CN114209617A - 一种酵母发酵的灵芝提取物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酵母发酵的灵芝提取物，其中包含经酵母发酵的灵芝成分和酵母提取物成分，具体为酵母发酵的灵芝提取液或该提取液干燥后的粉状产品，另外还提供了该酵母发酵的灵芝提取物的制备方法及其用于制备化妆品的用途。本发明的酵母发酵的灵芝提取物富含多种营养物质，具有良好的美白祛斑、保湿以及修复细胞损伤的作用，且没有皮肤刺激性，安全性良好，适于作为化妆品的成分使用。
Description
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种酵母发酵的灵芝提取物及其制备方法、以及该提取物在制备化妆品中的用途。
背景技术
历史上很早就有将动植物身上提取出来的动植物油脂作为护肤化妆品的记载。在化学工业逐步发展后，化妆品行业也进入化工时代，并从以油和水乳化技术为基础的第二代化妆品逐渐进化到添加各类动植物萃取精华的第三代化妆品。近年来，生物发酵技术开始在化妆品行业崭露头角，出于对健康和产品安全的考虑，人们的绿色产品意识和有害化学品威胁意识不断增强，有机绿色护理产品的需求持续增加，天然有机护理产品市场不断升温，拥有绿色天然成分的产品将会成为众多消费者的理想选择。这也促使天然化妆品成为化妆品研发的重点领域，其中，生物发酵技术在化妆品应用中的重要性不断增强。生物自然发酵的化妆品无香精、无色素、无防腐剂、无荧光剂、无化学油脂、无动物油脂、无化工添加剂，其中特别是采用天然酵母经过漫长自然发酵过程所释放出的成分，效果更卓越，更加安全环保。
灵芝(Ganoderma lucidum)为多孔菌科真菌赤芝(Ganoderma lucidum)或紫芝(Ganoderma sinense)的干燥子实体。具有补气安神，止咳平喘的功效。主治心神不宁，失眠，惊悸，咳喘痰多，虚劳证等。目前灵芝多开发为保健食品或药品，其作为化妆品开发应用还较少，其相关科学研究也鲜有报道。现有的灵芝提取物由灵芝工艺发酵提取，主要成分为灵芝三萜类化合物和灵芝多糖。最早从灵芝子实体中分离到三萜类化合物，在1982年分离出灵芝酸A和灵芝酸B之后，灵芝中的三萜类化合物的研究日益受到重视。1988年以前已分离得到105种三萜类化合物，到20世纪90年代，研究人员又陆续从子实体或孢子中分离得到了一些新的三萜化合物。灵芝多糖是灵芝中除三萜类外研究最深入最广泛的一类化合物。20世纪70年代对灵芝多糖的研究主要集中在多糖和多糖复合物组分的分离、制备和药理作用方面，到80年代和90年代则主要集中在灵芝多糖及多糖复合物的结构及其与功能的关系方面。目前国内外已从灵芝中分离到200多种多糖体，灵芝多糖中除含葡萄糖外，大多数还含有***糖、木糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖等其他单糖。。
已有通过发酵制备灵芝提取物的相关研究。冯杰等研究了氮源对灵芝菌丝体液态深层发酵合成灵芝三萜的影响，发现选择合适的氮源种类并确定其最佳用量和发酵培养基的组成可有效促进灵芝三萜的合成(菌物学报，2016，第35卷第6期)。翟双星等研究了复合有机氮源对灵芝三萜液态深层发酵的影响，其中发现选择合适的酵母粉作为灵芝液态深层发酵用氮源至关重要(菌物学报，2018，第37卷第12期)。钟柳艳等开发了一种灵芝提取液的发酵工艺并评价了发酵产物的保湿功能，其中采用确定Kefir作为灵芝发酵的菌种(华南农业大学硕士学位论文，2016)。中国专利申请CN202110678737.9中公开了一种灵芝发酵产物及其制备方法和在化妆品中的应用。然而，这些研究大多仍处于探索阶段，仍然存在功能单一、功效不足、营养物质不够丰富的问题，本领域仍期待具有美白、保湿、受损肌肤修复等复合功能的化妆品用的灵芝提取物产品，而且期待该产品具有较强的功效以及富含滋养肌肤的有益成分。
酵母提取物(yeast extract)又称酵母抽提物，是指以酵母为主要原料，在酵母自身的酶或外加酶的作用下，酶解自溶并且再经分离提取后得到的产品。酵母提取物常用的提取方法包括利用内源酶自溶法、外源酶处理法、化学处理法等技术将酵母细胞的蛋白质降解成氨基酸和多肽、核酸降解成核苷酸，并把它们和其它有效成分，如B族维生素、微量元素(例如硒、锌、铁、铜等)、谷胱甘肽一起从酵母细胞中抽提出来所制得的水溶性营养物质的浓缩物。酵母提取物中含有丰富的小分子肽、游离氨基酸、维生素、核酸、核苷酸等活性成分，其中氨基酸含量30％以上，总蛋白50％以上，核苷酸10％以上，主要应用于食品、调味品、化妆品等领域。目前，酵母提取物主要有三种应用形式，第一种为酵母发酵产物滤液，例如SK-II公司从覆膜孢酵母属的特殊酵母在发酵后去除酵母菌体提炼的液体产物pitera，具有滋润及保湿功能；第二种为酵母溶胞产物提取物，是通过破壁手段使酵母菌破碎后将营养物质提炼所得的产物，例如雅诗兰黛公司的小棕瓶系列中含酵母溶胞产物提取物。第三种为酵母滤液和酵母提取物都存在的营养液，此类提取物产品很好地利用了发酵物滤液和菌体中所含的营养物质，能够降低酵母提取物的获取成本，避免有用物质的浪费，但也存在较多的缺陷，例如产品杂质较多，刺激性较大，需要繁琐的调配工艺、美白和修复能力较低等问题。
发明内容
针对上述技术问题，发明人经过深入研究，提供了本发明的技术方案，具体为一种酵母发酵的灵芝提取物，并提供了该提取物的制备方法、以及该提取物在制备化妆品中的用途。本发明可解决当前灵芝发酵物以及酵母提取物中存在的问题，具有良好的技术效果。
一方面，本发明涉及一种酵母发酵的灵芝提取物，其中包含经酵母发酵的灵芝成分和酵母提取物成分，为酵母发酵的灵芝提取液或该提取液干燥后的粉状产品。
另一方面，本发明涉及一种酵母发酵的灵芝提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌株活化：从低温保存管中取保存的酵母菌种，解冻获得菌液，取1-3滴菌液滴入固态活化培养基边缘，用划线法接种，置于20-30℃下培养2-3天后挑取一环接种于盛有葡萄糖液体培养基的三角瓶中，于25-28℃恒温震荡培养12-24小时，转速为100-200rpm，获得种子培养液；
(2)震荡培养：将步骤(1)所得到的种子培养液按照3-8重量％的接种量接入装有震荡发酵培养基的三角瓶中，在20-30℃下培养1-2天，转速为150-250rpm；
(3)中期培养发酵：将步骤(2)所得的培养液按照1∶10-50的体积比例移入装有中期培养基的中期培养罐中进行培养发酵，在28-32℃下培养3-5天，转速120-150rpm，在中期培养发酵开始的第1-2天向中期培养基中加入灵芝粗提液、燕麦β-葡聚糖和酵母发酵助剂；
(4)主发酵：将步骤(3)所得的培养液按照1∶50-100的体积比例移入装有主发酵培养基的主发酵罐内进行发酵7-15天，温度控制为20-25℃，并使用超声波辅助发酵；从开始进行主发酵时起计算，在第3-7天时开始向主发酵罐内添加***钠和硫酸锌溶液，在第5-10天时开始向主发酵罐内添加灵芝粉(100微米左右)、姜黄素、桑白皮粉、蚕丝蛋白粉、以及二裂酵母发酵产物溶胞物；
(5)从步骤(4)所得的培养液制备酵母发酵的灵芝提取物。
根据本发明的一个方面，步骤(1)中的酵母菌种选自鲁考弗美奇酵母(Metschnikowia reukaufii，CCTCC S2014001)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus，CGMCC 2.5691)、维多利亚维希尼克氏酵母(Vishniacozyma victoriae、CGMCC 2.5593)中的一种或多种。
根据本发明的一个方面，步骤(1)中所用的低温保存管的保存温度为-80至-20℃。
根据本发明的一个方面，步骤(1)中的固态活化培养基的制备方法为：将酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂粉20g溶解于1升去离子水中，在121℃高温蒸气灭菌15分钟，冷却至50℃时加入0.1升200g/L的葡萄糖溶液。
根据本发明的一个方面，步骤(2)中的震荡发酵培养基的组成为：蛋白胨7-15g/L、葡萄糖18-26g/L、酵母浸膏13-15g/L、磷酸二氢钾4-12g/L、硫酸镁4-12g/L、氯化钾1-2g/L，磷酸钠0.2-0.4g/L、氯化镁0.01-0.25/L、氯化钙0.05-0.2g/L、硫酸铜0.004-0.01g/L、钼酸钠0.005-0.008g/L、硼酸0.002-0.006g/L、硫酸锌0.004-0.006g/L、吐温80 0.3-0.5g/L，pH7.0。优选地，步骤(2)中的震荡发酵培养基的组成为：蛋白胨8g/L、葡萄糖22g/L、酵母浸膏14g/L、磷酸二氢钾8g/L、硫酸镁8g/L、氯化钾1.5g/L，磷酸钠0.3g/L、氯化镁0.1/L、氯化钙0.1g/L、硫酸铜0.005g/L、钼酸钠0.006g/L、硼酸0.004g/L、硫酸锌0.005g/L、吐温80 0.4g/L。
根据本发明的一个方面，步骤(3)中的中期培养基的组成为：蔗糖62.5-67.5g/L，酵母浸膏35-40g/L，生物素0.3-0.6g/L、硫酸铵10-15g/L、玉米浆干粉10-15g/L、干酪素17.5-21.3g/L、硫酸镁3.3-6.2g/L，磷酸二氢钾4.2-7.8g/L、谷胱甘肽3.1-5.6g/L和大豆卵磷脂2.1-3.5g/L。优选地，步骤(3)中的中期培养基的组成为：蔗糖65g/L，酵母浸膏37g/L，生物素0.4g/L、硫酸铵12g/L、玉米浆干粉13g/L、干酪素20.4g/L、硫酸镁4.7g/L，磷酸二氢钾5.1g/L、谷胱甘肽4.3g/L和大豆卵磷脂5.6g/L。
根据本发明的一个方面，步骤(3)中的灵芝粗提液的制备方法为：将灵芝粉碎为100微米左右的灵芝粉，按照料液质量比为1:20的比例将灵芝粉加入蒸馏水中，在75℃的水浴条件下搅拌，提取3小时，过滤并收集首次提取滤液，将滤渣按照相同条件重复提取一次获得第二次提取滤液，将首次提取滤液和第二次提取滤液合并，即得灵芝粗提液；每升培养基中灵芝粗提液的加入量为0.2L。本文中所述的相同条件是指按照料液质量比为1:20的比例将分离首次提取滤液得到的滤渣加入蒸馏水中，在75℃的水浴条件下搅拌，提取3小时，过滤并收集滤液(即第二次提取滤液)。
根据本发明的一个方面，步骤(3)中的酵母发酵助剂为
K。优选地，步骤(3)中酵母发酵助剂
K的用量为50g/L。
根据本发明的一个方面，步骤(3)中的燕麦β-葡聚糖的用量为2-8g/L，优选为5g/L。
根据本发明的一个方面，步骤(4)中的主发酵培养基的组成为：柠檬酸4-7g/L、硫酸亚铁0.02-0.15g/L、硫酸锰0.03-0.42g/L、二氯化钴0.01-0.25g/L、硼酸0.02-0.35g/L、硫酸铜0.05-0.5g/L、硫酸二铵3-5g/L、硫酸镁5-8g/L、二氯化钙5-7g/L、菜籽油15-20g/L、酵母浸膏15-25g/L、以及12-16g/L的葡萄糖。优选地，步骤(4)中的主发酵培养基的组成为：柠檬酸5g/L、硫酸亚铁0.1g/L、硫酸锰0.24g/L、二氯化钴0.09g/L、硼酸0.21g/L、硫酸铜0.15g/L、硫酸二铵4g/L、硫酸镁7g/L、二氯化钙6g/L、菜籽油17g/L、酵母浸膏20g/L、以及14g/L的葡萄糖。
根据本发明的一个方面，步骤(4)中添加的***钠和硫酸锌溶液中***钠的浓度为0.06-0.1g/L，硫酸锌溶液的浓度为0.03-0.42g/L，每升培养液中加入量为50mL。优选地，步骤(4)中添加的***钠和硫酸锌溶液中***钠的浓度为0.08g/L，硫酸锌溶液的浓度为0.18g/L。
根据本发明的一个方面，步骤(4)中灵芝粉的添加量为12-18g/L，优选为15g/L；姜黄素的添加量为0.1-1.0g/L，优选为0.5g/L；桑白皮粉的添加量为12-20g/L，优选为15g/L；蚕丝蛋白粉的添加量为20-40g/L，优选为30g/L；二裂酵母发酵产物溶胞物的添加量为1-2g/L，优选为1.5g/L。
根据本发明的一个方面，本发明所用的灵芝为赤芝(Ganoderma lucidum)或者紫芝(Ganoderma sinense)；优选地，本发明所用的灵芝为赤芝。
根据本发明的一个方面，步骤(5)中的制备酵母发酵的灵芝提取物的具体步骤为：
a)分离步骤(5)培养液中的菌体，分别收集滤液和菌体；
b)将滤液负压浓缩至1/5-1/3体积(优选为1/4体积)得到滤液浓缩液；
c)将菌体用纯净水调成20-50质量％(优选为40质量％)的浆液，加入0.1-0.6质量％(优选为0.5质量％)的食盐，搅拌3-5小时(优选为4小时)除去酵母异味，并用离心机离心分离，除去上清液并收集菌体；
d)将菌体用纯净水稀释为20-50质量％(优选为40质量％)的浆液后装入自溶灌，按2-5g/L(优选3.125g/L)添加氯化钠，在不断搅拌的条件下升温至45-55℃(优选为50℃)并保持恒温1-3小时(优选2小时)以促进菌体自溶；
e)然后用磷酸将浆液pH调节至4.5-5.5(优选为5.0)，添加复合水解酶进行酶解24-72小时，其中复合水解酶的组成及用量为：木瓜酶0.2-0.5g/L(优选为0.25g/L)、胰酶0.02-0.05g/L(优选为0.025g/L)、葡聚糖酶0.2-0.5g/L(优选为0.25g/L)；
f)灭酶，并以4000rpm的速度离心分离，取上清液，负压浓缩至1/10-1/4体积(优选1/5体积)后与步骤b)的滤液浓缩液合并，得到酵母发酵的灵芝提取液；
g)可选地，将步骤f)所得到的酵母发酵的灵芝提取液喷雾干燥，制备为粉状产品。
本发明中涉及的灵芝粉、桑白皮粉、蚕丝蛋白粉可通过本领域已知的常规方法得到。例如，灵芝粉可通过将干燥灵芝实体破壁后粉碎至微米级的粉末，优选为100微米左右的灵芝粉，或者可以通过中国专利申请201911002877.3中公开的方法制备。用于将干燥灵芝实体破壁粉碎的机械在本领域是已知的，例如中国专利201821019801.2或201721753452.2中所公开的机械。桑白皮分可通过将桑白皮用粉碎工艺进行粉碎，获得亚微米的桑白皮粉，例如可以先将桑白皮干品粉碎至粒径为80-200微米的粗粉末，接着粉碎至粒径为10-30微米的细粉末，在该细粉末中加入纯化水，然后进一步粉碎为0.1-0.3微米的亚微米的桑白皮粉，过滤后干燥。蚕丝蛋白粉可采用本领域已知的方法获得，例如可通过中国专利CN01126628.7中记载的方法进行制备。
本发明还提供了一种酵母发酵的灵芝提取物，其为根据本发明记载的制备方法制备得到的酵母发酵的灵芝提取液或其干燥后的粉状产品。
本发明还提供了根据本发明所得到的酵母发酵的灵芝提取物的用途，其可用于制备化妆品。优选地，所述化妆品为护肤品。优选地，所述化妆品为选自润肤乳、皮肤柔顺剂、爽肤水、收敛剂、润肤液、乳液、保湿润肤液、营养润肤液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华素、营养精华素、面膜、香皂、洗面奶、洁肤露、洁面霜、润肤露或身体乳中的任何一种。
相对于现有技术而言，本发明制备所得的酵母发酵的灵芝提取物富含多种氨基酸、多肽、灵芝多糖以及灵芝三萜类化合物，具有良好的美白祛斑、保湿以及修复细胞损伤的作用，且没有皮肤刺激性，安全性良好，适于作为化妆品的成分使用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本实施例中所用的灵芝为赤芝。
菌株活化：从低温保存管(-80℃保存)中取保存的酵母菌种(鲁考弗美奇酵母，Metschnikowia reukaufii，CCTCC S2014001，中国典型培养物保藏中心，中国湖北省武汉市)，解冻后获得菌液，取1滴菌液滴入固态活化培养基边缘，用划线法接种，置于20℃下培养3天后挑取一环接种于盛有葡萄糖液体培养基的三角瓶中，于25℃恒温震荡培养24小时，转速为200rpm，获得种子培养液。固态活化培养基采用如下方法制备：将酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂粉20g溶解于1升去离子水中，在121℃高温蒸气灭菌15分钟，冷却至50℃时加入0.1升200g/L的葡萄糖溶液。
震荡培养：将菌株活化步骤所得到的种子培养液按照3重量％的接种量接入装有震荡发酵培养基的三角瓶中，在20℃下培养2天，转速为250rpm；其中震荡发酵培养基的组成为：蛋白胨15g/L、葡萄糖18g/L、酵母浸膏13g/L、磷酸二氢钾12g/L、硫酸镁12g/L、氯化钾2g/L，磷酸钠0.2g/L、氯化镁0.25/L、氯化钙0.2g/L、硫酸铜0.004g/L、钼酸钠0.008g/L、硼酸0.002g/L、硫酸锌0.004g/L、吐温80 0.3g/L，pH 7.0。
中期培养发酵：将震荡培养所得的培养液按照1:10的体积比例移入装有中期培养基的中期培养罐中进行培养发酵，在28℃下培养5天，转速150rpm，在中期培养发酵开始的第2天向中期培养基中加入灵芝粗提液、燕麦β-葡聚糖和酵母发酵助剂。其中，中期培养基的组成为：蔗糖62.5g/L，酵母浸膏35g/L，生物素0.6g/L、硫酸铵10g/L、玉米浆干粉10g/L、干酪素21.3g/L、硫酸镁6.2g/L，磷酸二氢钾4.2g/L、谷胱甘肽3.1g/L和大豆卵磷脂3.5g/L。灵芝粗提液的制备方法为将灵芝粉碎为100微米左右的灵芝粉，按照料液质量比为1:20的比例将灵芝粉加入蒸馏水中，在75℃的水浴条件下搅拌，提取3小时，过滤并收集首次提取滤液，将滤渣按照相同条件重复提取一次获得第二次提取滤液，将首次提取滤液和第二次提取滤液合并，即得灵芝粗提液；每升培养基中灵芝粗提液的加入量为0.2L。酵母发酵助剂为
K(拉曼公司，加拿大魁北克)，用量为50g/L。燕麦β-葡聚糖的用量为8g/L。
主发酵：将中期培养发酵所得的培养液按照1∶50的体积比例移入装有主发酵培养基的主发酵罐内进行发酵7天，温度控制为20℃，并使用超声波辅助发酵；从开始进行主发酵时起计算，在第3天时开始向主发酵罐内添加***钠和硫酸锌溶液，在第5天时开始向主发酵罐内添加灵芝粉(100微米左右)、姜黄素、桑白皮粉、蚕丝蛋白粉、以及二裂酵母发酵产物溶胞物；其中主发酵培养基的组成为：柠檬酸7g/L、硫酸亚铁0.02g/L、硫酸锰0.03g/L、二氯化钴0.25g/L、硼酸0.35g/L、硫酸铜0.5g/L、硫酸二铵3g/L、硫酸镁5g/L、二氯化钙7g/L、菜籽油15g/L、酵母浸膏15g/L、以及12g/L的葡萄糖。添加的***钠和硫酸锌溶液中***钠的浓度为0.1g/L，硫酸锌溶液的浓度为0.42g/L，每升培养液中加入量为50mL。其中，灵芝粉的添加量为18g/L，姜黄素的添加量为1.0g/L，桑白皮粉的添加量为12g/L，蚕丝蛋白粉的添加量为20g/L，二裂酵母发酵产物溶胞物的添加量为1g/L。
提取制备酵母提取物：分离经主发酵的培养液中的菌体，分别收集滤液和菌体。将滤液负压浓缩至1/5体积得到滤液浓缩液A；将菌体用纯净水调成20质量％的浆液，加入0.1质量％的氯化钠，搅拌3小时除去酵母异味，并用离心机离心分离，除去上清液并收集菌体，其中离心速度为2000rpm；将菌体用纯净水稀释为20质量％的浆液后装入自溶灌，按2g/L添加氯化钠，在不断搅拌的条件下升温至55℃并保持恒温1小时以促进菌体自溶；然后用磷酸将浆液pH调节至4.5，添加复合水解酶进行酶解72小时，其中复合水解酶的组成及用量为：木瓜酶0.2g/L、胰酶0.02g/L、葡聚糖酶0.2g/L；灭酶，并以4000rpm的速度离心分离，取上清液，负压浓缩至1/10体积后与滤液浓缩液A合并，得到酵母发酵的灵芝提取液，将所得的酵母发酵的灵芝提取液的一半体积量留存，将其余一半体积量的酵母发酵的灵芝提取液喷雾干燥后得到粉状产品。
实施例2
本实施例中所用的灵芝为赤芝。
菌株活化：从低温保存管(-80℃保存)中取保存的酵母菌种(奇异酵母，Saccharomyces paradoxus，CGMCC 2.5691，中国普通微生物菌种保藏管理中心，中国北京市)，解冻后获得菌液，取2滴菌液滴入固态活化培养基边缘，用划线法接种，置于25℃下培养3天后挑取一环接种于盛有葡萄糖液体培养基的三角瓶中，于25℃恒温震荡培养20小时，转速为150rpm，获得种子培养液。固态活化培养基采用如下方法制备：将酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂粉20g溶解于1升去离子水中，在121℃高温蒸气灭菌15分钟，冷却至50℃时加入0.1升200g/L的葡萄糖溶液。
震荡培养：将菌株活化步骤所得到的种子培养液按照5重量％的接种量接入装有震荡发酵培养基的三角瓶中，在25℃下培养2天，转速为200rpm；其中震荡发酵培养基的组成为：蛋白胨8g/L、葡萄糖22g/L、酵母浸膏14g/L、磷酸二氢钾8g/L、硫酸镁8g/L、氯化钾1.5g/L，磷酸钠0.3g/L、氯化镁0.1/L、氯化钙0.1g/L、硫酸铜0.005g/L、钼酸钠0.006g/L、硼酸0.004g/L、硫酸锌0.005g/L、吐温80 0.4g/L，pH 7.0。
中期培养发酵：将震荡培养所得的培养液按照1:25的体积比例移入装有中期培养基的中期培养罐中进行培养发酵，在30℃下培养4天，转速130rpm，在中期培养发酵开始的第2天向中期培养基中加入灵芝粗提液、燕麦β-葡聚糖和酵母发酵助剂。其中，中期培养基的组成为：蔗糖65g/L，酵母浸膏37g/L，生物素0.4g/L、硫酸铵12g/L、玉米浆干粉13g/L、干酪素20.4g/L、硫酸镁4.7g/L，磷酸二氢钾5.1g/L、谷胱甘肽4.3g/L和大豆卵磷脂5.6g/L。灵芝粗提液的制备方法为将灵芝粉碎为100微米左右的灵芝粉，按照料液质量比为1:20的比例将灵芝粉加入蒸馏水中，在75℃的水浴条件下搅拌，提取3小时，过滤并收集首次提取滤液，将滤渣按照相同条件重复提取一次获得第二次提取滤液，将首次提取滤液和第二次提取滤液合并，即得灵芝粗提液；每升培养基中灵芝粗提液的加入量为0.2L。酵母发酵助剂为
K(拉曼公司，加拿大魁北克)，用量为50g/L。燕麦β-葡聚糖的用量为8g/L。
主发酵：将中期培养发酵所得的培养液按照1∶75的体积比例移入装有主发酵培养基的主发酵罐内进行发酵10天，温度控制为25℃，并使用超声波辅助发酵；从开始进行主发酵时起计算，在第5天时开始向主发酵罐内添加***钠和硫酸锌溶液，在第7天时开始向主发酵罐内添加灵芝粉(100微米左右)、姜黄素、桑白皮粉、蚕丝蛋白粉、以及二裂酵母发酵产物溶胞物；其中主发酵培养基的组成为：柠檬酸5g/L、硫酸亚铁0.1g/L、硫酸锰0.24g/L、二氯化钴0.09g/L、硼酸0.21g/L、硫酸铜0.15g/L、硫酸二铵4g/L、硫酸镁7g/L、二氯化钙6g/L、菜籽油17g/L、酵母浸膏20g/L、以及14g/L的葡萄糖。添加的***钠和硫酸锌溶液中***钠的浓度为0.08g/L，硫酸锌溶液的浓度为0.18g/L，每升培养液中加入量为50mL。其中，灵芝粉的添加量为15g/L，姜黄素的添加量为0.5g/L，桑白皮粉的添加量为15g/L，蚕丝蛋白粉的添加量为30g/L，二裂酵母发酵产物溶胞物的添加量为1.5g/L。
提取制备酵母提取物：分离经主发酵的培养液中的菌体，分别收集滤液和菌体。将滤液负压浓缩至1/4体积得到滤液浓缩液A；将菌体用纯净水调成40质量％的浆液，加入0.5质量％的氯化钠，搅拌4小时除去酵母异味，并用离心机离心分离，除去上清液并收集菌体，其中离心速度为2000rpm；将菌体用纯净水稀释为40质量％的浆液后装入自溶灌，按3.125g/L添加氯化钠，在不断搅拌的条件下升温至50℃并保持恒温2小时以促进菌体自溶；然后用磷酸将浆液pH调节至5.0，添加复合水解酶进行酶解36小时，其中复合水解酶的组成及用量为：木瓜酶0.25g/L、胰酶0.025g/L、葡聚糖酶0.25g/L；灭酶，并以4000rpm的速度离心分离，取上清液，负压浓缩至1/5体积后与滤液浓缩液A合并，得到酵母发酵的灵芝提取液，将所得的酵母发酵的灵芝提取液的一半体积量留存，将其余一半体积量的酵母发酵的灵芝提取液喷雾干燥后得到粉状产品。
实施例3
本实施例中所用的灵芝为紫芝。
菌株活化：从低温保存管(-20℃保存)中取保存的酵母菌种(维多利亚维希尼克氏酵母(Vishniacozyma victoriae、CGMCC 2.5593，中国普通微生物菌种保藏管理中心，中国北京市)，解冻后获得菌液，取3滴菌液滴入固态活化培养基边缘，用划线法接种，置于30℃下培养2天后挑取一环接种于盛有葡萄糖液体培养基的三角瓶中，于28℃恒温震荡培养12小时，转速为100rpm，获得种子培养液。固态活化培养基采用如下方法制备：将酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂粉20g溶解于1升去离子水中，在121℃高温蒸气灭菌15分钟，冷却至50℃时加入0.1升200g/L的葡萄糖溶液。
震荡培养：将菌株活化步骤所得到的种子培养液按照8重量％的接种量接入装有震荡发酵培养基的三角瓶中，在30℃下培养1天，转速为150rpm；其中震荡发酵培养基的组成为：蛋白胨7g/L、葡萄糖26g/L、酵母浸膏15g/L、磷酸二氢钾4g/L、硫酸镁4g/L、氯化钾1g/L，磷酸钠0.4g/L、氯化镁0.01/L、氯化钙0.05g/L、硫酸铜0.01g/L、钼酸钠0.005g/L、硼酸0.006g/L、硫酸锌0.006g/L、吐温80 0.5g/L，pH 7.0。
中期培养发酵：将震荡培养所得的培养液按照1:50的体积比例移入装有中期培养基的中期培养罐中进行培养发酵，在32℃下培养3天，转速120rpm，在中期培养发酵开始的第1天向中期培养基中加入燕麦β-葡聚糖和酵母发酵助剂。其中，中期培养基的组成为：蔗糖67.5g/L，酵母浸膏40g/L，生物素0.3g/L、硫酸铵15g/L、玉米浆干粉15g/L、干酪素17.5g/L、硫酸镁3.3g/L，磷酸二氢钾7.8g/L、谷胱甘肽5.6g/L和大豆卵磷脂2.1g/L。灵芝粗提液的制备方法为将灵芝粉碎为100微米左右的灵芝粉，按照料液质量比为1:20的比例将灵芝粉加入蒸馏水中，在75℃的水浴条件下搅拌，提取3小时，过滤并收集首次提取滤液，将滤渣按照相同条件重复提取一次获得第二次提取滤液，将首次提取滤液和第二次提取滤液合并，即得灵芝粗提液；每升培养基中灵芝粗提液的加入量为0.2L。酵母发酵助剂为
K(拉曼公司，加拿大魁北克)，用量为50g/L。燕麦β-葡聚糖的用量为5g/L。
主发酵：将中期培养发酵所得的培养液按照1∶100的体积比例移入装有主发酵培养基的主发酵罐内进行发酵15天，温度控制为25℃，并使用超声波辅助发酵；从开始进行主发酵时起计算，在第7天时开始向主发酵罐内添加***钠和硫酸锌溶液，在第10天时开始向主发酵罐内添加灵芝粉(100微米左右)、姜黄素、桑白皮粉、蚕丝蛋白粉、以及二裂酵母发酵产物溶胞物；其中主发酵培养基的组成为：柠檬酸4g/L、硫酸亚铁0.15g/L、硫酸锰0.42g/L、二氯化钴0.01g/L、硼酸0.02g/L、硫酸铜0.05g/L、硫酸二铵5g/L、硫酸镁8g/L、二氯化钙5g/L、菜籽油20g/L、酵母浸膏25g/L、以及16g/L的葡萄糖。添加的***钠和硫酸锌溶液中***钠的浓度为0.06g/L，硫酸锌溶液的浓度为0.03g/L，每升培养液中加入量为50mL。其中，灵芝粉的添加量为12g/L，姜黄素的添加量为0.1g/L，桑白皮粉的添加量为20g/L，蚕丝蛋白粉的添加量为40g/L，二裂酵母发酵产物溶胞物的添加量为2g/L。
提取制备酵母提取物：分离经主发酵的培养液中的菌体，分别收集滤液和菌体。将滤液负压浓缩至1/3体积得到滤液浓缩液A；将菌体用纯净水调成50质量％的浆液，加入0.6质量％的氯化钠，搅拌5小时除去酵母异味，并用离心机离心分离，除去上清液并收集菌体，其中离心速度为2000rpm；将菌体用纯净水稀释为50质量％的浆液后装入自溶灌，按5g/L添加氯化钠，在不断搅拌的条件下升温至45℃并保持恒温3小时以促进菌体自溶；然后用磷酸将浆液pH调节至5.5，添加复合水解酶进行酶解24小时，其中复合水解酶的组成及用量为：木瓜酶0.5g/L、胰酶0.05g/L、葡聚糖酶0.5g/L；灭酶，并以4000rpm的速度离心分离，取上清液，负压浓缩至1/4体积后与滤液浓缩液A合并，得到酵母发酵的灵芝提取液，将所得的酵母发酵的灵芝提取液的一半体积量留存，将其余一半体积量的酵母发酵的灵芝提取液喷雾干燥后得到粉状产品。
对比例1-3
对比例1按照与实施例1相同的条件进行，仅在主发酵阶段不添加***钠和硫酸锌溶液。
对比例2按照与实施例2相同的条件进行，仅在主发酵阶段不添加姜黄素、桑白皮粉、蚕丝蛋白粉。
对比例3按照与实施例3相同的条件进行，仅在主发酵阶段不添加二裂酵母发酵产物溶胞物。
实施例4
按照如下方法，测定本发明实施例1-3和对比例1-3的酵母发酵的灵芝提取液中氨基酸成分，灵芝三萜类化合物和灵芝多糖成分。
氨基酸成分测定方法：采用GB/T 5009.124—2016中的氨基酸测定方法测定酵母发酵的灵芝提取液中的17种游离氨基酸，取2.0mL冷藏样品，加入2.0mL质量浓度为6g/100mL的5-磺基水杨酸，反应1h后加入1mL、1g/100mL的EDTA-2Na溶液，充分混合，4800r/min离心10min。吸取2.0mL上述混合液，加入4.0mL pH2.2的柠檬酸缓冲液，混合均匀，离心，过滤后直接上机测定。外标法定量样品中的氨基酸组分，单位以mg/100mL表示。测试条件：分离柱Ion Exchange Column 2622sc.PH，(4.6mm×60mm)；柱温134℃；双通道紫外检测波长440nm和570nm；进样量20μL，时间148min。测试条件：分离柱Ion Exchange Column2622sc.PH，(4.6mm×60mm)；柱温134℃；双通道紫外检测波长440nm和570nm；进样量20μL，时间148min。结果如表1.1所示。
表1.1酵母发酵的灵芝提取液中氨基酸成分含量(g/100g干物质)
可以看出，实施例1-3的酵母发酵的灵芝提取液中各种氨基酸的成分含量明显高于对比例1-3。
灵芝三萜类化合物的测定方法可参考Feng等公开的方法(Feng,J.,et al.,Anunstructured kinetic model for the improvement of triterpenes production byGanoderma lucidum G0119 based on nitrogen source effect,Biotechnology andBioprocess Engineering,19(4),727–732,2014)，具体为将酵母发酵的灵芝提取液冷冻干燥获得粉状固体，取该粉状固体1g，用20mL浓度为50％(v/v)乙醇提取1周。离心后取上清液并在50℃下真空干燥。将残余物悬浮在水中，然后用氯仿萃取。氯仿提取物中的三萜进一步用5％(w/v)的NaHCO3提取。加入2mol/L HCl调节NaHCO3相的pH值低于3.0后，再次用氯仿萃取NaHCO3相中的三萜。在40℃下蒸发除去氯仿后，将三萜溶解在无水乙醇中，其水平用分光光度计在245nm处测定。
灵芝多糖含量采用苯酚-硫酸法进行测定，并以葡萄糖为标准品绘制标准曲线(0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6mg/mL)，具体为将酵母发酵的灵芝提取液冷冻干燥获得粉状固体，取该粉状固体1g于试管中，加入5％苯酚溶液1.0mL，摇匀，再沿壁加入浓硫酸溶液5.0mL，振摇6分钟，同时开盖放气，静止5分钟后，置沸水浴中加热10分钟，取出冷却至室温，用1cm比色皿在波长487nm处测定吸光度值，按照标准曲线计算其总多糖含量。
灵芝三萜类化合物和灵芝多糖的含量如表1.2所示，其中的含量为每克由酵母发酵的灵芝提取液通过冷冻干燥获得粉状固体中所含的相应物质的含量。
表1.2酵母发酵的灵芝提取液中灵芝三萜类化合物和灵芝多糖成分含量(mg/g)
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | |
| 灵芝三萜类化合物 | 56.64 | 73.75 | 62.9 | 31.27 | 22.76 | 28.62 |
| 灵芝多糖 | 108.54 | 133.62 | 129 | 24.48 | 35.59 | 30.14 |
可以看出，实施例1-3的酵母发酵的灵芝提取液中灵芝三萜类化合物和灵芝多糖的成分含量明显高于对比例1-3。
实施例5
按照下述方法制备含实施例1-3和对比例1-3的酵母发酵的灵芝提取液的化妆品并测试其安全性，具体为将酵母发酵的灵芝提取液制备为乳液，包括以下步骤：
(1)备料：酵母发酵的灵芝提取液5％、山梨坦倍半油酸酯0.8％、吐温-80 3％、角鲨烷4.0％、碳酸二辛酯5.0％、环五聚二甲基硅氧烷3.0％、植物仿生皮脂1.0％、辛酸/癸酸甘油三酯3.5％、乳木果油5.0％、泛醇0.5％、黄原胶0.35％、羟乙基纤维素0.7％、PEG-40氢化蓖麻油0.7％、维生素C 0.1％、维生素E 0.5％、EDTA-2Na 0.05％、1,3-丙二醇4.0％、羟苯甲酯0.2％、羟苯丙酯0.1％、甘油4.0％和香精0.06％，余量为水。
(2)将EDTA-2Na、泛醇、甘油、黄原胶、羟乙基纤维素(用1,3-丙二醇分散)和去离子水加入到水相锅中，加热至80℃，并不断搅拌至溶解，分散均匀；
(3)将羟苯甲酯、羟苯丙酯、角鲨烷、碳酸二辛酯、环五聚二甲基硅氧烷、植物仿生皮脂、乳木果油、油橄榄果油、辛酸/癸酸甘油三酯、山梨坦倍半油酸酯、吐温80加入油相锅并加热至80℃，充分搅拌至溶解；
(4)将油相锅中的物料加入到水相锅中，通过均质机进行乳化均质，速度为1000～6000rpm，时间为10分钟，冷却至40℃时加入酵母菌发酵溶胞产物浓缩滤并充分搅拌；
(5)继续冷却至30℃时加入香精，充分搅拌，冷却至室温。
(6)抽真空，出料，灌装，得到乳液。
安全性测试：选取普通志愿者组成受试人群，分6组；每组志愿者人数为10人，其中女性5名，男性5名，年龄均在20-40岁之间，测试受试者试用本发明的酵母发酵的灵芝提取液化妆品是否出现不良反应：在受试者左、右手臂内侧距离手掌基部6cm处，各确定4×4cm大小的面积作为实验部位。每组受试者分别涂抹按上述方法制备的乳液前，先将实验部位洗净，晾干后涂抹，涂抹于左臂内侧和右臂内侧。每天早晚各涂抹一次，连续测试1个月。实验结果如表2所示。
表2实施例1-3和对比例1-3的酵母发酵的灵芝提取液的安全性测试结果
| 酵母发酵的灵芝提取液 | 水肿 | 红斑 | 剥脱 | 刺激强度 |
| 实施例1 | 0 | 0 | 0 | 无刺激性 |
| 实施例2 | 0 | 0 | 0 | 无刺激性 |
| 实施例3 | 0 | 0 | 0 | 无刺激性 |
| 对比例1 | 0 | 1 | 1 | 轻微刺激性 |
| 对比例2 | 1 | 2 | 0 | 轻微刺激性 |
| 对比例3 | 2 | 0 | 1 | 轻微刺激性 |
表2的结果表明，本发明实施例1-3的酵母发酵的灵芝提取液产品安全性良好，特别是灵芝粉、姜黄素、桑白皮粉、蚕丝蛋白粉的添加消除了本发明产品的刺激性。
实施例6
取实施例5制备的乳液测试本发明酵母发酵的灵芝提取液的美白祛斑功效。
美白祛斑功效测试：随机抽取180名脸上有色斑的女性志愿者组成受试人群，其年龄均在20-40岁之间，身体健康无皮肤病和过敏史，非敏感皮肤，能够按照规范使用化妆品，并配合按要求完成评价工作。将180名受试者随机均分为6组，实验中，每组的受试者在脸部早晚各一次涂抹对应的实施例所制备的乳液，每次全脸3mL用量均匀涂抹，白天涂完后要涂上统一的防晒，连续使用28天，且所有受试者除了测试乳液和防晒霜之外不使用其他护肤用品。
实验开始前用Visia7皮肤检测仪测定脸部皮肤色斑，28天后在对相同部位进行测试。考虑到主视图左视图右视图的改变会有些许差异，采取平均差值百分比来表示，每组的最终差值百分比也是取平均值表示。实验结果如表3所示。
表3实施例1-3及对比例1-3的酵母发酵的灵芝提取液的美白祛斑功效测试结果
结果表明，相对于对比例1-3，实施例1-3的制得酵母菌发酵溶胞产物浓缩滤乳液具有较好的美白祛斑效果。
实施例7
将实施例1-3及对比例1-3的酵母发酵的灵芝提取液分别制备为面膜，测试其保湿效果。
面膜制备方法：按质量份计，取0.05份黄原胶、0.15份卡波姆、3份甘油、0.1份尿囊素、0.05份EDTA二钠、0.12份精氨酸、2份丁二醇、0.5份对羟基苯乙酮、0.5份1,2-己二醇、0.02份羧甲基脱乙酰壳多糖(羧甲基壳聚糖)(购自MHA Micro)、酵母发酵的灵芝提取液0.5份、0.1份生物糖胶-1(购自mibelle AG)、0.001份透明质酸钠(购自华熙福瑞达)、0.2份刺阿干树仁油，加水溶解，然后加入预先混合好的0.03份PEG-40氢化蓖麻油\PPG-26-丁醇聚醚-26、0.001份番石榴香精、0.001份红玫瑰香精，搅拌均匀即可。
保湿效果测试：选取60位年龄为18～35岁、皮肤肤色L值接近的志愿者，均分为6组，测定每组志愿者初始的皮肤水合度(取平均值)，再分别使用实施例1-3和对比例1-3中的酵母发酵的灵芝提取液制备的面膜，每天一次，持续4周，在第2周和第4周测试每组志愿者的皮肤水合度(取平均值)，评价植物源补水保湿面膜的保湿效果，测试结果如表4所示。
表4实施例1-3及对比例1-3的酵母发酵的灵芝提取液的保湿功效测试结果
| 酵母发酵的灵芝提取液 | 0周皮肤水合度 | 2周皮肤水合度 | 4周皮肤水合度 |
| 实施例1 | 46.2 | 63.7 | 77.1 |
| 实施例2 | 47.8 | 61.2 | 77.3 |
| 实施例3 | 45.6 | 63.5 | 78.2 |
| 对比例1 | 45.2 | 58.5 | 63.8 |
| 对比例2 | 48.5 | 58.1 | 64.1 |
| 对比例3 | 47.8 | 58.5 | 63.7 |
从结果中可以发现，在初始皮肤水合度接近的情况下，经过4周的测试，使用含实施例1-3的酵母发酵的灵芝提取液的面膜的使用者的皮肤水合度均明显高于对比例1-3的结果，二者之间存在显著差异，反映了使用本发明的酵母发酵的灵芝提取液具有良好的保湿效果。
实施例8
在体外测试实施例1-3及对比例1-3的酵母发酵的灵芝提取液对细胞损伤的修复作用。
将10μL密度为5×105个/mL的成纤维细胞接种在96孔板的孔中，在37℃，5％CO2恒温培养箱中培养，培养基为IMDM，加入20mM的谷氨酰胺，并含有10％胎牛血清，培养24小时。在新鲜培养基中同时加入1.6mM双氧水与2％的实施例1-3及对比例1-3的酵母发酵的灵芝提取液各10μL作为实验组，单独加入1.6mM双氧水作为阳性对照，未处理细胞作为阴性对照，各取10μL样品液及阳性和阴性对照液加入相应样品组和对照组孔板的培养液中，继续培养24h，然后每孔加入20μL MTT，培养4小时后，弃培养基，加入150μL DMSO，在酶标仪490nm波长下检测吸光度值。每组重复测试3遍，取平均值。细胞活力以百分数表示。
表5实施例1-3及对比例1-3的酵母发酵的灵芝提取液的细胞修复结果测试结果
从上述结果可以看出，相较于比较例1-3，实施例1-3的发酵溶胞产物浓缩滤液具有更强的修复受损细胞的作用。
显而易见的是，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种酵母发酵的灵芝提取物，其中包含经酵母发酵的灵芝成分和酵母提取物成分，所述酵母发酵的灵芝提取物为酵母发酵的灵芝提取液或所述提取液干燥后的粉状产品。
2.一种根据权利要求1所述的酵母发酵的灵芝提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌株活化：从低温保存管中取保存的酵母菌种，解冻获得菌液，取1-3滴菌液滴入固态活化培养基边缘，用划线法接种，置于20-30℃下培养2-3天后挑取一环接种于盛有葡萄糖液体培养基的三角瓶中，于25-28℃恒温震荡培养12-24小时，转速为100-200rpm，获得种子培养液；
(2)震荡培养：将步骤(1)所得到的种子培养液按照3-8重量％的接种量接入装有震荡发酵培养基的三角瓶中，在20-30℃下培养1-2天，转速为150-250rpm；
(3)中期培养发酵：将步骤(2)所得的培养液按照1∶10-50的体积比例移入装有中期培养基的中期培养罐中进行培养发酵，在28-32℃下培养3-5天，转速120-150rpm，在中期培养发酵开始的第1-2天向中期培养基中加入灵芝粗提液、燕麦β-葡聚糖和酵母发酵助剂；
(4)主发酵：将步骤(3)所得的培养液按照1∶50-100的体积比例移入装有主发酵培养基的主发酵罐内进行发酵7-15天，温度控制为20-25℃，并使用超声波辅助发酵；从开始进行主发酵时起计算，在第3-7天时开始向主发酵罐内添加***钠和硫酸锌溶液，在第5-10天时开始向主发酵罐内添加灵芝粉、姜黄素、桑白皮粉、蚕丝蛋白粉、以及二裂酵母发酵产物溶胞物；
(5)从步骤(4)所得的培养液制备所述酵母发酵的灵芝提取物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中步骤(1)中的所述酵母菌种选自鲁考弗美奇酵母、奇异酵母、维多利亚维希尼克氏酵母中的一种或多种，并且步骤(1)中的所述固态活化培养基的制备方法为：将酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂粉20g溶解于1升去离子水中，在121℃高温蒸气灭菌15分钟，冷却至50℃时加入0.1升200g/L的葡萄糖溶液。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其中步骤(2)中的震荡发酵培养基的组成为：蛋白胨7-15g/L、葡萄糖18-26g/L、酵母浸膏13-15g/L、磷酸二氢钾4-12g/L、硫酸镁4-12g/L、氯化钾1-2g/L，磷酸钠0.2-0.4g/L、氯化镁0.01-0.25/L、氯化钙0.05-0.2g/L、硫酸铜0.004-0.01g/L、钼酸钠0.005-0.008g/L、硼酸0.002-0.006g/L、硫酸锌0.004-0.006g/L、吐温800.3-0.5g/L，pH 7.0。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其中步骤(3)中的中期培养基的组成为：蔗糖62.5-67.5g/L，酵母浸膏35-40g/L，生物素0.3-0.6g/L、硫酸铵10-15g/L、玉米浆干粉10-15g/L、干酪素17.5-21.3g/L、硫酸镁3.3-6.2g/L，磷酸二氢钾4.2-7.8g/L、谷胱甘肽3.1-5.6g/L和大豆卵磷脂2.1-3.5g/L；并且所述酵母发酵助剂为
K；
步骤(3)中所述灵芝粗提液的制备方法为将灵芝粉碎为100微米左右的灵芝粉，按照料液质量比为1:20的比例将灵芝粉加入蒸馏水中，在75℃的水浴条件下搅拌，提取3小时，过滤并收集首次提取滤液，将滤渣按照相同条件重复提取一次获得第二次提取滤液，将首次提取滤液和第二次提取滤液合并，即得灵芝粗提液；每升培养基中灵芝粗提液的加入量为0.2L。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其中步骤(4)中的所述主发酵培养基的组成为：柠檬酸4-7g/L、硫酸亚铁0.02-0.15g/L、硫酸锰0.03-0.42g/L、二氯化钴0.01-0.25g/L、硼酸0.02-0.35g/L、硫酸铜0.05-0.5g/L、硫酸二铵3-5g/L、硫酸镁5-8g/L、二氯化钙5-7g/L、菜籽油15-20g/L、酵母浸膏15-25g/L、以及12-16g/L的葡萄糖；
步骤(4)中添加的所述***钠和硫酸锌溶液中***钠的浓度为0.06-0.1g/L，硫酸锌溶液的浓度为0.03-0.42g/L，每升培养液中加入量为50mL；
步骤(4)中灵芝粉为赤芝灵芝粉，其中所述灵芝粉为100微米左右，灵芝粉的添加量为12-18g/L，姜黄素的添加量为0.1-1.0g/L，桑白皮粉的添加量为12-20g/L，蚕丝蛋白粉的添加量为20-40g/L，二裂酵母发酵产物溶胞物的添加量为1-2g/L。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其中步骤(5)中所述制备酵母发酵的灵芝提取物的具体步骤为：
a)分离步骤(5)培养液中的菌体，分别收集滤液和菌体；
b)将滤液负压浓缩至1/5-1/3体积得到滤液浓缩液；
c)将菌体用纯净水调成20-50质量％的浆液，加入0.1-0.6质量％的食盐，搅拌3-5小时(优选为4小时)除去酵母异味，并用离心机离心分离，除去上清液并收集菌体；
d)将菌体用纯净水稀释为20-50质量％的浆液后装入自溶灌，按2-5g/L添加氯化钠，在不断搅拌的条件下升温至45-55℃并保持恒温1-3小时以促进菌体自溶；
e)然后用磷酸将浆液pH调节至4.5-5.5，添加复合水解酶进行酶解24-72小时，其中复合水解酶的组成及用量为：木瓜酶0.2-0.5g/L、胰酶0.02-0.05g/L、葡聚糖酶0.2-0.5g/L；
f)灭酶，并以4000rpm的速度离心分离，取上清液，负压浓缩至1/10-1/4体积后与步骤b)的滤液浓缩液合并，得到酵母发酵的灵芝提取液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中f)中得到的酵母发酵的灵芝提取液经过喷雾干燥后制备为粉状产品。
9.一种酵母提取物用于制备化妆品的用途，其中所述酵母提取物为根据权利要求1所述的酵母发酵的灵芝提取物或根据权利要求2-8中任一项所述的制备方法所得到的酵母发酵的灵芝提取物，所述化妆品为选自润肤乳、皮肤柔顺剂、爽肤水、收敛剂、润肤液、乳液、保湿润肤液、营养润肤液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华素、营养精华素、面膜、香皂、洗面奶、洁肤露、洁面霜、润肤露或身体乳中的任何一种。
10.一种化妆品，所述化妆品为选自润肤乳、皮肤柔顺剂、爽肤水、收敛剂、润肤液、乳液、保湿润肤液、营养润肤液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华素、营养精华素、面膜、香皂、洗面奶、洁肤露、洁面霜、润肤露或身体乳中的任何一种，其特征在于包含根据权利要求1所述的酵母发酵的灵芝提取物或根据权利要求2-8中任一项所述的制备方法所得到的酵母发酵的灵芝提取物。
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