CN110330551B - 一种胰腺癌特异结合肽及其制备方法与用途 - Google Patents

一种胰腺癌特异结合肽及其制备方法与用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110330551B
CN110330551B CN201910719775.7A CN201910719775A CN110330551B CN 110330551 B CN110330551 B CN 110330551B CN 201910719775 A CN201910719775 A CN 201910719775A CN 110330551 B CN110330551 B CN 110330551B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fitc
pancreatic cancer
peptide
cells
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910719775.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110330551A (zh
Inventor
魏敏杰
马赫遥
范悦
刘芳晓
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Medical University
Original Assignee
China Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Medical University filed Critical China Medical University
Priority to CN201910719775.7A priority Critical patent/CN110330551B/zh
Publication of CN110330551A publication Critical patent/CN110330551A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110330551B publication Critical patent/CN110330551B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种胰腺癌特异结合肽及其制备方法与用途，所述多肽如以下通式所示：X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10YX11；本发明还涉及了该多肽、其形成的二价体或多价体及其作为靶向多肽与能杀伤癌细胞的制剂和显像制剂形成的药物组合物及其用途，本发明所述多肽能对具有胰腺癌细胞特异性靶向作用，选择性强，且本发明涉及的肽可以采用化学合成的方法制备得到，其纯度高、分子量小、特异性强、无免疫原性及安全可靠。

Description

一种胰腺癌特异结合肽及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种人胰腺癌细胞(PANC-1细胞)和组织特异性结合的多肽(序列为X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10YX11)及其对人胰腺癌细胞、组织具有良好的结合特异性和敏感性的应用。
背景技术
胰腺癌是癌症死亡的第四大原因，是在所有癌症中胰腺癌的相对生存率最低的癌症，其手术切除率低、预后差、病死率高。多年来，胰腺癌的治疗没有进展，也是患者预后差的重要原因之一。“Cancer Statistics,2019”显示，胰腺癌的“五年生存率”仅为9.3％，到2030年将成为第二大致命癌症。其主要原因在于胰腺癌临床病症模糊，缺少特定的生物标志物，很难被诊断，一旦发现，病灶常常已经发生转移。因此，胰腺癌的早期诊断及早期干预，对于改善胰腺癌的病死率有着重要意义。近年来，在胰腺癌早期诊断的价值已经受到广泛重视，随着影像学技术、血清标志物、蛋白质组学标志物、代谢组学标志物、miRNA标志物、基因标志物、循环肿瘤细胞和表观遗传学标志物等技术的出现，对胰腺癌的诊断、早期干预、治疗中监测评估以及防止复发提供了新思路。不过，现存的标志物普遍存在特异性不高，或对于胰腺炎和胰腺癌难以区分的现状。因此，寻找与肿瘤细胞及组织具有较高结合特异性和敏感性的靶向分子，进而展开分子探针及靶向化疗药物载体的开发是关键。
肿瘤导向肽(tumor homing peptides，THPs)是指能够特异的结合到肿瘤细胞和肿瘤血管的多肽。研究发现肿瘤发生发展过程中，细胞表面蛋白基因表达谱会有特异性的分子表达变化，构成特定癌症类型的一组编码，根据配体对这些标志性分子表现出的特定亲和力不同，能够区分正常组织和病变组织，使其成为早期消除或诊断肿瘤的靶点。当前发现的肿瘤导向肽通常是由5～31个氨基酸构成的分子量很小的活性肽。小分子多肽与其他抗体相比，克服了抗体会存在异源性问题；其分子量较小，易通过生理屏障，有效渗透组织，亲和力高，确保可以高效的浓聚配体；易化学合成，低成本自动化设计保证其理化和生物性能，并可以携带荧光染料或药物进行靶向光学成像、治疗。近十年中，肿瘤导向肽已成为一种抗癌剂的有效靶向运载工具和肿瘤区域显像剂。
噬菌体展示技术(phage display technology，PDT)最早由Smith发现，如今已成为发现新功能多肽和改变已有多肽性质的强有力工具，在细胞生物学和蛋白质工程等方面已得到普遍应用。PDT基本原理为将外源蛋白或多肽的基因***噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使两者融合并表达于噬菌体表面，这样被展示的外源蛋白或多肽既保持相对独立的空间结构及生物活性，又不影响重组噬菌体对宿主菌的感染能力，从而建立起表型与基因型的联系。它具有简便、高效、大通量筛选的优点，并可以通过宿主菌扩增与低表达量的特异性分子结合的噬菌体克隆，已广泛应用于抗肿瘤药物、肿瘤诊断标志物等的筛选和研发。近年来，应用噬菌体展示技术筛选肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、***癌等肿瘤靶向短肽的研究中，肿瘤特异性结合肽的研究取得了一定进展。这些多肽分子一方面可有望用于靶向分子探针的创制。另一方面，通过偶联相应的化疗药物有望用于药物的靶向递送，从而有效改善化疗药物对患者正常组织或细胞所产生的毒副作用。在利用标记分子标记后，通过一系列灵敏的检测手段就可以实现对肿瘤的早期诊断和预后检测；同时又可以作为药物的载体。因此，短肽类药物为研究大分子间相互作用的结合位点、寻找亲和力高且具有生物活性的配体分子以及药物的筛选、疫苗和新型诊断试剂的研发等领域带来了新的革命。
胰腺癌由于临床病症模糊，缺少特定的生物标志物，一经诊断，病灶常常已经发生转移，这是导致胰腺癌居高不下的重要原因。再加上现存的抗肿瘤药物由于靶向性不强，导致治疗过程中毒副作用强，治疗效果个体差异大，而且生产成本高。目前大多数肽类药物虽然抗肿瘤靶向性强，发展迅猛，但是仍然存在制造成本高，产量较低等问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胰腺癌特异结合肽及其制备方法与用途，特别是由该肽在制备抗癌药物中的用途。
本发明采用以下技术方案：
一种胰腺癌特异结合肽，其氨基酸序列通式为：X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10YX11。
上述肽链中单字母符号代表的氨基酸残基定义如下：Y为酪氨酸，X1-11为可变的氨基酸残基。
作为优选技术方案，X1是12肽第1位氨基酸，优选为苯丙氨酸(F)；X2是12肽第2位氨基酸，优选为酪氨酸(Y)；X3是12肽第3位氨基酸，优选为丝氨酸(S)；X4是12肽第4位氨基酸，优选为组氨酸(H)；X5是12肽第5位氨基酸，优选为丝氨酸(S)；X6是12肽第6位氨基酸，优选为天冬酰胺(N)；X7是12肽第7位氨基酸，优选为亮氨酸(L)；X8是12肽第8位氨基酸，优选为天冬酰胺(N)；X9是12肽第9位氨基酸，优选为亮氨酸(L)；X10是12肽第10位氨基酸，优选为赖氨酸(K)；X11是12肽第12位氨基酸，优选为精氨酸(R)。
作为优选技术方案，本发明所述结合肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.5之一所示的氨基酸序列。
表1氨基酸序列表
序号 氨基酸序列 简称
SEQ ID NO.1 FYSHSNLNLKYR FY-YR
SEQ ID NO.2 FHLYLRYNLKYN FH-YN
SEQ ID NO.3 ADARYKSNLKYR AD-YR
SEQ ID NO.4 FHLFFLCRGDYR FH-YR
SEQ ID NO.5 DYHDPNLPTDYN DY-YN
本发明提供的一种胰腺癌特异结合肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)多肽FY-YR的制备
采用Fmoc固相合成多肽策略，以Fmoc-Arg(pbf)-OH为原料与Wang树脂进行键合。然后脱去Fmoc基团后，再与Fmoc-Tyr(tBu)-OH在缩合剂DIC和HOBt的存在下进行缩合反应，完成了第二个氨基酸的连接；然后后再脱去Fmoc，与第三个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH进行缩合反应；按照这个程序依次从C端合成到N端，(使用的氨基酸包括Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Ser-OH，Fmoc-His-OH和Fmoc-Phe-OH)直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；收集滤液，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水***，-20℃沉淀3小时，析出白色粉末物，收集沉淀，再用无水***洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
采用C18反相制备柱进行纯化，收集主峰，冷冻干燥，得到白色固体即为产物；
产物经质谱鉴定，质谱图中显示的分子量与理论分子量基本一致。
(2)FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR的制备
采用Fmoc固相合成多肽策略，以Fmoc-FY-YR-Wang树脂为原料，脱去Fmoc基团后，再与Fmoc-Acp-OH在缩合剂DIC和HOBt的存在下进行缩合反应；然后后再脱去Fmoc，与FITC-Cl进行缩合反应；
在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；收集滤液，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水***，-20℃沉淀3小时，析出白色粉末物，收集沉淀，再用无水***洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
采用C18反相制备柱进行纯化，收集主峰，冷冻干燥，得到白色固体即为产物；
产物经质谱鉴定，质谱图中显示的分子量与理论分子量基本一致。
本发明目的之一在于提供一种DNA片段，包含编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5。
本发明还提供一种DNA片段，其包含编码上述本发明通式的肽的氨基酸序列。优选地，所述DNA片段包含编码所述如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5的核苷酸序列。
本发明还提供了一种二价体或多价体，由本发明通式1所述肽及SEQ ID NO.1-SEQID NO.5所述肽组装而成。
优选地，上述二价体或多价体是通过连接分子共价连接或与多聚体混合、非共价连接形成的。
如上所述的二价体或多价体具有胰腺癌细胞特异性靶向作用。
本发明还提供一种药物组合物，包括本发明提供的二价体或多价体或本发明的氨基酸序列为通式所述肽、SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5之一所述的肽作为靶向肽，和能杀死癌细胞的制剂。
本发明提供的药物组合物还包括与所述的多肽或所述二价体或多价体相缀合或混合可制备靶向药物的载体。
优选地，所述的制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。
更优选地，所述的制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激素、金属络合物或肿瘤放射靶向标瘤放射靶向标记物中的任意一种。
进一步地，所述载体为纳米材料，脂质体或油性化合物中的任意一种，或者所述载体为由多种油性化合物所组成的混合物。
本发明还进一步提供了另外一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明氨基酸序列为通式所述肽、SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所述的肽、多肽形成的二价体或多价体和显像制剂。
优选地，所述肽与显像制剂相缀合或混合。
优选地，所述的显像制剂为放射性核素、放射性核素标记物或分子影像制剂中的任意一种。
本发明还提供了氨基酸序列为通式所述肽、SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所述的肽及多肽形成的二价体或多价体在制备用于免疫治疗、预防或诊断癌症的药物或显像制剂中的用途。
所述癌症为胰腺癌、肝癌、卵巢癌、大肠癌中的任意一种，优选为胰腺癌。
本发明利用了噬菌体展示技术筛选胰腺癌特异性结合的多肽，鉴定其特异性和亲和力，为胰腺癌诊断试剂及靶向治疗胰腺癌药物的研制奠定基础。
本发明的有益效果是：(1)本发明的多肽片段能够特异性结合胰腺癌细胞，而不识别正常胰腺癌上皮细胞(即正常细胞)。因此，该肿瘤靶向多肽及其衍生物在胰腺癌肿瘤分子诊断，筛查和靶向治疗中具有重要应用价值。
(2)该多肽的肿瘤特异性结合作用，为进一步寻找新的肿瘤靶点，研究大分子间相互作用的结合位点、寻找亲和力高且具有生物活性的配体分子以及药物的筛选、疫苗和新型诊断试剂的研发等领域带来了更多希望。
(3)与传统药物相比,在生产上,应用生物工程技术，短肽类药物合成和纯化简便,容易实现规模化生产，而且兼有相对分子质量较小、免疫原性弱、活性高等优点，为选出的多肽有望成为效果好、效益高的新时代药物带来更多希望。
附图说明
图1为实施例1中利用噬菌体展示技术对胰腺癌细胞特异性结合阳性多肽的三轮减性筛选滴度实验结果图；其中A、B、C分别为第一、二、三轮筛选滴度实验蓝白斑平板图。
图2为实施例2中重复率最高序列SEQ ID NO.1的阳性噬菌体克隆1号与HPDE6-C7和PANC-1细胞亲和力的免疫细胞化学鉴定图；其中a为HPDE6-C7人正常胰腺导管上皮细胞空白对照图，b为PANC-1胰腺癌靶向细胞图。
图3为实施例3中固相合成的多肽和FITC-阳性多肽片段的质谱图；其中图3(A)为固相合成的多肽FY-YR的质谱图，图3(B)为固相合成的FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR的质谱图。
图4为实施例4中FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR与胰腺癌细胞特异性靶向结合能力的体外鉴定结果图；其中图4(A)为免疫荧光鉴定FITC-FY-YR与胰腺癌细胞特异性靶向结合能力的实验结果图和荧光强度柱形图，图4(B)为免疫荧光验证浓度梯度FITC-FY-YR与胰腺癌细胞特异性靶向结合能力的荧光相对强度曲线图，图4(C)为免疫荧光验证FITC-FY-YR与胰腺癌细胞结合时间梯度特异性靶向结合能力的荧光强度柱形图，图4(D)为流式细胞术鉴定FITC-FY-YR与胰腺癌细胞特异性靶向结合能力的实验结果图和柱形图。
图5为实施例5中免疫荧光验证多肽FY-YR与FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR竞争结合胰腺癌细胞的实验结果图和荧光强度柱形图。
图6为实施例6中FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR与其他肿瘤细胞特异性靶向结合能力的体外鉴定结果图；其中图6(A)为免疫荧光鉴定FITC-FY-YR与肝癌细胞特异性靶向结合能力的实验结果图和荧光强度柱形图，图6(B)为免疫荧光鉴定FITC-FY-YR与卵巢癌细胞特异性靶向结合能力的免疫荧光实验结果图和荧光强度柱形图，图6(C)为免疫荧光鉴定FITC-FY-YR与大肠癌细胞特异性靶向结合能力的免疫荧光实验结果图和荧光强度柱形图。
图7为实施例7中FITC-阳性多肽片段FITC-FH-YN、FITC-AD-YR、FITC-FH-YR、FITC-DY-YN分别与胰腺癌细胞特异性靶向结合能力的体外鉴定结果图；其中图7(A)为免疫荧光鉴定FITC-FH-YN与胰腺癌细胞特异性靶向结合的实验结果图和荧光强度柱形图，图7(B)为免疫荧光鉴定FITC-AD-YR与胰腺癌细胞特异性靶向结合的实验结果图和荧光强度柱形图，图7(C)为免疫荧光鉴定FITC-FH-YR与胰腺癌细胞特异性靶向结合的实验结果图和荧光强度柱形图，图7(D)为免疫荧光鉴定FITC-DY-YN与胰腺癌细胞特异性靶向结合的实验结果图和荧光强度柱形图。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1利用噬菌体展示技术对胰腺癌细胞特异性结合阳性多肽的三轮减性筛选
1.1宿主菌E.coli ER2738的复苏、培养
制备大肠杆菌平板，取LB-TET培养平板于37度孵箱预热1小时，待E.coli ER2738菌液融化后，用接种环蘸取少量菌液均匀铺在培养平板，然后倒置于37℃的恒温培养箱中过夜培养。制备宿主菌液，从生长良好的培养板中挑取单一菌落，置于含有四环素的LB细菌培养液中，37℃、180rpm振荡过夜培养，使细菌处于对数生长期。制备好的含大肠杆菌LB-Tet平板放到4℃冰箱保存备用，宿主菌液放到-80℃冰箱保存备用。
1.2噬菌体展示十二肽库体外减性筛选
以人源性胰腺癌导管上皮细胞PANC-1作为靶细胞，人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C为吸附细胞。利用噬菌体展示技术体外筛选方法，对纽英伦生物技术有限公司(NEWENGLAND Biolabs)的Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library进行3轮体外筛选。并尽量保证每一轮噬菌体的投入总量相同，每轮递增筛选压力，最终获得高度富集的噬菌体。具体筛选步骤如下：
1.2.1准备筛选所用细胞
挑选生长良好的人源性胰腺癌导管上皮细胞PANC-1、人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7。用胰蛋白酶分别消化细胞，显微镜下观察细胞变圆变亮后，吸掉胰酶，加入细胞培养基，轻轻吹打细胞使贴壁细胞悬浮。将两种细胞悬液分别吸到预先制备好的，经过多聚赖氨酸处理的培养皿中，放到细胞孵育箱中，培养到细胞贴壁，待生长良好后用于筛选。
1.2.2准备菌液
筛选当天将过夜培养的宿主菌液加到LB培养液中。37℃、180rpm振荡约3小时。以上为筛选滴度测定及扩增使用菌液。
1.2.3封闭细胞
用吸管吸净培养皿中的液体，并在无菌滤纸上将培养皿中液体拍甩干净。用0.5％BSA封闭，37℃放置1小时。
1.2.4肽库结合
弃掉培养皿里的封闭液。加入用TBST稀释100倍的Ph.D.-12TM原始噬菌体展示十二肽库，室温下120rpm微摇作用1小时。
1.2.5洗涤
吸掉第一轮未结合的噬菌体液，把培养皿放到无菌滤纸上用力拍干。用0.1％TBST洗涤培养皿10次，每次约30秒左右，并冲洗培养皿底部及其边缘，倒掉洗涤液，在无菌滤纸上拍干(注意每次洗涤后更换一张新的干净滤纸，防治交叉污染)。
1.2.6洗脱
培养皿里加入洗脱液(0.2M Glycine-HCl，PH2.2)，常温下、80rpm、微摇15min。洗脱作用结束后，轻轻吹打洗脱液后吸出，加入到含有中和缓冲液的EP管里，混匀。
1.3测定噬菌体滴度
提前摇菌，加TET到LB中，37度180rpm，3小时后，达到对数生长期(OD值达到0.6左右为佳)。测定滴度前先将LB/IPTG/Xgal平板在37℃孵箱预热1小时以上。准备琼脂糖凝胶，微波加热至融化。取吸附后中和洗脱液(或扩增后噬菌体上清液)，用LB培养基倍数稀释噬菌体。稀释范围为：吸附后中和洗脱液稀释102-105；扩增后噬菌体上清液稀释109-1012。每个EP管加入备好的菌液，并在每管里加入10μl不同稀释倍数的噬菌体液。在振荡仪上振荡5min混匀。把感染后噬菌体液加到室温融化的琼脂中，立即将混悬液加至已预热的LB/IPTG/Xgal平板里，用冷却的涂布玻璃棒均匀涂开(每个稀释倍数一个平板，并做好标记)。将涂好的平板倒置于37℃的孵箱过夜培养。第二天检查平板上的噬菌体蓝斑生长情况并计数(即数每个平板上的噬菌体斑个数)。
1.4噬菌体扩增纯化
把剩余的吸附后洗脱液进行扩增纯化，以备接下来的筛选。取无菌离心管，把备好的过夜宿主菌接种到LB培养基中，形成对数前宿主菌液。把所有的吸附后洗脱液加入到对数前宿主菌液里，于37℃、200rpm快速振荡5小时进行扩增。把扩增噬菌体液于4℃、12000rpm离心10min，把上清转到另一新的离心管里再次同等条件下离心。小心取离心管上部80％的上清液到一新的离心管里，再往离心管里加入六分之一体积的PEG/NaCl，放4℃冰箱过夜沉淀。次日，将前日沉淀50ml管于4℃、12000rpm条件下离心15min，弃上清，再次同等条件离心2min，弃掉剩余上清液。把沉淀物用1ml的TBS重悬后转移到无菌EP管里，于4℃、14000rpm条件下离心5min。上清转移到新的EP管里，再次加入六分之一体积的PEG/NaCl，冰上沉淀1小时。于4℃、14000rpm条件下离心10min，弃掉上清液，保留沉淀。用200μl的TBS重悬沉淀物，于4℃、1000rpm离心1min，保留上清于新的EP管(此为扩增后噬菌体液)，-20℃冰箱储存。
1.5第二到三轮筛选
筛选的基本步骤同第一轮。每下一轮筛选均选用前一轮扩增后的噬菌体液作为次级肽库，每轮尽量保持同第一轮基本一致的噬菌体投入量，总共进行三轮减性筛选。每轮筛选后的洗脱液均要测定噬菌体滴度，并计算噬菌体的回收率。
结果如图1所示，图1为利用噬菌体展示技术对胰腺癌细胞特异性结合阳性多肽的三轮减性筛选滴度实验结果图；其中A、B、C分别为第一、二、三轮筛选滴度实验蓝白斑平板图。表1为三轮减性筛选的噬菌体投入量，回收噬菌体滴度和噬菌体回收率，结果显示在第三轮阳性单克隆噬菌体显著富集。
表1三轮减性筛选的噬菌体投入量、回收噬菌体滴度和回收率
Figure BDA0002155841940000081
实施例2测定分析阳性噬菌体克隆DNA序列及细胞免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆与胰腺癌细胞的靶向结合能力
2.1测定分析阳性噬菌体克隆DNA序列
2.1.1阳性单克隆噬菌体挑选
把第三轮筛选后所得的噬菌体液，进行滴度测定铺制LB平板，在生长的斑数不足100个的平板上，随机挑取44个间隔5mm生长良好的蓝斑。把随机挑取的44个蓝斑分别加入到1ml对数前宿主菌液(同噬菌体扩增)，于37℃、200rpm快速振荡4.5小时进行扩增。
2.1.2阳性单克隆噬菌体单链DNA提取
将扩增的单克隆噬菌体液分别于4℃、14000rpm离心30秒，取上清液转到新管中，4℃、1000rpm离心30秒，取上清的80％转到新的无核酸酶离心管里，取300ul菌液按1:1比例加300ul甘油，-20度冰箱冻存，取此即为扩增的单克隆噬菌体液。剩下500ul菌液加200ulPEG，混匀室温静置20min，4度离心14000rpm，10min，弃上清，4度14000rpm离心3min，弃上清，加100ul NaI，混合均匀，加250ul无水乙醇，静置10min，4度10000rpm离心10min，弃上清，用预冷的70％乙醇轻微洗3次，晾干30min，10000rpm离心5min，弃上清，加60ul TE。
2.1.3DNA纯化
取上一步60ul TE管，加40ul TE补足至100ul。向离心管里加入500ul Buffer B3，充分混匀。将混合液全部移入吸附柱，室温下，8000g，离心30秒，将滤出液再次加入吸附柱中再次过柱。倒掉收集管里的液体，将吸附柱放回收集管里。向吸附柱里加入500μl WashSolution，9000g，离心30秒。倒掉收集管里的液体，吸附柱重新放到收集管中。重复上一步骤，将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g，离心1min。在吸附膜中央加入40μl的ElutionBuffer，室温静置2min。9000g离心1min，将所得到的DNA溶液进行测序。
2.1.4测定DNA序列并分析
将提取的单链DNA进行序列测定，并根据三联密码子的原则翻译出相应的氨基酸序列。用DNAstar软件将其翻译为短肽序列和结构分析，并运用NCBI Blast与已知蛋白多肽序列对比同源性；GeneBank、Swiss-prot蛋白数据库对核苷酸序列进行相似性分析。
2.2细胞免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆与胰腺癌细胞的靶向结合能力
选取重复频率高的阳性噬菌体克隆。用大肠杆菌ER2738扩增并纯化挑选的阳性噬菌体克隆。以正常胰腺组织细胞作空白对照，对阳性噬菌体克隆与胰腺癌细胞的靶向结合能力进行细胞免疫组化，初步鉴定亲和力。
结果如图2所示，图2为重复率最高序列SEQ ID NO.1的阳性噬菌体克隆1号与HPDE6-C7和PANC-1细胞亲和力的免疫细胞化学鉴定图；其中a为HPDE6-C7人正常胰腺导管上皮细胞空白对照图；b为PANC-1胰腺癌靶向细胞图，结果显示PANC-1有明显的阳性荧光结合。表2为DNA测序结果中筛选出来的5个序列和重复次数，其中共测了44个阳性单克隆噬菌体，其中重复次数最高的SEQ ID NO.1为31次，其他序列重复次数分别为SEQ ID NO.2为2次，SEQ ID NO.3为4次，SEQ ID NO.4为3次，SEQ ID NO.5为4次，将5个序列与已知蛋白多肽序列对比同源性和相似性分析结果为与已知蛋白多肽序列没有同源性，与核苷酸序列没有相似性，
表2序列重复次数表
序号 重复次数/总次数
SEQ ID NO.1 31/44
SEQ ID NO.2 2/44
SEQ ID NO.3 4/44
SEQ ID NO.4 3/44
SEQ ID NO.5 4/44
实施例3固相合成多肽及其FITC-阳性多肽片段
根据测得的氨基酸序列，通过对其氨基酸序列进行同源性比对分析及对其核酸序列的生物信息学分析。用固相合成法合成多肽FY-YR(序列为FYSHSNLNLKYR)、FH-YN(序列为FHLYLRYNLKYN)、AD-YR(序列为ADARYKSNLKYR)、FH-YR(序列为FHLFFLCRGDYR)、DY-YN(序列为DYHDPNLPTDYN)及FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR(序列为FYSHSNLNLKYR)、FITC-FH-YN(序列为FHLYLRYNLKYN)、FITC-AD-YR(序列为ADARYKSNLKYR)、FITC-FH-YR(序列为FHLFFLCRGDYR)、FITC-DY-YN(序列为DYHDPNLPTDYN)，并对合成的多肽进行鉴定。同时也在生工生物工程(上海)股份有限公司合成了以上多肽及FITC-阳性多肽片段。
3.1多肽FY-YR的制备方法
3.1.1采用Fmoc固相合成多肽策略，以Fmoc-Arg(pbf)-OH为原料与Wang树脂进行键合。然后脱去Fmoc基团后，再与Fmoc-Tyr(tBu)-OH在缩合剂DIC和HOBt的存在下进行缩合反应，完成了第二个氨基酸的连接；然后后再脱去Fmoc，与第三个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH进行缩合反应；按照这个程序依次从C端合成到N端，(使用的氨基酸包括Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Ser-OH，Fmoc-His-OH和Fmoc-Phe-OH)直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂。
3.1.2在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；收集滤液，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水***，-20℃沉淀3小时，析出白色粉末物，收集沉淀，再用无水***洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成。
3.1.3采用C18反相制备柱进行纯化，收集主峰，冷冻干燥，得到白色固体即为产物；产物经质谱鉴定，质谱图中显示的分子量与理论分子量基本一致。
3.2FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR的制备方法
3.2.1采用Fmoc固相合成多肽策略，以Fmoc-FY-YR-Wang树脂为原料，脱去Fmoc基团后，再与Fmoc-Acp-OH在缩合剂DIC和HOBt的存在下进行缩合反应；然后后再脱去Fmoc，与FITC-Cl进行缩合反应。
3.2.2在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；收集滤液，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水***，-20℃沉淀3小时，析出白色粉末物，收集沉淀，再用无水***洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成。
3.2.3采用C18反相制备柱进行纯化，收集主峰，冷冻干燥，得到白色固体即为产物；产物经质谱鉴定，质谱图中显示的分子量与理论分子量基本一致。
3.3多肽FH-YN、AD-YR、FH-YR、DY-YN和FITC-阳性多肽片段FITC-FH-YN、FITC-AD-YR、FITC-FH-YR、FITC-DY-YN的制备方法
固相合成方法同3.1和3.2，氨基酸根据多肽的氨基酸序列而改变。
结果如图3所示，图3为固相合成的多肽FY-YR和FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR的质谱图；其中图3(A)为固相合成的多肽FY-YR的质谱图，图3(B)为固相合成的FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR的质谱图。质谱结果显示固相合成的多肽FY-YR和FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR分别与其理论值一致，且与生工生物工程(上海)股份有限公司合成多肽及FITC-阳性多肽片段的分子量及其他结果一致。表明固相合成合成的多肽符合质量要求，可用于后续的效应评价。
实施例4 FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR与胰腺癌细胞特异性靶向结合能力的体外鉴定
4.1免疫荧光鉴定FITC-FY-YR与胰腺癌细胞的特异性靶向结合能力：FITC-FY-YR分别与胰腺癌细胞PANC-1，Mia-capa-2以及人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7作用
4.1.1免疫荧光鉴定FITC-FY-YR与胰腺癌细胞的特异性靶向结合能力
将HPDE6-C7，Mia-capa-2以及PANC-1细胞铺于带有载玻片的24孔板中，放细胞孵箱培养细胞贴壁并铺满单层。24小时后，弃去培养基用PBS洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定10min。PBS洗3次，每次5min。用含0.5％TritonX-100的PBS透化10min。PBS洗3次，每次5min。加3％BSA封闭，室温静置15min。加入3μM FITC-FY-YR，37度静置15min。PBS洗3次，每次5min。加入DAB染液，37度静置15min。将24孔板中的载玻片取出，倒扣在加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，通过激光共聚焦显微镜定位FITC-FY-YR在细胞的位置，并鉴定胰腺癌细胞的特异性靶向作用。
4.1.2免疫荧光分别鉴定FITC-FY-YR浓度梯度和结合时间梯度时FITC-FY-YR与胰腺癌细胞的特异性靶向结合效率
4.1.2.1免疫荧光验证浓度梯度的FITC-FY-YR与胰腺癌细胞的特异性靶向结合能力
将HPDE6-C7，Mia-capa-2以及PANC-1细胞铺于带有载玻片的24孔板中，放细胞孵箱培养细胞贴壁并铺满单层。24小时后，弃去培养基用PBS洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定10min。PBS洗3次，每次5min。用含0.5％TritonX-100的PBS透化10min。PBS洗3次，每次5min。加3％BSA封闭，室温静置15min。分别加入0.75μM，1.5μM，3μM，6μM，12μM，24μM，48μM的FITC-FY-YR，37度静置15min。PBS洗3次，每次5min。加入DAB染液，37度静置15min。将24孔板中的载玻片取出，倒扣在加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，通过激光共聚焦显微镜定位FITC-FY-YR在细胞的位置，并鉴定胰腺癌细胞的特异性靶向作用。
4.1.2.2免疫荧光验证FITC-FY-YR与胰腺癌细胞结合时间梯度的的特异性靶向结合能力
将HPDE6-C7，Mia-capa-2以及PANC-1细胞铺于带有载玻片的24孔板中，放细胞孵箱培养细胞贴壁并铺满单层。24小时后，弃去培养基用PBS洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定10min。PBS洗3次，每次5min。用含0.5％TritonX-100的PBS透化10min。PBS洗3次，每次5min。加3％BSA封闭，室温静置15min。加入3μM FITC-FY-YR，37度分别静置孵育5min，15min，45min，135min。PBS洗3次，每次5min。加入DAB染液，37度静置15min。将24孔板中的载玻片取出，倒扣在加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，通过激光共聚焦显微镜定位FITC-FY-YR在细胞的位置，并鉴定胰腺癌细胞的特异性靶向作用。
4.2应用流式细胞术进一步鉴定FITC-FY-YR与胰腺癌细胞的特异性靶向结合能力
将HPDE6-C7，Mia-capa-2以及PANC-1细胞铺于带有载玻片的6孔板中，放细胞孵箱培养细胞贴壁并铺满单层。24小时后，弃去培养基，加胰酶消化1min，离心1000rpm 5min，用含有10％的血清停止消化，弃去上清液，PBS洗1次，离心1000rpm 5min，弃上清。加入3μMFITC-FY-YR，混合均匀，37度孵育15min。离心1000rpm 5min，弃上清。加PBS洗一遍，室温1000rpm离心5min，弃上清。加300ul PBS混合均匀，上样流式细胞仪检测。
结果如图4所示，图4为FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR与胰腺癌细胞特异性靶向结合能力的体外鉴定结果图；其中图4(A)为免疫荧光鉴定FITC-FY-YR与胰腺癌细胞特异性靶向结合能力的实验结果图和荧光强度柱形图，固定的PANC-1，Mia-capa-2和HPDE6-C7细胞分别用3μM FITC-FY-YR孵育15min，在PANC-1和Mia-capa-2细胞上观察到强荧光信号，而在HPDE6-C7细胞上检测到较弱的荧光信号。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图4(B)为免疫荧光验证浓度梯度FITC-FY-YR与胰腺癌细胞特异性靶向结合能力的荧光相对强度曲线图，荧光相对强度曲线图显示分别与0μM，0.75μM，1.5μM，3μM，6μM，12μM，24μM，48μM FITC-FY-YR结合时，FITC-FY-YR与胰腺癌细胞结合的荧光强度随着FITC-FY-YR浓度的增加而升高，且在3μM时即可显示较高的荧光强度和差异性(P<0.05)，而在超过12μM的浓度后不呈现明显升高趋势。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图4(C)为免疫荧光验证FITC-FY-YR与胰腺癌细胞结合时间梯度特异性靶向结合能力的荧光强度柱形图，荧光强度柱形图显示以3μM浓度的FITC-FY-YR分别与胰腺癌细胞孵育0min，5min，15min，45min，135min时，FITC-FY-YR与胰腺癌细胞结合的荧光强度随着孵育时间的延长而升高，且在5min时即可显示较高的荧光强度和差异性(P<0.05)，而在超过45min后不呈现明显升高趋势。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图4(D)为流式细胞术鉴定FITC-FY-YR与胰腺癌细胞特异性靶向结合能力的实验结果图和柱形图，实验结果图和柱形图显示FITC-FY-YR与胰腺癌细胞的特异性靶向结合能力。固定的PANC-1、Mia-capa-2和HPDE6-C7分别用3μM FITC-FY-YR孵育15min，在PANC-1和Mia-capa-2细胞上观察到强荧光信号，而在HPDE6-C7细胞上检测到较弱的荧光信号。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实施例5免疫荧光验证多肽FY-YR与FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR竞争结合胰腺癌细胞
将胰腺癌细胞Mia-capa-2和PANC-1细胞铺于带有载玻片的24孔板中，放细胞孵箱培养细胞贴壁并铺满单层。24小时后，弃去培养基用PBS洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定10min。PBS洗3次，每次5min。用含0.5％TritonX-100的PBS透化10min。PBS洗3次，每次5min。加3％BSA封闭，室温静置15min。分别将0μM，3μM，15μM，30μM，150μM梯度稀释的未标记多肽FY-YR和3μM FITC-FY-YR混匀，分别加入24孔板中，37度静置15min。PBS洗3次，每次5min。加入DAB染液，37度静置15min。将24孔板中的载玻片取出，倒扣在加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上。通过共聚焦显微镜定位FITC-FY-YR在细胞的位置，并鉴定胰腺癌细胞的特异性靶向结合作用。
结果如图5所示，图5为免疫荧光验证多肽FY-YR与FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR竞争结合胰腺癌细胞的实验结果图和荧光强度柱形图。给予梯度浓度的未标记多肽FY-YR封闭细胞，免疫荧光检测FITC-FY-YR与胰腺癌细胞Mia-capa-2和PANC-1的结合能力并分析荧光强度，荧光强度柱形图显示随着未标记多肽FY-YR浓度的增加而荧光强度减弱，FITC-FY-YR与胰腺癌细胞的结合能力减弱。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实施例6 FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR与其他肿瘤细胞特异性靶向结合能力的体外鉴定
6.1免疫荧光鉴定FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR与肝癌细胞特异性靶向结合能力
将人正常肝组织来源细胞L-02，人肝癌上皮细胞Bel-7402和人肝癌上皮细胞HUH-7铺于带有载玻片的24孔板中，放细胞孵箱培养细胞贴壁并铺满单层。24小时后，弃去培养基用PBS洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定10min。PBS洗3次，每次5min。用含0.5％TritonX-100的PBS透化10min。PBS洗3次，每次5min。加3％BSA封闭，室温静置15min。加入3μM FITC-FY-YR，37度静置15min。PBS洗3次，每次5min。加入DAB染液，37度静置15min。将24孔板中的载玻片取出，倒扣在加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上。通过共聚焦显微镜定位FITC-FY-YR在细胞的位置，并鉴定肝癌细胞的特异性靶向作用。
6.2免疫荧光鉴定FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR与卵巢癌细胞特异性靶向结合能力
将人正常卵巢上皮细胞HOSEpiC，人卵巢癌上皮细胞OVCAR-3和人卵巢癌上皮细胞SK-OV-3铺于带有载玻片的24孔板中，放细胞孵箱培养细胞贴壁并铺满单层。24小时后，弃去培养基用PBS洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定10min。PBS洗3次，每次5min。用含0.5％TritonX-100的PBS透化10min。PBS洗3次，每次5min。加3％BSA封闭，室温静置15min。加入3μM FITC-FY-YR，37度静置15min。PBS洗3次，每次5min。加入DAB染液，37度静置15min。将24孔板中的载玻片取出，倒扣在加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上。通过共聚焦显微镜定位FITC-FY-YR在细胞的位置，并鉴定卵巢癌细胞的特异性靶向作用。
6.3免疫荧光鉴定FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR与大肠癌细胞特异性靶向结合能力
将人正常肠上皮细胞HIEC、人结肠癌上皮细胞HCT 116和人结肠癌上皮细胞SW620铺于带有载玻片的24孔板中，放细胞孵箱培养细胞贴壁并铺满单层。24小时后，弃去培养基用PBS洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定10min。PBS洗3次，每次5min。用含0.5％TritonX-100的PBS透化10min。PBS洗3次，每次5min。加3％BSA封闭，室温静置15min。加入3μM FITC-FY-YR，37度静置15min。PBS洗3次，每次5min。加入DAB染液，37度静置15min。将24孔板中的载玻片取出，倒扣在加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上。通过共聚焦显微镜定位FITC-FY-YR在细胞的位置，并鉴定大肠癌细胞的特异性靶向作用。
结果如图6所示，图6为FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR与其他肿瘤细胞特异性靶向结合的体外鉴定结果图；其中图6(A)为免疫荧光鉴定FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR与肝癌细胞特异性靶向结合能力的实验结果图和荧光强度柱形图。在人肝癌细胞Bel-7402和HUH-7上观察到强荧光信号，而在人正常肝细胞L-02上检测到较弱的荧光信号。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图6(B)为免疫荧光鉴定FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR与卵巢癌细胞特异性靶向结合能力的实验结果图和荧光强度柱形图。在人卵巢癌细胞OVCAR-3和SK-OV-3上观察到强荧光信号，而在人正常卵巢细胞HOSEpiC上检测到较弱的荧光信号。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图6(C)为免疫荧光鉴定FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR与大肠癌细胞特异性靶向结合能力的实验结果图和荧光强度柱形图。在人结肠癌上皮细胞HCT 116和SW620上观察到强荧光信号，而在人正常肠上皮细胞HIEC上检测到较弱的荧光信号。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实施例7 FITC-阳性多肽片段FITC-FH-YN、FITC-AD-YR、FITC-FH-YR、FITC-DY-YN分别与胰腺癌细胞特异性靶向结合能力的体外鉴定
免疫荧光鉴定FITC-阳性多肽片段FITC-FH-YN、FITC-AD-YR、FITC-FH-YR、FITC-DY-YN分别与胰腺癌细胞的体外特异性靶向结合
将HPDE6-C7，Mia-capa-2以及PANC-1细胞铺于带有载玻片的24孔板中，放细胞孵箱培养细胞贴壁并铺满单层。24小时后，弃去培养基用PBS洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定10min。PBS洗3次，每次5min。用含0.5％TritonX-100的PBS透化10min。PBS洗3次，每次5min。加3％BSA封闭，室温静置15min。分别加入3μM FITC-FH-YN、6μM FITC-AD-YR、8μMFITC-FH-YR、7μM FITC-DY-YN，37度静置孵育15min。PBS洗3次，每次5min。加入DAB染液，37度静置15min。将24孔板中的载玻片取出，倒扣在加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，通过激光共聚焦显微镜分别定位FITC-FH-YN、FITC-AD-YR、FITC-FH-YR、FITC-DY-YN在细胞的位置，并鉴定胰腺癌细胞的特异性靶向结合作用。
结果如图7所示，图7为FITC-阳性多肽片段FITC-FH-YN、FITC-AD-YR、FITC-FH-YR、FITC-DY-YN分别与胰腺癌细胞特异性靶向结合能力的体外鉴定结果图；其中图7(A)为免疫荧光鉴定FITC-FH-YN与胰腺癌细胞特异性靶向结合的实验结果图和荧光强度柱形图，结果显示FITC-FH-YN与胰腺癌细胞的特异性靶向结合能力。在人胰腺癌细胞PANC-1和Mia-capa-2和上观察到强荧光信号，而在人正常胰腺细胞HPDE6-C7上检测到较弱的荧光信号。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图7(B)为免疫荧光鉴定FITC-AD-YR与胰腺癌细胞特异性靶向结合的实验结果图和荧光强度柱形图，结果显示FITC-AD-YR与胰腺癌细胞的特异性靶向结合能力。在人胰腺癌细胞PANC-1和Mia-capa-2和上观察到强荧光信号，而在人正常胰腺细胞HPDE6-C7上检测到较弱的荧光信号。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图7(C)为免疫荧光鉴定FITC-FH-YR与胰腺癌细胞特异性靶向结合的实验结果图和荧光强度柱形图，结果显示FITC-FH-YR与胰腺癌细胞的特异性靶向结合能力。在人胰腺癌细胞PANC-1和Mia-capa-2和上观察到强荧光信号，而在人正常胰腺细胞HPDE6-C7上检测到较弱的荧光信号。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图7(D)为免疫荧光鉴定FITC-DY-YN与胰腺癌细胞特异性靶向结合的实验结果图和荧光强度柱形图，结果图显示多肽FITC-DY-YN与胰腺癌细胞的特异性靶向结合能力。在人胰腺癌细胞PANC-1和Mia-capa-2和上观察到强荧光信号，而在人正常胰腺细胞HPDE6-C7上检测到较弱的荧光信号。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
多肽FY-YR、FH-YN、AD-YR、FH-YR、DY-YN及FITC-阳性多肽片段FITC-FY-YR、FITC-FH-YN、FITC-AD-YR、FITC-FH-YR、FITC-DY-YN同属于本发明通式中的多肽。
从实验例中可以得出，本发明的多肽具有靶向胰腺癌、肝癌、大肠癌和卵巢癌肿瘤细胞的特性，因此能够作为靶向多肽与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合，用于肿瘤的靶向治疗；或可与显影剂相缀合或混合，用于靶向肿瘤的分子成像与诊断。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医科大学
<120> 一种胰腺癌特异结合肽及其制备方法与用途
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Phe Tyr Ser His Ser Asn Leu Asn Leu Lys Tyr Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Phe His Leu Tyr Leu Arg Tyr Asn Leu Lys Tyr Asn
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Ala Asp Ala Arg Tyr Lys Ser Asn Leu Lys Tyr Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Phe His Leu Phe Phe Leu Cys Arg Gly Asp Tyr Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
Asp Tyr His Asp Pro Asn Leu Pro Thr Asp Tyr Asn
1 5 10

Claims (6)

1.一种胰腺癌特异结合肽，其特征在于，所述结合肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5之一所示的氨基酸序列。
2.一种DNA片段，包含编码SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5的核苷酸序列。
3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的肽和能杀死癌细胞的制剂；
所述肽作为靶向多肽，与能够杀死癌细胞的制剂相缀合或混合；
所述的制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种；
所述的制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激素、金属络合物或肿瘤放射靶向标瘤放射靶向标记物中的任意一种；
所述载体为纳米材料，脂质体或油性化合物中的任意一种，或者所述载体为由多种油性化合物所组成的混合物。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的肽和显影制剂；
所述肽与显像制剂相缀合或混合；
所述的显像制剂为放射性核素、放射性核素标记物或分子影像制剂中的任意一种。
5.权利要求1所述肽在制备用于免疫治疗、预防或诊断癌症的药物或显像制剂中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述癌症为胰腺癌。
CN201910719775.7A 2019-08-05 2019-08-05 一种胰腺癌特异结合肽及其制备方法与用途 Active CN110330551B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910719775.7A CN110330551B (zh) 2019-08-05 2019-08-05 一种胰腺癌特异结合肽及其制备方法与用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910719775.7A CN110330551B (zh) 2019-08-05 2019-08-05 一种胰腺癌特异结合肽及其制备方法与用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110330551A CN110330551A (zh) 2019-10-15
CN110330551B true CN110330551B (zh) 2023-02-28

Family

ID=68148550

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910719775.7A Active CN110330551B (zh) 2019-08-05 2019-08-05 一种胰腺癌特异结合肽及其制备方法与用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110330551B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111393505B (zh) * 2020-03-26 2022-03-01 中国医科大学 一种靶向多种肿瘤细胞的多肽及其用途
CN111393507B (zh) * 2020-04-02 2022-03-01 中国医科大学 一种与多种肿瘤细胞特异性结合的新型多肽及其用途
US20240115729A1 (en) * 2021-02-05 2024-04-11 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for targeted antifibrotic therapy in chronic pancreatitis

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104262460A (zh) * 2014-09-05 2015-01-07 国家纳米科学中心 一种靶向人乳腺癌细胞的多肽及其应用
WO2018103064A1 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 Agricultural Technology Research Institute Cancer stem cell targeting peptide and use thereof
CN108409836A (zh) * 2018-01-08 2018-08-17 中国医科大学 一种多肽及其用途
CN108610396A (zh) * 2018-04-26 2018-10-02 中国医科大学 一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽
CN108623661A (zh) * 2018-05-14 2018-10-09 中国医学科学院肿瘤医院 一种靶向胰腺癌肿瘤细胞的双特异性多肽分子探针及应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101844571B1 (ko) * 2015-02-27 2018-05-14 경북대학교 산학협력단 오토파지 세포 표적용 펩타이드 및 이의 용도

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104262460A (zh) * 2014-09-05 2015-01-07 国家纳米科学中心 一种靶向人乳腺癌细胞的多肽及其应用
WO2018103064A1 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 Agricultural Technology Research Institute Cancer stem cell targeting peptide and use thereof
CN108409836A (zh) * 2018-01-08 2018-08-17 中国医科大学 一种多肽及其用途
CN108610396A (zh) * 2018-04-26 2018-10-02 中国医科大学 一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽
CN108623661A (zh) * 2018-05-14 2018-10-09 中国医学科学院肿瘤医院 一种靶向胰腺癌肿瘤细胞的双特异性多肽分子探针及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110330551A (zh) 2019-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110330551B (zh) 一种胰腺癌特异结合肽及其制备方法与用途
CN108409836B (zh) 一种多肽及其用途
CN108610396B (zh) 一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽
CN111253472B (zh) 一种靶向多种肿瘤细胞的新型多肽及其用途
CN108640976B (zh) 一种与人结肠癌细胞特异性结合的多肽
CN108341854B (zh) 一种肿瘤靶向的新型多肽及其用途
CN104650190A (zh) 肝癌细胞表面特异性结合的多肽
CN111393507B (zh) 一种与多种肿瘤细胞特异性结合的新型多肽及其用途
CN109180787B (zh) 靶向egfr抑制egf促肿瘤细胞增殖的多肽
CN112409447B (zh) 一种靶向识别膜联蛋白a2的亲和短肽及其制备方法与用途
CN111548390B (zh) 一种cd133拮抗多肽及其衍生物与应用
CN111560053B (zh) 一种cd133拮抗多肽及其衍生物与应用
CN111647046B (zh) 一种cd133拮抗多肽及其衍生物与应用
CN111518171B (zh) 一种靶向人肝癌细胞的多肽及其用途
CN114057880B (zh) 一种dll3单克隆抗体
CN111018951B (zh) 一种靶向三阴性乳腺癌细胞的多肽及其应用
CN111647047B (zh) 一种cd133拮抗多肽及其衍生物与应用
CN111269288B (zh) 一种靶向热休克蛋白60的亲和多肽及其筛选方法与用途
CN110950931B (zh) 一种特异性靶向三阴性乳腺癌干细胞的多肽及其应用
CN111647045B (zh) 一种cd133拮抗多肽及其衍生物与应用
CN113527429B (zh) 人肝癌细胞特异结合多肽及其用途
CN113527431B (zh) 特异靶向人结直肠癌细胞的多肽及其用途
CN108822189B (zh) 一种靶向结合淋巴癌细胞系的特异性多肽及其应用
CN111825749A (zh) 一种抗肿瘤多肽及其制备方法与用途
CN113527430B (zh) 一种肿瘤细胞特异靶向的新型多肽及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant