CN114181837B - 一株富硒毛柄库恩菇新菌株及其人工栽培方法 - Google Patents
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-
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-
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Abstract
本发明公开了一株富硒毛柄库恩菇新菌株及其人工栽培方法。毛柄库恩菇HMGIM‑W140033,其于2021年9月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No：61940。本发明通过采集野生的毛柄库恩菇新菌株并确认其分类，通过人工驯化的研究，发掘出具有较耐高温，适于在南方栽培，活力强，多糖、硒和钾含量较高，其中硒含量高于绝大多数食药用菌的一株毛柄库恩菇新菌株。
Description
技术领域
本发明属于珍稀食用菌栽培领域。尤其涉及一株富硒毛柄库恩菇新菌株及其人工栽培方法。
背景技术
食用菌在国际上被誉为21世纪的健康食品，营养、保健、安全，不仅是世卫组织推荐的“一荤一素一菇”膳食模式的组合成份，更是功能性食品、膳食营养补充剂、生物药品、化妆品的重要原料，国际上已把食药用菌作为服饰箱包、绿色建筑的材料。我国是食药用菌资源最为丰富的国家，也是最早认识、采摘、食用和栽培食用菌的国家。我国食用菌迅速发展，2012年起即成为农业领域中仅次于粮、油、果、菜的第五大类农产品。2019年我国食用菌总产量已达到3933.87万吨，产值3126.67亿元，占全球的75％以上。食用菌又是种植业中高效高价值农业产业，具有“不与人争粮，不与粮争地，不与地争肥，不与农争时”的特点，投资回报快且回报率高。食用菌营养均衡且富含功能成分，在精准营养和慢病防控中具有重要作用，是大健康产业发展的新选择。食用菌栽培以农业废弃物如秸秆等为基质，实现废弃物的资源化利用，解决了农村环境污染的问题，对于环境的保护和循环经济有着重要的作用。
毛柄库恩菇Kuehneromyces mutabilis(Schaeff.)Singer&A.H.Sm隶属于担子菌门Basidiomycota，层菌纲Hymenomycetes，伞菌目Agaricales，球盖菇科Strophariaceae，库恩菇属Kuehneromyces。毛柄库恩菇，别名毛腿环锈伞、库恩菇。该菌营养丰富，蛋白质和粗多糖含量较高，且含有多种矿物质。在德国有关专家把毛柄库恩菇推崇为营养丰富、味道鲜美的食用菌之一。此外它还具有很高的药用价值，如抗流感病毒、抑制肿瘤细胞增殖等。虽然其具有较高的营养价值和药用价值，但由于毛柄库恩菇地域性分布较狭窄，已有记载分布于东北、华北、西北、华中等地区，野生资源较为稀缺，对其进行研究的报道也非常少。19世纪末，河北省食用菌研究所工作人员对毛柄库恩菇段木栽培方法进行简要介绍(德国毛柄库恩菇段木栽培简介，卜致东，1996)。此外，盖宇鹏研究了包括库恩菇在内的球盖菇科5个种的个体发育情况。国外的研究更多地集中于库恩菇不同组织的代谢物含量与种类及其提取物的功能研究上。目前，国内市场上无在售的毛柄库恩菇，食用菌相关研究团队也尚未开展更多关于该菌菌种选育、栽培及活性成分与功能的研究。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种出菇温度较高，能在南方地区，如广州等地区出菇的毛柄库恩菇(Kuehneromyces mutabilis)HMGIM-W140033,其于2021年9月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼 5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No：61940。
本发明的第二个目的是提供一种上述毛柄库恩菇HMGIM-W140033的人工栽培方法，其包括以下步骤：
将毛柄库恩菇HMGIM-W140033的生长母种接种于栽培袋中的原种培养基中进行原种培养，待菌丝吃满料后获得原种；将原种接种于栽培袋中的生产种培养基中进行生产种培养，待菌丝吃满料后获得生产种；将生产种接种于栽培袋中的栽培料培养基中培养，进行栽培管理，获得子实体；
所述的原种培养基为：按质量分数计，包括38-42％棉籽壳+35-40％木屑+18-20％麸皮 +1-2％碳酸钙；
所述的生产种培养基为：按质量分数计，包括38-42％棉籽壳+35-40％木屑+18-20％麸皮 +1-2％碳酸钙；
所述的栽培料培养基为：按质量分数计，包括31-35％棉籽壳+52-56％木屑+8-10％麸皮 +1-2％碳酸钙。
优选，所述的原种培养是置于25℃下恒温暗培养。
优选，所述的生产种培养是置于25℃下恒温暗培养。
优选，所述的栽培管理是生产种接种后在25℃±1℃、空气相对湿度60-70％的培养室中避光培养；待栽培袋中的菌丝长满袋中栽培料并经后熟处理后，打开栽培袋盖子去掉菌环，把栽培袋竖排放置，置于25℃遮光处，保持95％的相对湿度，每天更换新风2次，每次1 小时，维持3-4天后，控制温度20-22℃，空气相对湿度80-90％之间，每天13小时的光照，加大通风，使空气中二氧化碳浓度小于5％，原基长出，继续培养获得子实体。
优选，所述的生产母种的制备方法是：将毛柄库恩菇HMGIM-W140033接种到综合PDA 培养基上，置于25℃恒温暗培养，待菌丝长满斜面后获得生产母种。
本发明还提供了毛柄库恩菇HMGIM-W140033在制备富硒产品中的应用。
优选，所述的富硒产品是富硒食品。
本发明的毛柄库恩菇HMGIM-W140033的栽培过程技术参数如下：
1.菌丝培养
25℃恒温、遮光培养，菌丝长满菌袋的培养时间约为30天。
2.后熟
菌丝成熟后，置于25℃遮光处，维持15-30天。
3.出菇
控制温度在20-22℃，空气相对湿度80-90％之间，光照13h/天。需氧量较小 (空气中二氧化碳浓度小于5％)。
出菇情况
1.出菇期：该品种出菇较整齐，出菇期约63天。
2.驯化子实体性状(图2)：菌盖直径2.5-6cm，扁半球形，凸形，后渐扁平，光滑，中部呈淡黄色，边缘黄褐色。菌肉白色或带褐色。菌褶稍下延，稍密，薄，宽，初期近白色，后呈锈褐色。菌柄长3-10cm，粗0.5-0.8cm，上下等粗，上部分浅黄色，下部分为黄褐色，内部松软后变中空，菌环生于菌柄前端，膜质，易脱落。菌环以下部分有鳞片。人工驯化后子实体商品性状良好，发育较整齐。
毛柄库恩菇外形优美，口感鲜美，具有内源有机硒含量及粗多糖含量丰富等特点，已有研究证明其提取物具有抗流感病毒、抑制肿瘤细胞增殖等功效。前人的研究以树桩和段木进行栽培，且子实体形成的最佳温度为14～18℃，出菇温度较低。本发明使用的新菌株采集自广东省韶关市，可以混料袋栽的方式在广州地区正常出菇，经过与《中国食药用菌学》中的食药用的营养成分比较，毛柄库恩菇中硒的含量高于99％以上的食药用菌。因此，毛柄库恩菇可作为人体补充有机硒的优质食物来源，为南方地区提供新的高值化食用菌品种。本发明从野生环境下采集到的优良毛柄库恩菇子实体经过分离纯化获得其纯菌株，并且经过人工驯化栽培工艺研究得到其人工栽培子实体，将为毛柄库恩菇新菌株的利用提供重要途径。
本发明通过采集野生的毛柄库恩菇新菌株并确认其分类，通过人工驯化的研究，发掘出具有较耐高温，适于在南方栽培，活力强，多糖、硒和钾含量较高的一株毛柄库恩菇新菌株。
Kuehneromyces mutabilis HMGIM-W140033,其于2021年9月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No：61940。
附图说明：
图1是毛柄库恩菇(Kuehneromyces mutabilis)HMGIM-W140033的野外采集图；
图2是野生的毛柄库恩菇HMGIM-W140033人工驯化子实体。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
本团队在全国开展的大型野生食药用菌资源调查中，在广东和湖北均采集到毛柄库恩菇。2014年3月21日本研究团队成员胡惠萍、曹仁润等人在广东省韶关市车八岭国家级自然保护区进行大型真菌资源采集和调查时，得到一份毛柄库恩菇标本(图1)，该菌群生于向阳的腐木上。
分离培养基：加富综合PDA(按质量分数计，包括马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、蛋白胨0.5％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％、维生素B1 0.001％余量为水。马铃薯先洗净去皮,再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，滤液加热，再加入其他成分，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管，在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌20min，取出冷却摆成斜面。
采集回来的野生子实体在无菌条件下用75％酒精擦拭表面后，撕开，以无菌操作方式接入0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的菌肉组织。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后则可进行转接。由此通过组织分离获得原始菌株HMGIM-W140033。
菌株HMGIM-W140033的形态特征为：菌盖直径2～6cm，半球形或凸镜形，渐平展，中部突起，边缘内卷；表面湿时稍黏，水渍状，光滑或具不明显的白色纤丝，黄褐色至茶褐色，中部常呈红褐色，边缘湿时具半透明条纹。菌肉白色至淡黄褐色。菌褶直生或稍延生，呈浅锈褐色。菌柄长4～10cm，直径0.2～1cm，中生，圆柱形，等粗，或向基部渐细；菌环以上近白色至黄褐色，具粉状物；菌环以下暗褐色，具反卷的灰白色至褐色的鳞片；菌柄基部无附着物或具白色絮状菌丝，内部松软后变空心。菌环上位，膜质。担孢子5.5～ 7.5×3.5～4.5μm，椭圆形或卵圆形，光滑，淡锈色。丛生于阔叶树倒木或树桩上。
菌株HMGIM-W140033的分子生物学鉴定：
取新鲜菌丝使用液氮研磨，利用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒【商品编号SK8259，生工生物工程(上海)股份有限公司生产】，进行DNA基因组的提取。通过真菌核糖体基因间隔区通用引物ITS1/ITS4(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG， ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)进行材料的ITS-PCR实验，扩增在BioRad PCR仪上进行，PCR反应液组成(共50μl)为：
相关试剂(商品编号P111-01)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。反应条件为:94℃反应5min；94℃反应30sec，55℃反应30sec，72℃反应1min，32个循环；72℃反应10min。 PCR产物直接送检进行双向测序，由华大基因完成。
测序结果如下：
CGGAAGGATCATTATTGAATGAACTTGGTAGTGGTTGTAGCTGGCTCTCTCGAGA GCATGTGCACGCCCTCCCATCTTTATCTTTCCACCTGTGCACTTCTTGTAGACTTTGGGATTTGATTATCCGAGGCAACTCGGTCGTGAGGAGCTGCTGTAGCAATACGGCTCTCCTTG AACAAGTCTTTCAGAGTCTACGTTTATCATATACCCCATAGTATGTAACAGAATGTATACGATGAGCCTTAGTGCTTATAAAACTTATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGA ATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCTCAACCTTTATTAGCTTTTGCTGATAATGGCTTGGACTTGGGG GTCTTTTGCCGGCTTTTACTAGTCAGCTCCCCTTAAACGCATTAGCCGGTCACCTCTGGTGGAACCGTCTATTGGTGTGATAATTATCTACGCCGTGGACATCTGCCCTTGGAGTAGG TGTGCTGCTTCTAACCGTCTGTTCATTCGGACAATACATATGACATTTTGACCTCAAATC AGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATC(SEQ ID NO.1所示)。
测序结果在NCBI进行序列比对，发现与毛柄库恩菇(Kuehneromyces mutabilis)相似性高达99.7％。
经过形态学和分子生物学鉴定，该真菌标本宏观特征和显微特征与毛柄库恩菇(Kuehn eromyces mutabilis)描述一致，鉴定结果为毛柄库恩菇(Kuehneromycesmutabilis)，将其命名为毛柄库恩菇(Kuehneromyces mutabilis)HMGIM-W140033,其于2021年9月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院 59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No：61940。
实施例2
一、人工栽培
1生产母种
生产母种培养基配方：综合PDA(马铃薯20％+葡萄糖2％+琼脂2％+磷酸二氢钾0.3％+ 硫酸镁0.15％+维生素B1 0.001％，余量为水)。
马铃薯先洗净去皮,再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，再加入其他成分，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管，在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌20min，取出冷却摆成斜面。冷却后无菌操作接入分离成功的菌种毛柄库恩菇(Kuehneromycesmutabilis)HMGIM-W140033。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后则可进行转接。母种长满的时间大概在10-15d之间。
2.原种制作
原种培养基：配方：40％棉籽壳+40％木屑+19％麸皮+1％碳酸钙。
称取所需比例的棉籽壳，经水泡湿过夜，按比例混入木屑、麸皮、碳酸钙，装入13cm×25 cm耐高温的透明聚丙烯菌种袋中，折合每袋装干料250-300g。装好料后用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，然后在袋口套上塑料环，扣上配套的盖子，即得一个制好的原种袋料。在0.147MPa大气压、128℃高温高压湿热灭菌90min，取出冷却后无菌操作接入生产母种。接种时确保母种料块埋入原种料中。把已接种的原种置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝吃满料后(30d左右)则可作为原种使用接入栽培袋中。
3.生产种制作
制作过程同原种，但所用袋子为15cm×30cm耐高温的透明聚丙烯菌种袋。折合每袋装干料350-400g。生产种长满时间大约为30d。
4.栽培袋制作
栽培料培养基：按质量分数计，包括34％棉籽壳+56％木屑+9％麸皮+1％碳酸钙。
称取所需比例的棉籽壳，经水泡湿过夜，按比例混入木屑、麸皮、碳酸钙，装入15cm×30cm耐高温的透明聚丙烯菌种袋中，折合每袋装干料300-350g。装好料后用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，然后在袋口套上塑料环，扣上配套的盖子，即得一个制好的栽培袋料。在0.147MPa大气压、128℃高温高压湿热灭菌90min，取出冷却后无菌操作接入生产种。长满时间大约为30d。
5.栽培管理
栽培袋接种后在25℃±1℃、空气相对湿度60-70％的培养室中避光培养。待栽培袋中的菌丝长满袋中栽培料并经后熟处理(置于25℃遮光处，维持15-30天)后，打开栽培袋盖子去掉菌环，把栽培袋竖排放置(袋与袋之间应留有空隙)，置于25℃遮光处，保持95％的相对湿度，每天更换新风2次，每次1小时，维持3-4天后，控制温度20-22℃，空气相对湿度80-90％之间，每天13小时的光照，加大通风，使空气中二氧化碳浓度小于5％，约经1-2天原基即可长出。继续保持温度与湿度，提供光照，当菌盖开始平展，说明子实体已趋成熟。
二、毛柄库恩菇(Kuehneromyces mutabilis)HMGIM-W140033的总结如下：
1.毛柄库恩菇HMGIM-W140033人工驯化后子实体的性状
(1)该菌种在20℃-22℃的条件下可以正常出菇，不需要进行低温刺激，子实体发育整齐且抗逆性强，栽培得率为100％，具有较好活性。而目前报道的毛柄库恩菇子实体形成的温度是14-18℃。
(2)菌肉厚实，质地爽脆，味道鲜美，具有很好的商品特性。
2.菌株营养成分测定
对栽培子实体进行多项营养成分测定，以两个大宗食用菌金针菇及香菇作为对照。结果如表1所示，与金针菇相比，毛柄库恩菇的多糖、钾、硒含量均高于金针菇的最高值。食药用菌多糖具有天然的调节免疫、抗肿瘤、降血糖等功能，毛柄库恩菇多糖已被证实具有抑制多种肿瘤细胞增殖的活性，因此，富含多糖的毛柄库恩菇既可作为优质的食物来源，亦具有较大的药物开发价值。
表1 毛柄库恩菇的营养成分对比
注：金针菇及香菇的数据分别来源于《不同品种金针菇的营养成分分析与评价》和《我国四大产区香菇的营养成分比较》。其中香菇矿物质的检测方法为GB/T 5009.14-2003，香菇多糖的检测方法为高锰酸钾滴定法。其余与表同。
常量矿物质钾是人体必需元素之一，参与糖原的代谢过程调控细胞新陈代谢；调节渗透压，保持体内酸碱平衡；保持神经肌肉***的激动功能；修复和保护皮肤。毛柄库恩菇中钾的含量分别是金针菇及香菇中的2倍和1.6倍。因此，毛柄库恩菇可以作为一种补充钾的良好食物来源。
硒是人体必需的微量元素之一，广泛存在于人体除了脂肪以外的所有器官中，构成若干氧化酶的活性中心，增强机体的抗氧化能力；硒亦可与维生素E起协同作用，加强维生素E抗氧化作用。硒通过激活淋巴细胞的某些酶和免疫球蛋白及抗体的产生，加强淋巴细胞的抗癌作用和机体对疾病的抵抗力。此外，硒能够显著抑制肿瘤细胞的生长繁殖。毛柄库恩菇中硒含量为0.0601mg/kg,是金针菇中的3.3倍，经过与《中国食药用菌学》中的食药用的营养成分比较，毛柄库恩菇中硒的含量高于99％以上的食药用菌。因此，毛柄库恩菇可作为人体补充有机硒的优质食物来源。
其他营养成分如蛋白质、镁、钙、铁、锌等的含量与金针菇和香菇相比，虽然没有明显优势，但也处于合理范围。综上，毛柄库恩菇是富硒且富钾的优质食用菌，具有较好的食用与潜在的药用开发价值。
序列表
<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 一株富硒毛柄库恩菇新菌株及其人工栽培方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 679
<212> DNA
<213> 毛柄库恩菇(Kuehneromyces mutabilis)
<400> 1
cggaaggatc attattgaat gaacttggta gtggttgtag ctggctctct cgagagcatg 60
tgcacgccct cccatcttta tctttccacc tgtgcacttc ttgtagactt tgggatttga 120
ttatccgagg caactcggtc gtgaggagct gctgtagcaa tacggctctc cttgaacaag 180
tctttcagag tctacgttta tcatataccc catagtatgt aacagaatgt atacgatgag 240
ccttagtgct tataaaactt atacaacttt caacaacgga tctcttggct ctcgcatcga 300
tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgaa 360
tctttgaacg caccttgcgc tccttggtat tccgaggagc atgcctgttt gagtgtcatt 420
aaattctcaa cctttattag cttttgctga taatggcttg gacttggggg tcttttgccg 480
gcttttacta gtcagctccc cttaaacgca ttagccggtc acctctggtg gaaccgtcta 540
ttggtgtgat aattatctac gccgtggaca tctgcccttg gagtaggtgt gctgcttcta 600
accgtctgtt cattcggaca atacatatga cattttgacc tcaaatcagg taggactacc 660
cgctgaactt aagcatatc 679
Claims (7)
1.毛柄库恩菇(Kuehneromyces mutabilis)HMGIM-W140033,保藏编号：GDMCC No：61940。
2.一种权利要求1所述的毛柄库恩菇HMGIM-W140033的人工栽培方法，其特征在于，包括以下步骤：
将毛柄库恩菇HMGIM-W140033的生长母种接种于栽培袋中的原种培养基中进行原种培养，待菌丝吃满料后获得原种；将原种接种于栽培袋中的生产种培养基中进行生产种培养，待菌丝吃满料后获得生产种；将生产种接种于栽培袋中的栽培料培养基中培养，进行栽培管理，获得子实体；
所述的原种培养基为：按质量分数计，由38-42％棉籽壳+35-40％木屑+18-20％麸皮+1-2％碳酸钙组成；
所述的生产种培养基为：按质量分数计，由38-42％棉籽壳+35-40％木屑+18-20％麸皮+1-2％碳酸钙组成；
所述的栽培料培养基为：按质量分数计，由31-35％棉籽壳+52-56％木屑+8-10％麸皮+1-2％碳酸钙组成。
3.根据权利要求2所述的人工栽培方法，其特征在于，所述的原种培养是置于25℃下恒温暗培养。
4.根据权利要求2所述的人工栽培方法，其特征在于，所述的生产种培养是置于25℃下恒温暗培养。
5.根据权利要求2所述的人工栽培方法，其特征在于，所述的栽培管理是生产种接种后在25℃±1℃、空气相对湿度60-70％的培养室中避光培养；待栽培袋中的菌丝长满袋中栽培料并经后熟处理后，打开栽培袋盖子去掉菌环，把栽培袋竖排放置，置于25℃遮光处，保持95％的相对湿度，每天更换新风2次，每次1小时，维持3-4天后，控制温度20-22℃，空气相对湿度80-90％之间，每天13小时的光照，加大通风，使空气中二氧化碳浓度小于5％，原基长出，继续培养获得子实体，所述的后熟处理是置于25℃遮光处，维持15-30天。
6.根据权利要求2所述的人工栽培方法，其特征在于，所述的生长母种的制备方法是：将毛柄库恩菇HMGIM-W140033接种到综合PDA培养基上，置于25℃恒温暗培养，待菌丝长满斜面后获得生产母种。
7.权利要求1所述的毛柄库恩菇HMGIM-W140033在制备富硒食品中的应用。
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