CN114196593A - 一株高抗氧化活性植物乳杆菌p101及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高抗氧化活性植物乳杆菌P101及其应用，本发明植物乳杆菌P101分离自江西省吉安市农家自制酸菜，其16S rRNA序列如SEQ ID NO：1所示，保藏编号为CCTCC M 2021108。本发明植物乳杆菌P101具有良好的抑菌活性，能够显著抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等肠道致病菌的活性；具有较强的抗氧化活性，体外实验结果显示，植物乳杆菌P101对1,1二苯基‑2‑三硝基苯肼(DPPH)和羟基自由基的清除率均显著高于鼠李糖乳杆菌GG(LGG)，体内实验结果显示，植物乳杆菌P101能有效减弱酒精诱导的氧化应激损伤，并抑制机体炎症反应。本发明植物乳杆菌P101在酸性或高胆盐环境中存活率显著高于植物乳杆菌ZDY2013，此外，植物乳杆菌P101在缓解酒精诱导的脂肪性肝炎中效益突出。

Description

一株高抗氧化活性植物乳杆菌P101及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术及食品发酵领域，具体涉及一株高抗氧化活性植物乳杆菌P101及其应用。
背景技术
氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，当机体处于氧化应激状态时，体内积累的活性氧簇(ROS)会通过破坏生物分子引起自由基链反应，过量的自由基会降低机体抵抗力、降低细胞更新率、诱导氧化损伤、导致炎症和衰老等。氧化应激是许多疾病的主要诱发因素，如：心脑血管疾病、肝脏疾病和癌症。当机体氧化和抗氧化失衡时，自由基和丙二醛(MDA)含量增加，抗氧化酶活性下降，从而导致氧化损伤。
长期过量饮酒往往会导致一系列慢性非传染性的肝脏疾病，主要包括以下几个阶段：脂肪变性、脂肪性肝炎、酒精性肝纤维化和肝硬化，这些病理过程之间具有一定的重叠性，并非相互独立的。近年来，酒精性肝病的死亡率逐渐升高，已成为大部分国家最严重的健康问题之一，据2018年WHO全球酒精与健康状况报告，2016年全球约300万人因酒精摄入过量死亡(占所有死亡人数的5.3％)，其中6.07万人死于酒精引起的肝硬化。长期大量饮酒者，有90％以上会发生脂肪变性，其中10％～35％会发展为酒精性肝炎和肝纤维化，8％～20％发展为肝硬化。酒精进入人体后，一方面通过扰乱肠道菌群，使得肠道中革兰氏阴性菌比例增多；另一方面通过破坏肠屏障的完整性，增加肠道通透性，从而使更多的脂多糖通过门静脉循环到达肝脏。过量的脂多糖可以激活肝脏中的Kupffer细胞，产生ROS和炎症细胞因子，这是肝脏炎症和纤维化的开始。同时，酒精在肝脏中代谢产生的大量乙醛对肝细胞具有一定毒性，会引起肝细胞损伤。而酒精代谢也伴随着大量ROS的产生，降低肝脏中抗氧化酶的活性，造成氧化应激，导致肝细胞损伤，使得肝脏脂质过氧化和脂肪变性。
乳酸菌主要存在于营养丰富的环境中，包括乳制品、发酵的肉和鱼、酸面团、腌制蔬菜等发酵食品。乳酸菌也生存于人类和动物健康肠道和泌尿生殖道，是微生物区系的重要组成部分。乳酸菌具有强大的益生功能，主要表现为能够定植于肠道中从而起到免疫调节作用；抑制细菌过度生长从而维持肠道菌群的微生态平衡；抑制肠道炎症进而改善肠道屏障功能；提高机体抗氧化能力等。而乳酸菌显著的抗氧化活性主要通过清除自由基、螯合促氧化金属离子、产生抗氧化物质、调节相关酶的活性和调节肠道微生物区系来实现，从而缓解氧化损伤。多项研究表明，乳酸菌、双歧杆菌等益生菌具有优异的抗氧化能力，并能够降低机体内ROS积累的风险，能对氧化损伤发挥一定程度的缓解作用。因此，对于高抗氧化活性的乳酸菌筛选至关重要。
目前，研究已报道出多株具有抗氧化活性的植物乳杆菌，但普遍存在抑菌效果差或不耐受胃肠道的极端环境等缺点。其中，中国专利CN109182162A提供了一种高原植物乳杆菌，其具有一定的抗氧化活性，能够有效清除机体内自由基，但在肠液中的存活率较低，胃肠耐受性较弱；中国专利CN109182162A提供了一株抗氧化活性植物乳杆菌，其保藏编号为CGMCC15780，该植物乳杆菌羟基自由基清除率较低。中国专利CN111304117A提供了一株植物乳杆菌GL-5，该菌株只局限于对过氧化氢的耐受性研究。因此，开发研究一种对机体耐受性强且具有高抗氧化活性的植物乳杆菌具有重大意义和应用价值。此外，中国专利CN111437294A提供的植物乳杆菌KLDS1.0344和嗜酸乳杆菌KLDS1.0901联合治疗急、慢性酒精肝损伤，主要通过改善肠屏障、改善肝脏功能、降低肝脏中的炎症水平和增加肠道中短链脂肪酸含量实现。而本发明专利旨在找到一株高抗氧化活性且益生性能较好的植物乳杆菌，并能够缓解酒精诱导的肝脏氧化损伤。综上所述，本发明专利与其他专利公开文献存在本质差异。
发明内容
本发明提供了一株高抗氧化活性植物乳杆菌P101(Lactobacillus plantarumP101)及其应用，其具有良好的抑菌活性，酸耐受性、胆盐耐受性和较强的抗氧化活性，动物实验结果表明其能够有效缓解酒精性肝损伤。可用于制备具有调节肠道菌群和抗氧化效果的药品、保健品、微生态制剂以及解酒护肝的果蔬发酵饮品中。
本发明具体是通过如下技术方案实现的：
一株高抗氧化活性植物乳杆菌P101，保藏编号为CCTCC M 2021108，保藏地点为武汉市中国典型培养物保藏中心，所述植物乳杆菌P101的16S rRNA序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的另一个目的在于提供一株植物乳杆菌P101，其在制备抑制肠道致病菌药物中的应用。
进一步地，所述致病菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
本发明的另一个目的在于提供一株植物乳杆菌P101，其在制备调节肠道菌群保健品中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一株植物乳杆菌P101，其在制备免疫调节剂中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一株植物乳杆菌P101，其在制备抗氧化剂、抗氧化药物或抗氧化保健品中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一株植物乳杆菌P101，其在制备解酒护肝相关发酵食品和益生菌制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提供的植物乳杆菌P101具有较好的抑菌活性，能够显著抑制常见致病菌金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的活性；
2、本发明提供的植物乳杆菌P101具有良好的酸耐受性和胆盐耐受性，在pH＝3的酸性培养基中和含0.3％牛胆盐培养基中的存活率显著高于高耐酸植物乳杆菌ZDY2013(中国专利CN 105255752A)；
3、本发明提供的植物乳杆菌P101抗氧化活性显著高于鼠李糖乳杆菌GG(LGG)；
4、本发明提供的植物乳杆菌P101在缓解酒精性肝损伤中发挥显著效果，其效益显著强于已报道的植物乳杆菌C88。
附图说明
图1为植物乳杆菌P101菌落形态与革兰氏染色结果。
图2为不同菌株对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌效果，不同字母之间具有显著性。
图3为植物乳杆菌P101在pH＝3和0.3％牛胆盐MRS液体培养基中的存活率，其中A为植物乳杆菌P101在pH＝3的MRS液体培养基存活率，B为植物乳杆菌P101在0.3％牛胆盐MRS液体培养基中的存活率，不同字母之间具有显著性。
图4为植物乳杆菌P101体外抗氧化活性评价：A为1,1二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)清除率，B为羟基自由基清除率，不同字母之间具有显著性。
图5为植物乳杆菌P101缓解酒精诱导的小鼠肝脏毒性结果：A为谷丙转氨酶(ALT)活性，B为谷草转氨酶(AST)活性，C为碱性磷酸酶(AKP)活性，D为总甘油三脂(TG)含量，E为总胆固醇(TC)含量，不同字母之间具有显著性。
图6为植物乳杆菌P101缓解酒精诱导的小鼠肝脏氧化应激结果：A为肝脏中丙二醛(MDA)水平，B为肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)水平，不同字母之间具有显著性。
图7为植物乳杆菌P101缓解酒精诱导的小鼠炎症反应结果：A为血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，B为血清中白介素-1β(IL-1β)水平，C为血清中白介素-6(IL-6)水平，D为血清中白介素-10(IL-10)水平，不同字母之间具有显著性。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为市售常规产品。
实施例
1乳酸菌的分离与纯化
1.1乳酸菌的分离
从江西吉安地区农家自制的发酵蔬菜样品中取200μL发酵液于MRS液体培养基富集培养24h后，用无菌PBS将培养液按浓度梯度稀释，并吸取100μL均匀涂布到含1％碳酸钙的改良型MRS固体培养基上，每一浓度做两个重复。放置于37℃恒温培养箱内培养48h后观察菌落以及透明圈产生的情况，便于进一步分离纯化。
1.2纯化培养
使用接种环挑选边界清晰可见并有透明圈的单菌落，划线于MRS固体培养基中，将平板置于37℃厌氧培养箱中培养24-48h。连续划线3-5次后，取一滴现配的3％过氧化氢并滴于载玻片上，挑取固体培养基上单菌落接入3％过氧化氢液滴中并混匀，产生气泡为过氧化氢酶试验阳性，未产生气泡则为过氧化氢酶试验阴性，过氧化氢酶试验阴性菌株为疑似乳酸菌株。挑选出来的菌落采用划线法在MRS固体培养基上传代培养24-48h，以获得单克隆菌落。挑取上述单菌落进行液体培养20h，等量菌液与50％甘油充分混匀并保存于-80℃条件下。
1.3菌株活性筛选
取25％甘油中保存的菌液，按2％接种量接种到新鲜MRS液体培养基中并置于37℃恒温培养箱中培养10h作为种子菌液用于接下来的实验。种子菌液按2％的接种量接种到装有MRS液体培养基的离心管中，并置于37℃恒温培养箱中培养16h进行二代培养，挑选生长较好的菌株P101，保存于4℃备用。
2乳酸菌的鉴定
2.1革兰氏染色
挑选上述单克隆菌株进行革兰氏染色，具体步骤参照革兰氏染色试剂盒说明书，然后使用普通光学显微镜进行油镜观察，并拍照。
2.2菌株P101的16S rRNA的序列分析
获取新鲜的菌株P101培养液，使用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增：
上游引物为：27F AGAGTTTGATCTGGCTCAG
下游引物为：1492R GGTTACCTTGTTACGACTT
PCR扩增体系：
20μL反应总体系包含：Mix，10μL；Primers(10μM)：上游引物(Forward)，0.5μL，下游引物(Reverse)，0.5μL；DNA模板(菌株P101培养液)，2μL；ddH2O，10μL。
PCR反应条件：①95℃，5min；②95℃，30s；③56℃，30s；④72℃，1min；②-④循环35次；⑤72℃，10min。
1.5％琼脂糖凝胶电泳验证产物条带：1500bp处有目标条带，将产物送至上海生工进行序列分析。
测序结果表明菌株P101为植物乳杆菌，其16S rRNA序列如SEQ ID NO：1所示。
3抑菌性能测定
将已培养16h的乳酸菌培养液8000r/min离心10min，取上清备用。取100μL已活化指示菌，调整指示菌的浓度为1×108CFU/mL，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌前一天晚上按1％的接种量过夜培养12h，菌浓度调整到106CFU/mL后在相应的培养基上进行涂板，涂布后培养皿置于超净工作台半敞开10min，在固体培养基上摆放牛津杯并加入如上述1.3中保存的种子菌液上清液200μL，平稳放在37℃培养18h，观察测量每种菌液的抑菌圈直径，平行做三组实验。
抑菌实验结果表明，上述菌株对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌效果显著高于LGG。
4耐酸性能评价
乳酸菌菌株按2％的接种量接种到装有新鲜MRS液体培养基的离心管中并置于37℃恒温培养箱中培养16h，将已培养16h的乳酸菌培养液8000r/min离心10min，弃上清液，并加入等体积提前配制的酸性MRS液体培养基(pH＝3)混匀，此时记为0h，置于37℃恒温培养箱中培养2h后记为2h，分别取100μL0h和2h的菌液按10倍进行梯度稀释(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7)，取10-5，10-6，10-7的稀释菌液进行点板，于37℃恒温培养箱中培养24-48h后进行计数，每组实验做三个平行。
存活率＝2h(CFU/mL)/0h(CFU/mL)×100％
5耐胆盐性能评价
乳酸菌菌株按2％的接种量接种至装有新鲜MRS液体培养基的离心管中并置于37℃恒温培养箱中培养16h，将已培养16h的乳酸菌培养液8000r/min离心10min，弃上清液，并加入等体积提前配制的含0.3％牛胆盐的MRS液体培养基混匀，此时记为0h，置于37℃恒温培养箱中培养3h后记为3h，分别取100μL培养0h和3h的菌液按10倍进行梯度稀释(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7)，取10-5，10-6，10-7的稀释菌液进行点板，于37℃恒温培养箱中培养24-48h后进行计数，平行做3组实验。
存活率＝3h(CFU/mL)/0h(CFU/mL)×100％
耐酸和耐胆盐性能评价结果表明，上述菌株耐酸耐胆盐活性显著高于植物乳杆菌ZDY2013。
6 体外抗氧化性能评价
6.1 样品制备
将乳酸菌接种液按照4％的接种量接种于2mL的MRS液体培养基中，静置培养16h，获得菌株的培养液。8000r/min离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤两次并重悬菌体，调整菌体密度OD600 nm为0.6842±0.0642待用。
6.2 DPPH自由基清除率测定
取2mL待测乳酸菌的生理盐水悬浮液于10mL离心管中，加入2mL DPPH溶液(用无水乙醇溶解配制DPPH，终浓度为0.4mmol/L)，混合均匀后，置于室温下遮光反应30min，然后在转速8000r/min下离心10min，取200μL上清，测定样品在波长517nm处的吸光度，重复3次实验。
注：空白组样品以等体积无水乙醇样品代替DPPH-无水乙醇溶液，对照组样品以等体积蒸馏水代替样品溶液，并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液作空白调零。清除率按如下公式计算：其中A对照为对照组吸光度，A样品为样品组吸光度，A空白为空白对照。
DPPH自由基清除率＝1－(A样品－A空白)/A对照×100％
6.2羟基自由基清除率测定
取1mL邻菲啰呤(2.6mmol/L)，依次加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)和1mL蒸馏水充分混匀后加入1mL FeSO4溶液(2.5mmol/L)混匀；加1mL H2O2溶液(20mmol/L)，混合液中分别加入0.5mL待测样品；37℃水浴1.5h后于536nm处测定其吸光度，以PBS为对照，重复3次实验。
羟自由基清除率＝(As-Ap)/(Ab-Ap)×100％
式中：As为样品的吸光值；Ap为水浴后样品的吸光值，Ab为PBS的吸光值。
植物乳杆菌P101体外抗氧化结果显示，DPPH清除率和羟基自由基清除率显著高于LGG(如图4)。
7植物乳杆菌P101对小鼠酒精性肝损伤缓解作用研究
7.1动物实验
从湖南斯莱克景达实验动物有限公司购买24只C57BL/6雄性成年小鼠(8-10周)。适应性饲养一周后随机分成3个组(n＝8)，正常对照组(PBS)：对照液体饲料+PBS(200μL)；酒精模型组(EtOH)：酒***体饲料+PBS(200μL)；乳酸菌治疗组(EtOH&P101)：酒***体饲料+乳酸菌(108-9CFU/mL，200μL)；使用NIAAA法建立酒精肝模型，具体实施方法为，使用对照液体饲料进行5天的适应性喂养，从第6天起，正常对照组继续喂养对照液体饲料，而酒精模型组和乳酸菌治疗组喂养含5％的酒***体饲料，在第16天早上喂养酒***体饲料组进行一次酒精灌胃(5g/kg)，对照组采用等量的糊精代替，灌胃9h后将小鼠安乐死，摘眼球取血并保存肝脏样品于-80℃。
7.2血清中肝脏毒性指标分析
动物采集所得血液保存于普通灭菌离心管中，置于4℃条件保存过夜后，4，000r/min离心10min，取上清分装保存于干净的普通灭菌离心管中，于-80℃条件下冻存，从南京建成生物有限公司购买ALT、AST、AKP、TG、TC等肝功能指标测定试剂盒并按照生产商说明书进行分析。
血清中的ALT、AST和AKP水平常被用于评价肝脏功能的指标。如图5中A-C所示，与对照组相比，酒精暴露显著提高了小鼠血清中的ALT、AST和AKP活性，表明肝脏功能受损。而植物乳杆菌P101干预组与酒精模型组相比则出现显著的下降，表明植物乳杆菌P101能够有效地改善肝脏功能受损。此外，酒精模型组的TC和TG含量显著升高，表明肝脏发生了脂肪变性，而植物乳杆菌P101干预后TC和TG含量显著下降，表明植物乳杆菌P101能够改善肝脏脂质代谢，并减少肝脏中脂质的堆积。
7.3肝脏组织中氧化应激水平测定
取部分肝脏组织制成10％的肝脏组织匀浆并进行蛋白定量后于-80℃条件下冻存，采用SOD和MDA氧化应激指标测定试剂盒(南京建成)并按照生产商说明书进行操作。
酒精主要在肝脏中进行代谢，易引起肝脏的氧化应激，而肝脏中SOD和MDA的水平能够充分反映肝脏的抗氧化水平。如图6结果显示，酒精暴露后小鼠肝脏中MDA水平显著升高，SOD的水平显著下降，表明酒精能够诱导小鼠肝脏产生氧化应激反应，使得肝脏遭受损伤。在植物乳杆菌P101干预后肝脏中氧化应激减缓，肝脏受损程度也得到缓解，表明植物乳杆菌P101能通过发挥抗氧化作用来缓解酒精诱导的肝损伤。
7.4血清中炎症细胞因子含量测定
氧化应激能进一步触发炎症反应，进而导致更严重的肝脏损伤，血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和抑炎细胞因子IL-10使用酶联免疫试剂盒(上海研生生物)按照生产商说明书进行测定。
过量TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子的分泌会导致炎症反应，结果显示酒精摄入后，小鼠血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6与对照组相比显著增加。与酒精模型组相比，植物乳杆菌P101干预后血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6显著下降，表明植物乳杆菌P101能通过发挥抗炎作用来缓解酒精诱导的肝损伤。此外，抑炎因子IL-10的表达水平相比酒精模型组显著增加，同样证明植物乳杆菌P101具有较好的抗炎效果。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本申请进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本申请的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，其均应涵盖在本申请请求保护的技术方案范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 南昌大学
<120> 一株高抗氧化活性植物乳杆菌P101及其应用
<130> 2021.11.27
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1462
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
cagggggcgg tcttataatg cagtcgaacg actctggtat tgattggtgc ttgcatcatg 60
atttacattt gagtgagtgg cgaactggtg agtaacacgt gggaaacctg cccagaagcg 120
ggggataaca cctggaaaca gatgctaata ccgcataaca acttggaccg catggtccga 180
gtttgaaaga tggcttcggc tatcactttt ggatggtccc gcggcgtatt agctagatgg 240
tggggtaacg gctcaccatg gcaatgatac gtagccgacc tgagagggta atcggccaca 300
ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat 360
ggacgaaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaaact 420
ctgttgttaa agaagaacat atctgagagt aactgttcag gtattgacgg tatttaacca 480
gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc 540
cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt gaaagccttc 600
ggctcaaccg aagaagtgca tcggaaactg ggaaacttga gtgcagaaga ggacagtgga 660
actccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc 720
tgtctggtct gtaactgacg ctgaggctcg aaagtatggg tagcaaacag gattagatac 780
cctggtagtc cataccgtaa acgatgaatg ctaagtgttg gagggtttcc gcccttcagt 840
gctgcagcta acgcattaag cattccgcct ggggagtacg gccgcaaggc tgaaactcaa 900
aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agctacgcga 960
agaaccttac caggtcttga catactatgc aaatctaaga gattagacgt tcccttcggg 1020
gacatggata caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1080
tcccgcaacg agcgcaaccc ttattatcag ttgccagcat taagttgggc actctggtga 1140
gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1200
acctgggcta cacacgtgct acaatggatg gtacaacgag ttgcgaactc gcgagagtaa 1260
gctaatctct taaagccatt ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagt 1320
cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1380
acaccgcccg tcacaccatg agagtttgta acacccaaag tcggtggggt aacctttaga 1440
accagcgcta aacgggacaa gg 1462

Claims (7)

1.一株高抗氧化活性植物乳杆菌P101，保藏编号为CCTCC M 2021108，保藏地点为武汉市中国典型培养物保藏中心，其特征在于，所述植物乳杆菌P101的16S rRNA序列如SEQ IDNO：1所示。
2.如权利要求1所述的植物乳杆菌P101在制备用于抑制肠道致病菌的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的植物乳杆菌P101的应用，其特征在于，所述致病菌为金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。
4.如权利要求1所述的植物乳杆菌P101在制备用于调节肠道菌群保健品中的应用。
5.如权利要求1所述的植物乳杆菌P101在制备免疫调节剂中的应用。
6.如权利要求1所述的植物乳杆菌P101在制备抗氧剂或抗氧化保健品中的应用。
7.如权利要求1所述的植物乳杆菌P101在制备解酒护肝相关发酵食品和益生菌制剂中的应用。
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