CN112877231A

CN112877231A - 具有抑菌和抗氧化活性的乳酸菌及其应用

Info

Publication number: CN112877231A
Application number: CN201911206844.0A
Authority: CN
Inventors: 仇华吉; 李淼; 李永锋; 孙元
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2039-11-29
Also published as: CN112877231B

Abstract

本发明公开了具有抑菌和抗氧化活性的乳酸菌及其应用。为了获得安全、具有良好益生特性的菌株，本发明从中国大兴安岭地区的野猪粪便中分离乳酸菌，经16S rDNA鉴定和耐酸、耐胆盐试验初步筛选出了4株候选菌株；本发明进一步通过自凝集和共凝集试验、体外黏附试验、抑菌试验、清除自由基试验和安全性评价，分别检测了4株分离菌株的益生特性和安全性。检测结果表明，GKM5‑30菌株相比于其他的乳酸菌表现出更为优异的黏附能力、凝集能力、抑菌活性及抗氧化能力，具有良好的益生特性和安全性，具备进一步开发益生菌制剂的潜力。

Description

具有抑菌和抗氧化活性的乳酸菌及其应用

技术领域

本发明涉及益生菌，尤其涉及从大兴安岭地区的野猪粪便中分离得到的具有抑菌和抗氧化活性的乳酸菌，本发明进一步涉及该乳酸菌在制备提高动物抗病或抗氧化活性的饲料添加剂或益生菌制剂中的应用，属于益生菌的分离和应用领域。

背景技术

当前，抗生素作为饲料添加剂广泛用于促进动物生长及疾病预防，而动物相关产品及制品中抗生素残留以及细菌耐药性问题日趋严峻并亟需解决。因此，抗生素替代品的开发备受关注。益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，不存在耐药性或残留的问题。在众多的益生菌产品中，最为常见的是乳酸菌，它能够利用碳水化合物发酵产生乳酸，是人体和哺乳动物肠道微生物的主要组成部分，对宿主的健康有着重要的促进作用，食品药品监察局将其评定为食品安全级的菌株(Tan EW,Tan KY,Phang LV,et al.Enhancedgastrointestinal survivability of recombinant Lactococcus lactis using adouble coated mucoadhesive film approach[J].PLoS One,2019,14(7):e0219912.)。

乳酸菌具有广泛的益生作用，例如改善消化功能，增强机体免疫水平，缓解炎症性肠病和便秘，增强黏膜屏障作用等。益生菌在改善肠道功能和提高动物生产性能等方面发挥着重要作用。乳酸菌作为最为常见的益生菌，可以通过平衡肠道菌群维持宿主的肠道健康，甚至治疗人类和动物的肠道疾病(Nami Y,Haghshenas B,Haghshenas M,etal.Antimicrobial activity and the presence of virulence factors andbacteriocin structural genes in Enterococcus faecium CM33 isolated from ewecolostrum[J].Front Microbiol,2015,6:782.)。同时，研究证实，益生菌作为饲料添加剂对不同生长期猪都能产生积极作用，比如改善动物健康和性能(Wang W and GanzleM.Toward rational selection criteria for selection of probiotics in pigs[J].Adv Appl Microbiol,2019,107:83-112.)。

大兴安岭地区位于黑龙江省西北部、内蒙古自治区东北部、大兴安岭山脉东北坡，是中国最北端的地级行政区，土地面积占全省51.8％，地广人稀，是黑龙江野生动物的主要活动基地。大兴安岭地区野猪资源丰富，人迹罕至，人为污染较少，有望分离出天然、具备优良特性的益生菌株。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株具有抑菌和抗氧化活性的乳酸菌；

本发明的目的之二是将所述的具有抑菌和抗氧化活性的乳酸菌制备成益生菌制剂或饲料添加剂应用于提高动物对致病菌的抗病能力或抗氧化能力。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

为了获得安全的、具有良好益生特性的菌株，本发明从中国大兴安岭地区的野猪粪便中分离乳酸菌，经16S rDNA鉴定和耐酸、耐胆盐试验初步筛选出了4株候选菌株，分别为蒙氏肠球菌(GKM5-6)、耐久肠球菌(GKM5-23)、黏膜乳杆菌(GKM6-26)和黏膜乳杆菌(GKM5-30)。

为了获得具有优良益生特性的乳酸菌株，必须对其基本功能特性和安全性进行评价。因为胃中的酸性条件和十二指肠的胆盐是益生菌在胃肠道生存的最大障碍，所以在胃肠道定植的首要条件是拥有对低pH值和胆盐的抵抗力。不同菌株在酸性和胆盐条件下的存活率不同，可能是由于其对酸性和胆盐的耐受性机制不同所致；黏附能使乳酸菌在肠道中存活时间延长，有效地定植于肠上皮细胞表面，发挥其益生作用，因此黏附能力也是评价益生菌的一个非常重要的指标。益生菌的自凝集和共凝集能力在防止病原体表面定植方面发挥着重要作用。研究表明，聚集的益生菌能够形成覆盖肠道黏膜表面的物理屏障，防止病原体的定植，而益生菌与致病菌结合是宿主抵御感染的重要防御机制。

本发明通过自凝集和共凝集试验、体外黏附试验、抑菌试验、清除自由基试验和安全性评价，分别检测了4株分离菌株的益生特性和安全性。

本发明所分离的4株乳酸菌均显示出良好的耐受性，在酸性和含胆盐的MRS培养基中存活率均能达到50％以上，其中GKM5-30菌株具备最为优良的耐酸、耐胆盐特性，在pH3.0时存活率高达74.87％，胆盐浓度0.3％时存活率达80.23％。

本发明对分离的乳酸菌进行自凝集能力检测，结果发现GKM5-30在静置24h后凝集率达到了76.45％，明显高于其他菌株；共凝集能力检测结果显示，分离的乳酸菌菌株能凝集致病性埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌3种致病菌，其中GKM5-30凝集埃希氏大肠杆菌能力最强，可达80.91％，对金黄色葡萄球菌的凝集率为64.75％，对鼠伤寒沙门氏菌的凝集率为77.76％。

黏附试验结果显示，所分离的4株乳酸菌菌株对Caco-2细胞的黏附率均达到50％以上，其中，GKM5-30菌株黏附率最高，可达72.49％，显著高于参考菌株ATCC 4356(p<0.05)。

乳酸菌体外抑菌试验结果显示，所分离的4株乳酸菌菌株中，GKM5-30和GKM6-26对3株致病菌均具有抑制作用，其中GKM5-30抑制金黄色葡萄球菌能力最强，抑菌环直径为15.86±0.28mm；对致病性埃希氏大肠杆菌抑制作用较强，抑菌环直径为14.65±0.31mm；而对鼠伤寒沙门氏菌的抑制作用相对较弱，抑菌环直径为14.05±0.38mm。

利用体外试验测定黏膜乳杆菌的抗氧化能力，结果显示，GKM5-30对自由基OH˙和DPPH˙的清除率均显著高于参考菌株(P<0.01)，表明GKM5-30菌株具有良好的抗氧化能力。

经安全性评估，4株分离的乳酸菌菌株无溶血性，未检测到毒力基因。

综合上述检测结果可见，GKM5-30菌株相比于其他的乳酸菌表现出更为优异的黏附能力、凝集能力、抑菌活性及抗氧化能力，具有良好的益生特性和安全性，具备进一步开发益生菌制剂的潜力。本发明将所分离的黏膜乳杆菌GKM5-30菌株提交到中国普通微生物菌种保藏管理中心进行保藏，其保藏信息如下：

保藏编号：CGMCC No.18411；

分类命名：黏膜乳杆菌Lactobacillus mucosae；

保藏时间：2019年8月22日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。

益生菌的抗菌活性和抗氧化活性是两种完全不同机制作用后产生的效果，现有的所分离获得乳酸菌大多不具有显著的抗氧化活性。本发明所分离的黏膜乳杆菌GKM5-30菌株不仅具有优异的抑菌能力，还具有极强的抗氧化活性。

益生菌对肠道及食物中的致病菌具有拮抗作用，它们能阻碍特定肠道致病菌的黏附、定居、繁殖以及致病作用，其作用机理包括如下：

1、产生有益的代谢产物，抑制或杀死致病菌

有些益生菌会产生有益的代谢产物，如有机酸、过氧化氢及细菌素等，形成抑制或杀死有害菌的环境。有机酸通过降低肠道pH值从而抑制致病菌；过氧化氢的杀菌作用主要归功于它对细菌细胞的强氧化作用，细胞蛋白质和细胞膜脂的巯基均可被氧化；细菌素通过吸附到与产生菌相同或相近的目标细胞的受体上，使其生长受到拮抗。

2、营养物质竞争，使致病菌缺乏生长所需的某种营养

肠道固有菌群通过与外来致病菌群进行营养物质的竞争，从而抑制致病菌的生长。在正常环境中肠道益生菌群竞争作用引起的抑菌效应较小，但当生物素等出现作为致病菌的限制因素时，这种抑菌作用显著增强。

3、附着位点竞争，抑制致病菌的感染

人体的肠道中存在大量细菌，定殖于肠道黏膜表面，与肠道黏膜细胞共同构成生物屏障，保护宿主抵御外来微生物的侵袭。人体内微生物与致病菌竞争肠道上皮的吸附位点，这些吸附位点被较多益生菌占据，病原微生物就会受到抑制。

益生菌可以通过对金属离子的螯合能力、抗氧化***、调节信号通路等方面发挥其抗氧化作用，其作用机制如下：

1、益生菌的金属离子螯合能力

益生菌通过螯合Fe²⁺或Cu²⁺等金属离子而具备高抗氧化能力。益生菌的离子螯合能力通过过氧化物的分解来抑制酶催化的磷酸酯置换反应并产生过氧基和烷氧基。因此，这些益生菌的螯合能力可能是由于生物螯合剂存在于益生菌的细胞提取物中。

2、益生菌的抗氧化酶体系

益生菌也有自己的抗氧化酶***，这些酶中最著名的一种是超氧化物歧化酶(SOD)。超氧化物是由线粒体产生的最丰富的活性氧簇(ROS)之一，而SOD催化超氧化物分解成过氧化氢和水发挥抗氧化作用；过氧化氢酶(CAT)通过分解过氧化氢参与细胞抗氧化防御，从而阻止羟基自由基的产生；此外，益生菌还可以刺激宿主的抗氧化***，有效提升抗氧化酶的活性。

3、益生菌的抗氧化代谢物

益生菌可以产生具有抗氧化活性的各种代谢物，如谷胱甘肽(GSH)，丁酸盐和叶酸，发挥抗氧化作用。

4、益生菌介导的抗氧化信号通路

益生菌介导Nrf2-Keap1-ARE、PKC偶联途径及MAPK等信号通路，发挥抗氧化能力。

由此，本发明进一步提供了将分离的黏膜乳杆菌GKM5-30菌株制备成益生菌制剂或饲料添加剂应用于提高动物对致病菌的抗病性或提高动物的抗氧化能力，其中，所述的致病菌包括金黄色葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。

譬如，可以采用益生菌制剂的常规制备方法将黏膜乳杆菌GKM5-30制备成各种常规的益生菌制剂，这些益生菌制剂能够提高动物对于包括金黄色葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌在内的致病菌所导致的各种疾病的抵抗力或提高动物的抗氧化能力；也可以将将黏膜乳杆菌GKM5-30制备成饲料添加剂添加到动物的日粮中，提高动物对于包括金黄色葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌在内的致病菌所导致的各种疾病的抵抗力或提高动物的抗氧化能力。

本发明整体技术方案详述

本发明从大兴安岭采集野猪粪便，收集编号后置于4℃保温箱迅速运回实验室。每管粪便样本中加入约5倍体积的MRS培养基，充分振荡混匀，分别取1mL转接至8mL MRS培养基中，于37℃温箱培养24h，分别取微量过夜培养的菌液，在MRS固体培养基上进行划线，置于37℃温箱中培养24h。挑取特征明显的菌落反复划线分离，直至分离出形态、大小一致的菌落，进行革兰氏染色。对菌体形态进行显微观察，确定为单一的革兰氏阳性菌后，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株的基因组DNA。利用细菌16S rDNA通用引物进行扩增，扩增片段测序后，使用BLAST与GenBank数据库中序列进行对比分析。

将分离的乳酸菌在酸性(pH 3.0)和胆盐(0.3％)条件下评价其耐受性，将过夜培养的菌液接种于5mL pH 3.0的MRS和含0.3％胆盐的MRS培养基中，37℃孵育4h，测定其OD_600nm值，筛选出具有良好耐酸、耐胆盐特性的菌株用于后续试验。

从野猪粪便样品中分离的细菌通过MRS固体培养基反复纯化后，经革兰氏染色证明分离的菌株均为革兰氏阳性菌。耐酸、耐胆盐试验结果显示，有4株乳酸菌显示出良好的耐受性，在酸性和含胆盐的MRS培养基中存活率均能达到50％以上，其中GKM5-30菌株具备最为优良的耐酸、耐胆盐特性，在pH 3.0时存活率高达74.87％，胆盐浓度0.3％时存活率达80.23％。经16S rDNA鉴定，此4株乳酸菌分别为蒙氏肠球菌(GKM5-6)、耐久肠球菌(GKM5-23)和黏膜乳杆菌(GKM6-26和GKM5-30)。

本发明对分离的4株乳酸菌进行自凝集能力检测，检测结果发现，随着时间的推移，4株乳酸菌的自凝集率稳步上升，其中GKM5-30在静置24h后自凝集率达到了76.45％，明显高于其他菌株。

本发明对分离的4株乳酸菌的共凝集能力检测结果显示，分离的乳酸菌菌株能凝集致病性埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌3种致病菌。其中GKM5-30凝集埃希氏大肠杆菌能力最强，可达80.91％，对金黄色葡萄球菌的凝集率为64.75％，对鼠伤寒沙门氏菌的凝集率为77.76％。

本发明所分离的4株乳酸菌对Caco-2细胞的黏附能力测定试验结果显示，4株乳酸菌菌株对Caco-2细胞的黏附率均达到50％以上，其中GKM5-30菌株黏附率最高，可达72.49％，显著高于参考菌株ATCC 4356(p<0.05)，结果表明乳酸菌菌株GKM5-30具有较强的黏附能力。

本发明所分离的4株乳酸菌体外抑菌试验结果显示，分离的4株乳酸菌菌株中，GKM5-30和GKM6-26对3株致病菌均具有抑制作用，其中GKM5-30抑制金黄色葡萄球菌能力最强，抑菌环直径为15.86±0.28mm；对致病性埃希氏大肠杆菌抑制作用较强，抑菌环直径为14.65±0.31mm；而对鼠伤寒沙门氏菌的抑制作用相对较弱，抑菌环直径为14.05±0.38mm。

本发明利用体外试验测定了所分离的黏膜乳杆菌GKM5-30的抗氧化能力，结果显示，GKM5-30对自由基OH˙和DPPH˙的清除率均显著高于参考菌株(P<0.01)，表明GKM5-30菌株具有良好的抗氧化能力。

本发明以分离到的乳酸菌DNA为模板，使用多对毒力因子相应引物进行PCR扩增，均未检测到毒力因子，乳酸菌菌株划线的血平板上无溶血环出现，表明其无溶血性，以上检测结果表明，本发明所分离的乳酸菌安全性良好。

附图说明

图1乳酸菌自凝集能力及其与致病菌的共凝集能力；A：乳酸菌自凝集能力；B-D：乳酸菌与致病性埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及鼠伤寒沙门氏菌共凝集能力。

图2乳酸菌黏附能力试验结果。

图3乳酸菌抗氧化能力试验结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验例1乳酸菌的分离、鉴定及性能测定试验

1材料与方法

1.1主要实验材料

标准致病菌株主要用于抑菌试验和共凝集试验，包括致病性埃希氏大肠杆菌(BNCC 337304)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538P)及鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)。模式菌株嗜酸乳杆菌(ATCC 4356)用于试验对照。结肠腺癌细胞Caco-2(BNCC 338148)用含20％血清的MEM培养基在37℃5％CO₂条件下培养，用于乳酸菌黏附试验，以上菌株及细胞均由本实验室保存。

MRS培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)购自哈尔滨宝士德生物科技有限公司。MEM培养基、胎牛血清(FBS)及0.25％胰酶购自Gibco公司。

1.2乳酸菌的分离与鉴定

从大兴安岭采集野猪粪便，收集于50mL无菌离心管，编号后置于4℃保温箱迅速运回实验室。每管粪便样本中加入约5倍体积的MRS培养基，充分振荡混匀，分别取1mL转接至8mL MRS培养基中，于37℃温箱培养24h，分别取微量过夜培养的菌液，在MRS固体培养基上进行划线，置于37℃温箱中培养24h。挑取特征明显的菌落反复划线分离，直至分离出形态、大小一致的菌落，进行革兰氏染色。对菌体形态进行显微观察，确定为单一的革兰氏阳性菌后，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株的基因组DNA。利用细菌16S rDNA通用引物进行扩增(表1)，PCR反应程序为：95℃5min；95℃45s，50℃1min，72℃90s，共10个循环；95℃45s，58℃1min和72℃90s，共15个循环；95℃45s，55℃1min和72℃90s，共10个循环；72℃延伸10min。扩增片段测序后，使用BLAST与GenBank数据库中序列进行对比分析。

将分离的乳酸菌在酸性(pH 3.0)和胆盐(0.3％)条件下评价其耐受性(DowarahR,Verma AK,Agarwal N,et al.Selection and characterization of probiotic lacticacid bacteria and its impact on growth,nutrient digestibility,health andantioxidant status in weaned piglets[J].PLoS One,2018,13(3):e0192978.)，将过夜培养的菌液接种于5mL pH 3.0的MRS和含0.3％胆盐的MRS培养基中，37℃孵育4h，测定其OD_600nm值，筛选出具有良好耐酸、耐胆盐特性的菌株用于后续试验。

1.3乳酸菌的自凝集能力测定

按照Collado等(Collado MC,Surono I,Meriluoto J,et al.Indigenous dadihlactic acid bacteria:cell-surface properties and interactions with pathogens[J].J Food Sci,2007,72(3):M89-93.)文献中的方法稍作改进后进行乳酸菌的自凝集能力检测：将分离的乳酸菌转接于5mL MRS培养基中，37℃温箱中静置培养18h。以5,000×g离心10min收集菌体，PBS洗涤2次后将其重悬于2mL PBS中，调节OD_600nm为0.25±0.05，室温条件下静置，在不同时间点(0、2、4、6、10和24h)分别取100μL上层悬液测定其OD_600nm。乳酸菌的自凝集率A_A(％)计算公式如下：A_A(％)＝[(A₀-A_t)/A₀]×100。其中，A₀是0h测定的乳酸菌悬液OD_600nm值；A_t是静置后不同时间点测定的OD_600nm值。

1.4乳酸菌与致病菌的共凝集能力测定

对乳酸菌进行共凝集能力检测，方法(Maria Carmen Collado,Jussi Meriluoto,Seppo Salminen.Adhesion and aggregation properties of probiotic and pathogenstrains[J].Eur Food Res Technol,2008,226:1065–1073.)如下：取乳酸菌悬液2mL(OD_600nm＝0.25±0.05)分别与3株标准致病菌株等体积混合，室温静置，在不同时间点(0、2、4、6、10和24h)分别取100μL上层悬液测定其OD_600nm。根据如下公式计算乳酸菌与致病菌的共凝集率A_C(％)：A_C(％)＝[(Apro+Apat)-Amix]/(Apro+Apat)×100。其中，Apro+Apat代表0h混合悬液的OD_600nm值；Amix是不同时间点测定的OD_600nm值。

1.5乳酸菌的黏附能力测定

将Caco-2细胞接种于24孔板，待其贴壁生长至80％～90％时进行黏附试验。将过夜培养的乳酸菌以5,000×g离心10min收集菌体，PBS洗涤2次，将其以10⁸CFU/mL重悬于PBS(含100μg/mL FITC)中，37℃避光孵育1h将细菌着色，随后PBS洗涤3次除去未结合的FITC，重悬于PBS中。用PBS将Caco-2细胞洗涤3次，每孔加入500μL FITC标记的菌悬液，使用多功能酶标仪测定其初始荧光强度(吸收光波长为485nm，发射光波长为530nm)，将24孔板置于37℃、5％CO₂的培养箱中孵育1h。PBS洗涤24孔板3次，去除未黏附的乳酸菌，加入100μL0.25％的胰酶作用10min后，再加入400μL含20％FBS的MEM培养基终止反应，使用酶标仪测定其荧光强度。按照如下公式计算：黏附率(％)＝C/C₀×100。其中，C₀代表乳酸菌黏附前的荧光强度，C代表乳酸菌黏附后的荧光强度。

1.6乳酸菌的抑菌能力测定

按照Rahmeh等的文献(Rahmeh R,Akbar A,Kishk M,et al.Distribution andantimicrobial activity of lactic acid bacteria from raw camel milk[J].NewMicrobes New Infect,2019,30:100560.)报道进行乳酸菌的抑菌能力测定。先将灭菌的牛津杯平放在底层MRS固体培养基上，将指示菌按1％接种于45-50℃的MRS固体培养基中，混匀后倒入放置好牛津杯的培养皿中，待其凝固后取出牛津杯，在杯孔中加入过夜培养的待测乳酸菌培养液，每孔100μL，37℃温箱培养24h后，使用游标卡尺测量抑菌环大小。

1.7乳酸菌的抗氧化能力测定

1.7.1乳酸菌清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)能力的测定

按如下方法(Sharma K,Attri S,Goe G.Selection and evaluation ofprobiotic and functional characteristics of autochthonous lactic acidbacteria isolated from fermented wheat flour dough babroo.ProbioticsAntimicrob Proteins,2019,11(3):774-784.)测定乳酸菌对DPPH˙的清除能力：将过夜培养的乳酸菌以5,000×g离心10min收集菌体，PBS洗涤2次，调节OD_600nm＝1.00±0.05，取2mL待测悬浮液，加入2mL终浓度为0.4mmol/L的DPPH˙溶液，混合均匀，室温遮光反应30min，8,000×g离心10min，取上清，在波长517nm处测定样品的吸光度。对照组以等体积无水乙醇代替样品溶液，并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零。清除率按如下公式计算：清除率％＝(1-Asam/Acon)×100。其中，Asam代表乳酸菌样品的吸光度值，Acon代表对照组的吸光度值。

1.7.2乳酸菌清除羟自由基(OH˙)能力的测定

利用Fenton反应体系(Han K,Cao J,Wang J,et al.Effects of Lactobacillushelveticus fermentation on the Ca²⁺release and antioxidative properties ofsheep bone hydrolysate[J].Korean J Food Sci Anim Resour,2018,38(6):1144-1154.)测定菌液的OH˙清除能力，具体操作如下：1mL亮绿(0.435mmol/L)，2mL硫酸亚铁(0.5mmol/L)，1.5mL H₂O₂(3.0％)，1mL乳酸菌悬液，将上述物质混匀后于37℃水浴30min，8,000×g离心10min，取上清，于波长624nm处测吸光度，空白以蒸馏水代替试样。OH˙清除率按照如下公式计算：清除率％＝[(As-A₀)]/[(A-A₀)]×100。As代表乳酸菌样品的吸光值，A₀代表蒸馏水代替乳酸菌样品的吸光值，A代表仅含有亮绿的吸光值。

1.8乳酸菌的安全性评价

将过夜培养的乳酸菌菌株在血平板上划线，37℃孵育18-24h，观察细菌菌落周围是否形成溶菌环。使用表1中的引物进行PCR扩增，检测是否存在毒力因子的编码基因，对乳酸菌菌株进行安全性评价。

1.9统计学分析

采用SPSS 22统计软件分析试验数据，p<0.05表示差异显著，所有试验设置3个重复，数值以平均数±标准差表示。

表1PCR扩增引物

2试验结果

2.1乳酸菌分离株的分类

从野猪粪便样品中分离的细菌通过MRS固体培养基反复纯化后，经革兰氏染色证明分离的菌株均为革兰氏阳性菌(结果未显示)。耐酸、耐胆盐试验结果显示，有4株乳酸菌显示出良好的耐受性，在酸性和含胆盐的MRS培养基中存活率均能达到50％以上，其中GKM5-30菌株具备最为优良的耐酸、耐胆盐特性，在pH 3.0时存活率高达74.87％，胆盐浓度0.3％时存活率达80.23％。经16S rDNA鉴定，此4株乳酸菌分别为蒙氏肠球菌(GKM5-6)、耐久肠球菌(GKM5-23)和黏膜乳杆菌(GKM6-26和GKM5-30)(表2)。

表2乳酸菌的种属鉴定及耐酸、耐胆盐特性

2.2乳酸菌的自凝集能力及与致病菌的共凝集能力

对分离的乳酸菌进行自凝集能力检测，结果如图1所示，随着时间的推移，4株乳酸菌的自凝集率稳步上升，其中GKM5-30在静置24h后自凝集率达到了76.45％，明显高于其他菌株(图1A)。

共凝集能力检测结果显示，分离的乳酸菌菌株能凝集致病性埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌3种致病菌。其中GKM5-30凝集埃希氏大肠杆菌能力最强，可达80.91％(图1B)，对金黄色葡萄球菌的凝集率为64.75％(图1C)，对鼠伤寒沙门氏菌的凝集率为77.76％(图1D)。

2.3乳酸菌对Caco-2细胞的黏附能力

黏附试验结果显示，4株乳酸菌菌株对Caco-2细胞的黏附率均达到50％以上，其中GKM5-30菌株黏附率最高，可达72.49％，显著高于参考菌株ATCC 4356(p<0.05)(图2)，结果表明乳酸菌菌株GKM5-30具有较强的黏附能力。

2.4乳酸菌的抑菌能力

乳酸菌体外抑菌试验结果显示，分离的4株乳酸菌菌株中，GKM5-30和GKM6-26对3株致病菌均具有抑制作用，其中GKM5-30抑制金黄色葡萄球菌能力最强，抑菌环直径为15.86±0.28mm；对致病性埃希氏大肠杆菌抑制作用较强，抑菌环直径为14.65±0.31mm；而对鼠伤寒沙门氏菌的抑制作用相对较弱，抑菌环直径为14.05±0.38mm(表3)。

表3乳酸菌对致病菌的抑制能力

注：—表示乳酸菌菌株对致病菌未产生抑制作用。

2.5乳酸菌的抗氧化能力

利用体外试验测定乳酸菌的抗氧化能力，结果显示，GKM5-30对自由基OH˙和DPPH˙的清除率均显著高于参照菌株(P<0.01)，表明GKM5-30菌株具有良好的抗氧化能力。

2.6乳酸菌的安全性

在本试验中以分离到的乳酸菌DNA为模板，使用多对毒力因子相应引物进行PCR扩增，均未检测到毒力因子基因(结果未显示)，乳酸菌菌株划线的血平板上无溶血环出现，表明其无溶血性(结果未显示)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）

<120> 具有抑菌和抗氧化能力的乳酸菌及其应用

<130> HLJ-2001-190823A

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

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ttcttccgat tgacgcaaaa 20

Claims

1.一株分离的黏膜乳杆菌GKM5-30，其特征在于，其微生物保藏编号是CGMCCNo.18411。

2.权利要求1所述的黏膜乳杆菌GKM5-30在制备提高动物对于致病菌所引起疾病的抵抗力的药物或饲料添加剂中的用途。

3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的致病菌包括金黄色葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。

4.权利要求1所述的黏膜乳杆菌GKM5-30在制备提高动物抗氧化能力的药物或饲料添加剂中的用途。

5.一种提高动物对于致病菌导致疾病抵抗力的饲料添加剂，其特征在于，含有权利要求1所述的黏膜乳杆菌GKM5-30。

6.按照权利要求5所述的饲料添加剂，其特征在于，所述的致病菌包括金黄色葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。

7.一种提高动物对于致病菌导致疾病抵抗力的益生菌制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的黏膜乳杆菌GKM5-30。

8.按照权利要求7所述的益生菌制剂，其特征在于，所述的致病菌包括金黄色葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。

9.一种提高动物抗氧化能力的饲料添加剂，其特征在于，含有权利要求1所述的黏膜乳杆菌GKM5-30。

10.一种提高动物抗氧化能力的益生菌制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的黏膜乳杆菌GKM5-30。