溶剂Ⅱ对步骤S1所得的提取物进行萃取，旋干，得 到萃取物；

S3，纯化：将步骤S2所得的萃取物依次使用大孔树脂柱、硅胶柱Ⅰ、硅胶柱Ⅱ、MCI柱、 硅胶柱Ⅲ、凝胶柱进行柱层析，收集洗脱液，旋干，即得；

步骤S2中，所述萃取溶剂Ⅰ为三氯甲烷、二氯甲烷和乙酸乙酯中的任意一种；所述萃取溶 剂Ⅱ为异丙醇、甲醇和正丁醇中的任意一种；

步骤S3中，所述硅胶柱Ⅰ、硅胶柱Ⅱ、硅胶柱Ⅲ均为正向硅胶柱。

本申请在提取式Ⅰ化合物时，使用乙醇水溶液作为提取溶剂，从中提取到多种翼首草活性物质，然后通过萃取步骤，先使用小极性的二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯等溶剂对提取物进行萃取，静置分层后，再次使用大极性的异丙醇、甲醇和正丁醇等溶剂进行萃取分离，旋干后得到萃取物，最后选择合适的洗脱溶剂依次对萃取物进行多次柱层析，从萃取物中逐步分离目标产物，从而得到式Ⅰ化合物。通过采用上述步骤，每20kg干燥翼首草中药中，可分离提取到式Ⅰ化合物9～10mg，纯度≥98％。

优选的，S1的具体步骤为：

取干燥翼首草药材粉碎，加入8～20倍于翼首草药材质量的提取溶剂，控制温度为60～ 75℃，浸提2～3h，过滤，收集滤液，将滤渣在相同的温度和浸提时间下重复浸提1～3次，过滤，合并滤液，将所得滤液浓缩，得到提取物；

所述提取溶剂为质量百分浓度为70～95％的乙醇水溶液。

进一步优选的，步骤S1中，提取溶剂为质量百分浓度为80％的乙醇水溶液，控制浸提温度为70℃，共浸提3次，每次浸提2h。

上述技术方案，通过对提取溶剂种类、浓度及使用量的选择，通过控制浸提的温度、次数和时间，从而充分提取获得了翼首草药材中的有效活性物质，为后续分离式Ⅰ化合物奠定了基础。在实现本申请的过程中，发明人通过单因素试验，确定了浸提的较优条件，即在70℃下浸提3次，每次浸提2h。

优选的，S2的具体步骤为：

将提取物使用1～3倍于提取物体积的萃取溶剂Ⅰ萃取3～5次，静置分层，合并有机相，然 后使用1～3倍于提取物体积的萃取溶剂Ⅱ萃取3～5次，静置分层，合并有机相，旋干，得 到萃取物。

依次使用萃取溶剂Ⅰ和萃取溶剂Ⅱ对提取物进行萃取，并且每次萃取均采用多次萃 取的方式进行，提高了对有效物质的萃取效果。

优选的，S3的具体步骤为：

S3-1，使用大孔树脂柱对萃取物进行纯化，使用按体积比洗脱溶剂Ⅰ:水＝9:1～49:1的溶剂洗 脱，过柱流速为50～70mL/min，分段收集洗脱液，对洗脱液进行MS分析，合并含有目标 产物的洗脱液得到洗脱液Ⅰ；

S3-2，使用硅胶柱Ⅰ对洗脱液Ⅰ进行纯化，使用按体积比石油醚:乙酸乙酯＝1:1的溶剂洗 脱，过柱流速为50～70mL/min，分段收集洗脱液，对洗脱液进行MS分析，合并含有目标 产物的洗脱液得到洗脱液Ⅱ；

S3-3，使用硅胶柱Ⅱ对洗脱液Ⅱ进行纯化，使用按体积比石油醚:乙酸乙酯＝5:1的溶剂洗 脱，过柱流速为50～70mL/min，分段收集洗脱液，对洗脱液进行MS分析，合并含有目标 产物的洗脱液得到洗脱液Ⅲ；

S3-4，使用MCI柱对洗脱液Ⅲ进行纯化，使用按体积比洗脱溶剂Ⅱ:水＝2:3～1:1的溶剂洗 脱，过柱流速为50～70mL/min，分段收集洗脱液，对洗脱液进行MS分析，合并含有目标 产物的洗脱液得到洗脱液Ⅳ；

S3-5，使用硅胶柱Ⅲ对洗脱液Ⅳ进行纯化，使用按体积比二氯甲烷:甲醇＝200:1的溶剂洗 脱，过柱流速为50～70mL/min，分段收集洗脱液，对洗脱液进行MS分析，合并含有目标 产物的洗脱液得到洗脱液Ⅴ；

S3-6，使用凝胶柱对洗脱液Ⅴ进行纯化，使用按体积比洗脱溶剂Ⅲ:水＝3:2～9:1的溶剂洗 脱，过柱流速为0.8～1.2L/min，分段收集洗脱液，对洗脱液进行MS分析，合并含有目标产 物的洗脱液得到洗脱液Ⅵ，旋干，即得；

步骤S3-1中，所述洗脱溶剂Ⅰ为甲醇、乙醇和乙腈中的任意一种；

步骤S3-4中，所述洗脱溶剂Ⅱ为甲醇、乙醇和乙腈中的任意一种；

步骤S3-6中，所述洗脱溶剂Ⅲ为甲醇、乙醇和乙腈中的任意一种。

在纯化步骤中，先将萃取物通过大孔树脂柱层析，分段收集洗脱液，然后对洗脱液进行MS分析，将含有目标产物(m/z 486.65±1)的洗脱液合并，然后再依次使用硅胶柱 Ⅰ、硅胶柱Ⅱ、MCI柱、硅胶柱Ⅲ、凝胶柱进行柱层析，分段收集洗脱液，并同样对洗脱液 进行MS分析，将最终得到的含有目标产物的洗脱液合并，旋干，即得式Ⅰ化合物。通过采 用上述方法，从翼首草的众多活性物质中顺利分离出了式Ⅰ化合物，且所得式Ⅰ化合物的纯 度较高，可达98％以上。

进一步优选的，步骤S3-1中，使用按体积比洗脱溶剂Ⅰ:水＝19:1的溶剂洗脱，洗脱溶剂Ⅰ为乙醇。

进一步优选的，步骤S3-4中，使用按体积比洗脱溶剂Ⅱ:水＝1:1的溶剂洗脱，洗脱溶 剂Ⅱ为甲醇。

进一步优选的，步骤S3-6中，使用按体积比洗脱溶剂Ⅲ:水＝7:3的溶剂洗脱，洗脱溶 剂Ⅲ为甲醇。

第三方面，本申请提供上述五环三萜类化合物在制备降血糖药物和抗炎药物中的应 用。

第四方面，本申请提供一种药物组合物，采用如下的技术方案：

一种药物组合物，包括上述五环三萜类化合物，以及一种或多种药学上可接受的载体。

其中，药学上可接受的载体可以根据不同需要进行常规选择，可包括稀释剂，例如甘露醇、山梨醇、葡萄糖、右旋糖酐、果糖、微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、淀粉、糊 精、磷酸钙、蔗糖、水、聚乙二醇、丙二醇、甘油、环糊精及其衍生物等；还可包括粘合 剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羟丙基纤维素、 羟乙基纤维素、明胶、瓜耳胶、黄原胶等；还可包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、滑石 粉、硬脂基富马酸钠、月桂基硫酸钠等；还可包括崩解剂，例如羧甲基淀粉钠、低取代羟丙 基纤维素、羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、交联羧甲基淀粉 钠、预胶化淀粉等；还可包括表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠、聚山梨酯-80等；还可包 括pH调节剂，例如磷酸盐缓冲液、柠檬酸、柠檬酸钠、醋酸盐缓冲液、稀盐酸、碳酸钠、 氢氧化钠等；还可包括防腐剂，例如苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯 甲酸丙酯等；还可包括稳定剂，例如依地酸钙钠、亚硫酸钠、维生素C等；还可包括口味 调节剂，例如麦芽糖醇、果糖、蔗糖、糖精钠、桔子香精、草莓香精等；另外，还可包括药 学上可接受的其它常规载体。

优选的，所述药物组合物的剂型为药学上可接受的任何剂型。

其中，药物组合物的剂型可以根据不同需要进行常规选择，可以是药学上可接受的 任何剂型，包括液体剂型，例如芳香水剂、溶液剂、注射剂、合剂、洗剂、搽剂等；还包括固体剂型，例如散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉末剂等；还包括气体剂型，例如气 雾剂、喷雾剂等；还包括半固体剂型，例如软膏剂、凝胶剂、栓剂、糊剂等。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请的五环三萜类化合物具有较好的降血糖活性，浓度为10μmol/L时，对α-葡萄糖 苷酶的抑制率即可达60.31％，可用于制备降血糖药物；

2、本申请的五环三萜类化合物从天然中药材翼首草中提取获得，为天然活性物质，对人体 毒害作用小，细胞毒性试验结果表明，当其浓度在20μmol/L以下时，对RAW264.7细胞 存活无影响；

3、本申请的五环三萜类化合物具有较好的抗炎活性，以RAW 264.7细胞为试验样本的抗炎 活性试验结果表明，该化合物可明显减少培养液中的一氧化氮含量和炎症因子IL-6含量；

4、本申请的制备方法，每20kg干燥翼首草药材中可提取9～10mg该五环三萜类化合物， 且纯度≥98％；

5、本申请的五环三萜类化合物，可与一种或多种药学上可接受的载体制成药物组合物，且 该药物组合物可根据使用需要制备成药学上可接受的任何剂型，因本申请的五环三萜类化合 物具有较好的降血糖活性和抗炎活性，从而使得药物组合物具有十分优异的降血糖活性和抗 炎活性。

附图说明

图1是本申请实施例1中式Ⅰ所示化合物的MS检测图；

图2是本申请实施例1中式Ⅰ所示化合物的¹H NMR检测图；

图3是本申请实施例1中式Ⅰ所示化合物的¹³C NMR检测图；

图4是本申请实施例1中式Ⅰ所示化合物的DEPT及¹³C NMR对比图；

图5是本申请实施例1中式Ⅰ所示化合物的¹H-¹H COSY谱图；

图6是本申请实施例1中式Ⅰ所示化合物的¹H-¹H NOESY谱图；

图7是本申请实施例1中式Ⅰ所示化合物的HMBC谱图(一)；

图8是本申请实施例1中式Ⅰ所示化合物的HMBC谱图(二)；

图9是本申请实施例1中式Ⅰ所示化合物碳位置的示意图；

图10是本申请性能检测中给药浓度与细胞存活率关系的柱状图；

图11是本申请性能检测中给药浓度与一氧化氮含量关系的柱状图；

图12是本申请性能检测中给药浓度与炎症因子IL-6含量关系的柱状图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。

本申请的各实施例中所用的原料，除下述特殊说明之外，其他均为市售：

实施例：五环三萜类化合物

实施例1

一种五环三萜类化合物，其分子式为C₂₉H₄₂O₆，分子量为486.65，结构式如式Ⅰ所示：

该五环三萜类化合物在翼首草中提取获得，提取方法包括以下步骤：

S1，提取：

取20kg干燥翼首草药材粉碎，加入200L质量百分浓度为80％的乙醇水溶液，控制温度为 70℃，浸提2h，过滤，收集滤液，将滤渣在相同的温度和浸提时间下重复浸提2次，过滤，合并滤液，将所得滤液在60℃的温度下旋干浓缩至100L，得到提取物；

S2，萃取：

将步骤S1所得的提取物使用300L乙酸乙酯萃取3次，静置分层，合并有机相，然后使用 300L正丁醇萃取3次，静置分层，合并有机相，在60℃的温度下旋干至无溶剂残留，得到 萃取物；

S3，纯化：

S3-1，使用大孔树脂柱对萃取物进行纯化，大孔树脂柱为大孔树脂柱D101，采自蓝晓科 技，使用按体积比乙醇:水＝19:1的溶剂洗脱，过柱流速为60mL/min，分段收集洗脱液，对 洗脱液进行MS分析，合并含有目标产物(m/z 486.65±1)的洗脱液得到洗脱液Ⅰ；

S3-2，使用硅胶柱Ⅰ对洗脱液Ⅰ进行纯化，硅胶柱Ⅰ为正向硅胶柱，采自青岛永海，使用按 体积比石油醚:乙酸乙酯＝1:1的溶剂洗脱，过柱流速为60mL/min，分段收集洗脱液，对洗脱 液进行MS分析，合并含有目标产物(m/z 486.65±1)的洗脱液得到洗脱液Ⅱ；

S3-3，使用硅胶柱Ⅱ对洗脱液Ⅱ进行纯化，硅胶柱Ⅱ为正向硅胶柱，采自青岛永海，使用按 体积比石油醚:乙酸乙酯＝5:1的溶剂洗脱，过柱流速为60mL/min，分段收集洗脱液，对洗脱 液进行MS分析，合并含有目标产物(m/z 486.65±1)的洗脱液得到洗脱液Ⅲ；

S3-4，使用MCI柱对洗脱液Ⅲ进行纯化，MCI柱为MCI柱CHP20P，采自sigma，使用按体积比甲醇:水＝1:1的溶剂洗脱，过柱流速为60mL/min，分段收集洗脱液，对洗脱液进行MS分析，合并含有目标产物(m/z 486.65±1)的洗脱液得到洗脱液Ⅳ；

S3-5，使用硅胶柱Ⅲ对洗脱液Ⅳ进行纯化，硅胶柱Ⅲ为正向硅胶柱，采自青岛永海，使用按 体积比二氯甲烷:甲醇＝200:1的溶剂洗脱，过柱流速为60mL/min，分段收集洗脱液，对洗脱 液进行MS分析，合并含有目标产物(m/z 486.65±1)的洗脱液得到洗脱液Ⅴ；

S3-6，使用凝胶柱对洗脱液Ⅴ进行纯化，凝胶柱为凝胶柱LH-20，采自GEHealthcare，使用 按体积比甲醇:水＝7:3的溶剂洗脱，过柱流速为1L/min，分段收集洗脱液，对洗脱液进行 MS分析，合并含有目标产物(m/z 486.65±1)的洗脱液得到洗脱液Ⅵ，在60℃的温度下旋 干至无溶剂残留，即得。

结合图1-图8的图谱数据，并结合图9与下表(核磁共振数据，CDCL₃)对五环三 萜类化合物进行结构解析。

结构解析结果：

该五环三萜类化合物呈无色针状晶体状，其氢谱低场区显示有3个连氧次甲基氢信号 4.42(1H，dd，J＝12.0，7.8Hz)，3.34(1H，dd，J＝3.6，1.8Hz)和3.02(1H，d，J＝3.6Hz)；高 场区显示有3个单峰甲基信号1.20(3H，s)，1.47(3H，s)和1.04(3H，s)；3个双峰甲基信号1.60(3H，d，J＝6.0Hz)，1.16(3H，d，J＝6.6Hz)和0.98(3H，d，J＝6.0Hz)。碳谱中显示有29个碳信号，包括一个特征的羰基碳信号(δC 213.2)；一个特征的酯羰基碳信号(δC 179.0)；四个特征的连氧sp3杂化的碳信号(δC 88.8，71.8，56.1和54.4)；其余碳信号均显示在高场区。综合分析这些数据表明该化合物为降碳三萜类化合物。在¹H-¹H COSY谱中H-1与H- 2，H-4与H-5，H-4与H-23相关，结合HMBC谱中H-2/4与C-3，H-24与C-5/10相关，可 以确定A环的连接；在¹H-¹H COSY谱中H-5与H-6，H-6与H-7分别相关，结合HMBC 谱中H-24与C-9/10/5，H-25与C-9/8/7相关，可以确定B环的连接；在¹H-¹H COSY谱中 H-9与H-11，H-11与H-12相关，结合HMBC谱中H-25与C-9/8/14，H-26与C-8/13/14， H-12与C-13相关，可以确定C环的连接；在¹H-¹H COSY谱中H-15与H-16相关，结合 HMBC谱中H-26与C-13/14/15，H-18/16与C-17/27相关，可以确定D环的连接；在¹H-¹H COSY谱中H-18与H-19，H-19与H-20，H-20与H-21，H-21与H-22，H-19与H-28，H- 20与H-29相关，结合HMBC谱中H-18/22与C-17相关可以确定E环的连接。由此可知， 该化合物与已知化合物11α,12α-epoxy-3β,6β-dihydroxy-24-norurs-2-oxo-(28→13)-olide非 常相似，只是在A环具有差异，这说明该化合物与此已知化合物中的B、C、D、E环具有 相同的结构。该化合物A环的相对构型通过NOESY谱中H-2与H-4，H-2与H-24分别相 关，可说明这些氢位于同一侧，至此我们确定该化合物的结构如上述式Ⅰ所示。

经检测，本实施例中，所得五环三萜类化合物的质量为9.5mg，纯度98.9％。

实施例2

一种五环三萜类化合物，其分子式为C₂₉H₄₂O₆，分子量为486.65，结构式如式Ⅰ所示：

该五环三萜类化合物在翼首草中提取获得，其提取方法与实施例1除步骤S1中的提 取溶剂为质量百分浓度为70％的乙醇水溶液之外，其他步骤均相同。

本实施例所得化合物的各谱图与实施例1一致。经检测，本实施例中，所得五环三萜类化合物的质量为9.3mg，纯度98.4％。

实施例3

一种五环三萜类化合物，其分子式为C₂₉H₄₂O₆，分子量为486.65，结构式如式Ⅰ所示：

该五环三萜类化合物在翼首草中提取获得，其提取方法与实施例1除步骤S1中的提 取溶剂为质量百分浓度为95％的乙醇水溶液之外，其他步骤均相同。

本实施例所得化合物的各谱图与实施例1一致。经检测，本实施例中，所得五环三萜类化合物的质量为9.2mg，纯度98.5％。

实施例4

一种五环三萜类化合物，其分子式为C₂₉H₄₂O₆，分子量为486.65，结构式如式Ⅰ所示：

该五环三萜类化合物在翼首草中提取获得，其提取方法与实施例1除步骤S1中的浸 提温度为60℃，共浸提4次之外，其他步骤均相同。

本实施例所得化合物的各谱图与实施例1一致。经检测，本实施例中，所得五环三萜类化合物的质量为9.3mg，纯度98.3％。

实施例5

一种五环三萜类化合物，其分子式为C₂₉H₄₂O₆，分子量为486.65，结构式如式Ⅰ所示：

该五环三萜类化合物在翼首草中提取获得，其提取方法与实施例1除步骤S1中的浸 提温度为75℃，共浸提2次之外，其他步骤均相同。

本实施例所得化合物的各谱图与实施例1一致。经检测，本实施例中，所得五环三萜类化合物的质量为9.4mg，纯度98.6％。

实施例6

一种五环三萜类化合物，其分子式为C₂₉H₄₂O₆，分子量为486.65，结构式如式Ⅰ所示：

该五环三萜类化合物在翼首草中提取获得，其提取方法与实施例1除步骤S3-1中使 用按体积比甲醇:水＝9:1的溶剂洗脱之外，其他条件步骤均相同。

本实施例所得化合物的各谱图与实施例1一致。经检测，本实施例中，所得五环三萜类化合物的质量为9.3mg，纯度98.4％。

实施例7

一种五环三萜类化合物，其分子式为C₂₉H₄₂O₆，分子量为486.65，结构式如式Ⅰ所示：

该五环三萜类化合物在翼首草中提取获得，其提取方法与实施例1除步骤S3-1中使 用按体积比乙腈:水＝49:1的溶剂洗脱之外，其他条件步骤均相同。

本实施例所得化合物的各谱图与实施例1一致。经检测，本实施例中，所得五环三萜类化合物的质量为9.4mg，纯度98.3％。

实施例8

一种五环三萜类化合物，其分子式为C₂₉H₄₂O₆，分子量为486.65，结构式如式Ⅰ所示：

该五环三萜类化合物在翼首草中提取获得，其提取方法与实施例1除步骤S3-4中使 用按体积比乙醇:水＝2:3的溶剂洗脱之外，其他条件步骤均相同。

本实施例所得化合物的各谱图与实施例1一致。经检测，本实施例中，所得五环三萜类化合物的质量为9.2mg，纯度98.5％。

实施例9

一种五环三萜类化合物，其分子式为C₂₉H₄₂O₆，分子量为486.65，结构式如式Ⅰ所示：

该五环三萜类化合物在翼首草中提取获得，其提取方法与实施例1除步骤S3-6中使 用按体积比乙醇:水＝3:2的溶剂洗脱之外，其他条件步骤均相同。

本实施例所得化合物的各谱图与实施例1一致。经检测，本实施例中，所得五环三萜类化合物的质量为9.1mg，纯度98.3％。

实施例10

一种五环三萜类化合物，其分子式为C₂₉H₄₂O₆，分子量为486.65，结构式如式Ⅰ所示：

该五环三萜类化合物在翼首草中提取获得，其提取方法与实施例1除步骤S3-6中使 用按体积比乙腈:水＝9:1的溶剂洗脱之外，其他条件步骤均相同。

本实施例所得化合物的各谱图与实施例1一致。经检测，本实施例中，所得五环三萜类化合物的质量为9.2mg，纯度98.2％。

实施例11

一种五环三萜类化合物，其分子式为C₂₉H₄₂O₆，分子量为486.65，结构式如式Ⅰ所示：

该五环三萜类化合物在翼首草中提取获得，其提取方法包括以下步骤：

S1，提取：

取20kg干燥翼首草药材粉碎，加入160L质量百分浓度为80％的乙醇水溶液，控制温度为 70℃，浸提2h，过滤，收集滤液，将滤渣在相同的温度和浸提时间下重复浸提2次，过滤，合并滤液，将所得滤液在60℃的温度下旋干浓缩至100L，得到提取物；

S2，萃取：

将步骤S1所得的提取物使用200L乙酸乙酯萃取5次，静置分层，合并有机相，然后使用 200L正丁醇萃取5次，静置分层，合并有机相，在60℃的温度下旋干至无溶剂残留，得到 萃取物；

S3，纯化：

本实施例的纯化步骤与实施例1除S3-1～S3-5中过柱流速为50mL/min，S3-6中过柱流速为0.8L/min之外，其他均相同。

本实施例所得化合物的各谱图与实施例1一致。经检测，本实施例中，所得五环三萜类化合物的质量为9.3mg，纯度98.5％。

实施例12

一种五环三萜类化合物，其分子式为C₂₉H₄₂O₆，分子量为486.65，结构式如式Ⅰ所示：

该五环三萜类化合物在翼首草中提取获得，其提取方法包括以下步骤：

S1，提取：

取20kg干燥翼首草药材粉碎，加入400L质量百分浓度为80％的乙醇水溶液，控制温度为 70℃，浸提2h，过滤，收集滤液，将滤渣在相同的温度和浸提时间下重复浸提2次，过滤，合并滤液，将所得滤液在60℃的温度下旋干浓缩至100L，得到提取物；

S2，萃取：

将步骤S1所得的提取物使用100L乙酸乙酯萃取4次，静置分层，合并有机相，然后使用 100L正丁醇萃取4次，静置分层，合并有机相，在60℃的温度下旋干至无溶剂残留，得到 萃取物；

S3，纯化：

本实施例的纯化步骤与实施例1除S3-1～S3-5中过柱流速为70mL/min，S3-6中过柱流速为 1.2L/min之外，其他均相同。

本实施例所得化合物的各谱图与实施例1一致。经检测，本实施例中，所得五环三萜类化合物的质量为9.4mg，纯度98.6％。

性能检测试验

以实施例1所得的五环三萜类化合物作为测试样品，测试该化合物的细胞毒性、α-葡萄糖 苷酶抑制活性、抗炎活性。

试验一：细胞毒性试验

将RAW 264.7细胞接种在皿中，观察细胞生长状态，待其融合度为70％时，用PBS吹打下 来计数接种96孔板，调整板中细胞密度为5×10⁴个/mL，细胞悬浮液为100μL，培养过夜 贴壁。试验分为空白组(等体积的DMSO)、空白对照组(给药浓度为0)以及给药组(给 药浓度分别为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)，每组设置3个 复孔，继续培养48h后，用吸引器吸去上清，加入100μL/孔工作浓度为1mg/mL的CCK-8 试剂，放入培养箱3.5h后，弃去培养基，加入100μL/孔的DMSO，在摇床上孵育30min后 检测490nm波长的吸光度值。

细胞存活率(％)＝(给药组吸光度-空白组吸光度)/(空白对照组吸光度-空白组吸光度) ×100％。

以空白对照组或给药组中的给药浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标，绘制柱状图，结果如图10所示。

通过图10可以看出，与空白对照组相比，当给药浓度在20μmol/L以下时，五环三萜类化合物对于细胞存活无影响(P＞0.05)。

试验二：α-葡萄糖苷酶抑制活性试验 配制底物：精确称取0.3766g PNPG，加入10mL磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH＝6.8)溶解， 然后定容至50mL，得到25mmol/L的PNPG底物。

配制α-葡萄糖苷酶溶液：将冻干酶粉(酶活力14u/mg)用磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH＝6.8)溶解，配制成2u/mL的α-葡萄糖苷酶溶液。

配制阿卡波糖溶液：将阿卡波糖用磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH＝6.8)溶解，配制成500μmol/L的阿卡波糖溶液。

配制测试样品溶液：将测试样品(实施例1得到的五环三萜类化合物)用磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH＝6.8)溶解，配制成10μmol/L的测试样品溶液。

试验分为空白组、背景组、阴性对照组、阳性对照组以及样品组，各反应物按下表中剂量在96孔板中进行加样，每组设置3个复孔。依次加入PBS溶液、抑制剂溶液和 PNPG底物，混合均匀，于37℃水浴保温10min。其中，阳性对照组的抑制剂溶液为阿卡波 糖溶液；样品组的抑制剂溶液为测试样品溶液。保温结束后，按下表中剂量加入37℃水浴 的α-葡萄糖苷酶溶液，混合均匀，于37℃水浴反应20min，结束后加入150μL 0.2mol/L的 Na₂CO₃溶液中止反应。

由于PNPG在α-葡萄糖苷酶的作用下，水解产生葡萄糖和PNP，PNP在405nm处有 最大吸收。因此，可通过测量各试验组405nm处的吸光度来计算出各试验组α-葡萄糖苷酶 的抑制率。测定借助α-葡萄糖苷酶活性检测试剂盒(购自北京盒子生工)进行。

抑制率(％)＝[1-(样品组或阳性对照组吸光度-样品空白组吸光度)/(背景组吸光度- 空白组吸光度)]×100％。

阳性对照组及样品组的抑制率如下表所示。

组别	抑制率(％)
		阳性对照组	50.37
样品组	60.31

从上表数据可知，浓度为500μmol/L的阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率为50.37％，而测试样品在浓度为10μmol/L时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率就达到了60.31％。通过进一步分析可知，在测试样品浓度仅为阿卡波糖浓度2％的情况下，测试样品抑制率就可达阿卡波糖抑制率的119.7％，由此表明了，本申请的五环三萜类化合物具有较好的降血糖活性，可应用于制备降血糖药物。

试验三：抗炎活性试验

将RAW 264.7细胞接种在皿中，观察细胞生长状态，待其融合度为70％时，用PBS吹打下 来计数接种96孔板，调整板中细胞密度为5×10⁴个/mL，细胞悬浮液为100μL，培养过夜 贴壁。过夜贴壁后，弃去培养基，重新恢复至室温(25℃)的培养基，2.5mL/孔。试验分为模型对照组(等量1mg/mL脂多糖)、空白组(给药浓度为0)及给药组(给药浓度分别为5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L)，每组设置3个复孔。继续培养48h后，使用 一氧化氮检测试剂盒(购自碧云天)及小鼠IL-6ELISA检测试剂盒(购自碧云天)，检测 各孔细胞培养液中一氧化氮及炎症因子IL-6含量。

以模型对照组、空白组或给药组中的给药浓度为横坐标，一氧化氮含量为纵坐标，绘制柱状图，结果如图11所示。以模型对照组、空白组或给药组中的给药浓度为横坐标， 炎症因子IL-6含量为纵坐标，绘制柱状图，结果如图12所示。

通过图11可以看出，与空白组相比，模型对照组细胞培养液中一氧化氮的含量明显 升高(^###P＜0.001)；与模型对照组相比，给药浓度为5μmol/L的给药组细胞培养液中的一氧 化氮含量有所减少(^**P＜0.01)，给药浓度为10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L的给药组细 胞培养液中的一氧化氮含量减少的更为显著(^**P＜0.001)，且随着给药量的增加，一氧化氮含 量有明显的减少趋势，两者呈现一定的量效关系。

通过图12可以看出，与空白组相比，模型对照组中IL-6含量明显升高(^###P＜0.001)；与模型对照组相比，给药浓度为5μmol/L的给药组细胞培养液中的IL-6表达显著降低(^**P＜0.01)，给药浓度为10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L的给药组细胞培养液中的 IL-6含量也显著降低(^**P＜0.001)，且随着给药量的增加，IL-6含量有明显减少的趋势，两 者呈现较明显的量效关系。因此，本申请的五环三萜类化合物具有较好的抗炎活性，可应用于制备抗炎药物。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员 在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请 的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (6)

1.一种五环三萜类化合物，其特征在于，所述五环三萜类化合物的分子式为C₂₉H₄₂O₆，分子量为486.65，结构式如式Ⅰ所示：

式Ⅰ。

2.权利要求1所述五环三萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，提取：取干燥翼首草药材粉碎，加入8～20倍于翼首草药材质量的提取溶剂，控制温度为60～75℃，浸提2h，过滤，收集滤液，将滤渣在相同的温度和浸提时间下重复浸提1～3次，过滤，合并滤液，将所得滤液浓缩，得到提取物；

所述提取溶剂为质量百分浓度为70～95%的乙醇水溶液；

S2，萃取：将提取物使用1～3倍于提取物体积的萃取溶剂Ⅰ萃取3～5次，静置分层，合并有机相，然后使用1～3倍于提取物体积的萃取溶剂Ⅱ萃取3～5次，静置分层，合并有机相，旋干，得到萃取物；

S3，纯化：S3-1，使用大孔树脂柱对萃取物进行纯化，使用按体积比洗脱溶剂Ⅰ:水=9:1～49:1的溶剂洗脱，过柱流速为50～70mL/min，分段收集洗脱液，对洗脱液进行MS分析，合并含有目标产物的洗脱液得到洗脱液Ⅰ；

S3-2，使用硅胶柱Ⅰ对洗脱液Ⅰ进行纯化，使用按体积比石油醚:乙酸乙酯=1:1的溶剂洗脱，过柱流速为50～70mL/min，分段收集洗脱液，对洗脱液进行MS分析，合并含有目标产物的洗脱液得到洗脱液Ⅱ；

S3-3，使用硅胶柱Ⅱ对洗脱液Ⅱ进行纯化，使用按体积比石油醚:乙酸乙酯=5:1的溶剂洗脱，过柱流速为50～70mL/min，分段收集洗脱液，对洗脱液进行MS分析，合并含有目标产物的洗脱液得到洗脱液Ⅲ；

S3-4，使用MCI柱对洗脱液Ⅲ进行纯化，MCI 柱为 MCI 柱 CHP20P，使用按体积比洗脱溶剂Ⅱ:水=2:3～1:1的溶剂洗脱，过柱流速为50～70mL/min，分段收集洗脱液，对洗脱液进行MS分析，合并含有目标产物的洗脱液得到洗脱液Ⅳ；

S3-5，使用硅胶柱Ⅲ对洗脱液Ⅳ进行纯化，使用按体积比二氯甲烷:甲醇=200:1的溶剂洗脱，过柱流速为50～70mL/min，分段收集洗脱液，对洗脱液进行MS分析，合并含有目标产物的洗脱液得到洗脱液Ⅴ；

S3-6，使用凝胶柱对洗脱液Ⅴ进行纯化，凝胶柱为凝胶柱 LH-20，使用按体积比洗脱溶剂Ⅲ:水=3:2～9:1的溶剂洗脱，过柱流速为0.8～1.2L/min，分段收集洗脱液，对洗脱液进行MS分析，合并含有目标产物的洗脱液得到洗脱液Ⅵ，旋干，即得；

步骤S3-1中，所述洗脱溶剂Ⅰ为甲醇、乙醇和乙腈中的任意一种；

步骤S3-4中，所述洗脱溶剂Ⅱ为甲醇、乙醇中的任意一种；

步骤S3-6中，所述洗脱溶剂Ⅲ为甲醇、乙醇和乙腈中的任意一种；

步骤S2中，所述萃取溶剂Ⅰ为乙酸乙酯；所述萃取溶剂Ⅱ为正丁醇；

步骤S3中，所述硅胶柱Ⅰ、硅胶柱Ⅱ、硅胶柱Ⅲ均为正向硅胶柱。

3.根据权利要求2所述的五环三萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述S1中，提取溶剂为质量百分浓度为80%的乙醇水溶液，控制浸提温度为70℃，共浸提3次，每次浸提2h。

4.根据权利要求2所述的五环三萜类化合物的制备方法，其特征在于，步骤S3-1中，使用按体积比洗脱溶剂Ⅰ:水=19:1的溶剂洗脱，洗脱溶剂Ⅰ为乙醇。

5.根据权利要求2所述的五环三萜类化合物的制备方法，其特征在于，步骤S3-4中，使用按体积比洗脱溶剂Ⅱ:水=1:1的溶剂洗脱，洗脱溶剂Ⅱ为甲醇。

6.根据权利要求2所述的五环三萜类化合物的制备方法，其特征在于，步骤S3-6中，使用按体积比洗脱溶剂Ⅲ:水=7:3的溶剂洗脱，洗脱溶剂Ⅲ为甲醇。

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