CN114015584B

CN114015584B - 一种古巴栓孔菌新菌株及其人工栽培方法

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Publication number: CN114015584B
Application number: CN202111542747.6A
Authority: CN
Inventors: 胡惠萍; 吴晓贤; 陈晓光; 刘远超; 蔡曼君; 梁晓薇; 卓丽君; 王傲; 杜娜; 李向敏; 谢意珍; 吴清平; 张智
Original assignee: Guangdong Yue Microbial Technology Co ltd; Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences
Current assignee: Guangdong Yue Microbial Technology Co ltd; Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences
Priority date: 2021-12-16
Filing date: 2021-12-16
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2041-12-16
Also published as: CN114015584A

Abstract

本发明属于食药用菌栽培技术领域，公开了一种古巴栓孔菌新菌株及其人工栽培方法。所述古巴栓孔菌新菌株为Trametes cubensin HMGIM‑W150609，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62030。其人工栽培方法包括菌种分离、菌种纯化、生产母种制作、生产种制作、栽培袋制作和栽培管理步骤。本发明首次实现了针对野生的珍稀药用菌品种古巴栓孔菌(Trametes cubensin)的人工驯化栽培。经本发明方法人工栽培的古巴栓孔菌子实体性状好，多糖含量及产量较高，具有潜在的开发应用前景。

Description

一种古巴栓孔菌新菌株及其人工栽培方法

技术领域

本发明属于食药用菌栽培技术领域，具体涉及一种古巴栓孔菌新菌株及其人工栽培方法。

背景技术

在食药用菌产业蓬勃发展的今天，越来越多的珍稀食药用菌品种逐渐进入人们的视野，许多原有的珍稀品种逐渐被驯化，如竹荪、茶薪菇、离褶伞、羊肚菌等。但是也有大批的野生食药用菌由于未能被人类认识，没有得到研究。据研究，目前世界上约有300多万种真菌物种，仅仅有1％的物种被认识，其中已知的大型真菌约14000种，国内已确认的食用菌有1789种，药用菌798种，而当中又只有不到100种的野生食药用菌被人类驯化，规模化栽培的品种更只有30多种。人类距离大型真菌的研究与利用还有相当长的道路要走。随着人们生活水平的逐步上升，对于生活品质的要求更高，而大型真菌由于其富含具有营养及功能作用的各种成分，包括真菌多糖、三萜类、甾醇等，对于人体健康具有非常良好的作用，日益受到人们的重视。

栓孔菌属(Trametes)是由Fries于1836年建立的，香拴孔菌(T.suaveolens)是该属的模式种。栓孔菌属的子实体特点是：菌盖较厚，菌肉颜色为白色或乳白色，菌盖边缘钝化且硬革质，菌盖下无菌褶但有密密麻麻的小孔、和多数野生真菌一样其菌丝体在显微镜下呈锁状联合的三体系，该种类的真菌多数属性为木腐菌。大多数的栓孔菌，都生长在阳光充足的阔叶林中的树桩、倒木和腐朽的林木上，偶尔会有生长在针叶林上。栓孔菌属种类多，分布广，在我国大部分地区广泛分布。栓孔菌属中部分种具有良好的药用价值，可以用来治疗炎症、肺结核、支气管、降血糖抗癌和抗氧化等，研究表明栓孔菌对癌细胞具有一定的增殖抑制用。栓孔菌属具有一定的工业应用价值，东方栓孔菌发酵所得粗酶液对结晶紫脱色效果较好。韩国学者针对古巴栓孔菌开展了部分功能研究，发现证明其提取物对牛主动脉内皮细胞(BAEC)无细胞毒性，并能促进细胞增殖，还能诱导细胞迁移，阻断脂多糖诱导的单核细胞与BAEC的粘附。

古巴栓孔菌(Trametes cubensin)，子实体平伏至反卷，单生至覆瓦状，新鲜时呈皮革质，干燥时坚硬，重量轻；菌盖为半圆形，通常3-10×2-6×0.5-2cm；上表面触感光滑柔软，幼时为白色，成熟过程逐渐变成淡粉色，老时为浅桃红色，基部通常有红棕色区域，环带不明显，边缘通常薄，但有时也又厚又圆；菌肉淡褐色到粉棕色，呈软木栓质，最厚达8mm；子实层表面新鲜时为白色，干燥时为淡褐色，光滑，菌孔规则，圆形，4-6mm，菌管淡褐色，最长达7mm。为三系菌丝***；菌肉由菌丝不规则地紧密交织而成；生殖菌丝丰富，透明，有锁状联合，壁薄或壁厚，通常带有不规则加厚的壁，直径为2-4.2(-5.5)μm，极少量带有小的棕色的稍厚的壁，带有简单的横隔和短的突出部分，直径为1.5-2.2μm，出现在菌盖表面的淡褐色部分；骨架菌丝组成大部分菌肉，半透明至浅棕色，厚壁至实心，菌丝缠绕，末端偶尔有分枝，直径为3-6.8μm；联络菌丝很少，分枝短，半透明，厚壁至实心，直径2-6μm；菌髓菌丝相似，生殖菌丝和骨架菌丝随意交织，其中有少量联络菌丝；担子似棍棒状，9-16×4.5-7μm；担孢子)透明、薄壁、近圆柱形、4-6.5×2-2.4μm；囊泡透明，薄壁，最大达18μm长，5μm宽。与各种硬木的褐腐病有关。

通过多种细胞信号研究表明古巴栓孔菌提取物激活p38信号并产生活性氧(ROS)，且表明它诱导的血管功能是由p38信号介导的，而不是由ROS介导的。这些结果为古巴栓孔菌提取物作为心血管疾病(包括动脉粥样硬化)的预防或治疗药物的生物医学应用提供了见解。也有相关文献报道其鉴定及生物学特性研究，但进一步开发利用与驯化栽培尚未见报道。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种古巴栓孔菌新菌株。

本发明的另一目的在于提供上述古巴栓孔菌新菌株的人工栽培方法。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种古巴栓孔菌(Trametes cubensin)新菌株HMGIM-W150609，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62030。

本发明的菌株于2015年5月由胡惠萍、冯嘉淇等在江西马头山采集，经组织分离法得到其PDA纯培养物。取新鲜菌丝使用液氮研磨，利用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒进行DNA基因组的提取，得到的DNA溶液-20℃冷藏备用。通过真菌核糖体基因间隔区通用引物ITS1/ITS4(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC，进行材料的ITS-PCR实验，扩增在Biometra PCR仪上进行，PCR反应液组成(共50μl)为：

TaKaRaTaq(5units/μl) 0.25μl；

10×PCRBuffer 5μl；

dNTP Mixture(各2.5mM) 4μl；

DNA模板 2μl；

引物1(10μmol·L-1) 5μl；

引物2(10μmol·L-1) 5μl；

灭菌蒸馏水 28.75μl。

反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min，30个循环；72℃反应10min.PCR产物直接送检进行双向测序，测序结果在GenBank进行序列Blast，发现与Trametes cubensin(NCBI:txid1111947)相似性高达100％，结合形态学鉴定，该真菌标本宏观特征和显微特征与Trametes cubensin描述一致，鉴定结果为Trametescubensin。

上述古巴栓孔菌新菌株HMGIM-W150609的人工栽培方法，包括菌种分离、菌种纯化、生产母种制作、生产种制作、栽培袋制作和栽培管理步骤。

进一步地，所述菌种分离步骤如下：

将采集回来的野生子实体在无菌条件下用75％酒精擦拭表面后，撕开，以无菌操作方式在灭菌后的分离母种培养基上接入0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的内部菌肉组织，置于25℃培养箱中恒温暗培养15-20d，待菌丝长满斜面进行转接。

所述分离母种培养基为含有如下重量百分含量组成的综合PDA培养基：马铃薯20％，葡萄糖2％，琼脂2％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.15％，维生素B1微量。

进一步地，所述菌种纯化步骤如下：

将分离后的菌种转接至灭菌后的纯化母种培养基，置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取与转接。

所述纯化母种培养基为含有如下重量百分含量组成的孟加拉红培养基：蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.05％，琼脂2％，1/3000孟加拉红溶液10％，氯霉素0.01％。

进一步地，所述生产母种制作步骤如下：

在灭菌后的生产母种培养基上接入纯化后的菌种，置于25℃培养箱中恒温暗培养10-15d，待菌丝长满斜面后进行转接。

所述生产母种培养基为含有如下重量百分含量组成的加富综合PDA培养基：马铃薯20％，葡萄糖2％，蛋白胨1％，琼脂2％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.15％，维生素B1微量。

进一步地，所述生产种制作步骤如下：

在灭菌后的生产种培养基上无菌操作接入生产母种，置于25℃培养箱中恒温暗培养15-20d，待菌丝吃满料后作为生产种使用接入栽培袋中。

所述生产种培养基通过如下方法制备得到：按重量份组成将98-99％的高粱经水泡湿过夜，然后混入1-2％的碳酸钙，得到生产种培养基。

进一步地，所述栽培袋制作步骤如下：

将人工驯化培养基装入透明聚丙烯菌种袋，灭菌后无菌操作接入生产种，然后在23℃±1℃、空气相对湿度60-70％的培养室中避光培养20-25d，待菌丝吃满料后进入后熟管理程序。

所述人工驯化培养基包括如下重量份成分：20％杂木屑，30％棉籽壳，8％麦麸，10％玉米粉，1％白糖，1％石膏，30％灰树花废菌糠；水分55％-65％，pH自然。

进一步地，所述栽培管理步骤如下：

(1)原基形成：控制温度在22-29℃之间，加大通风量，将菌袋盖子去掉，空气相对湿度调整至80-90％，每天光照10h，加强通风确保二氧化碳浓度1％以下，经10～20天培养至菌丝开始扭结并形成米白色米柆状原基；

(2)子实体生长：继续控制温度在22-29℃，空气相对湿度80-90％之间，每天光照10小时，光照强度350-500lx，并保持空气中二氧化碳浓度300～500ppm，每天向幼菇喷施水雾1-2次保持空气湿润，经25-30天生长至子实体完全成熟，即可采收。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明首次实现了针对野生的珍稀药用菌品种古巴栓孔菌(Trametescubensin)的人工驯化栽培。

(2)经本发明方法可实现古巴栓孔菌人工栽培，子实体性状好，多糖含量及产量较高。

附图说明

图1为本发明古巴栓孔菌(Trametes cubensin)新菌株HMGIM-W150609的野生子实体图。

图2～4为本发明实施例2中人工驯化后的古巴栓孔菌子实体图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例为古巴栓孔菌(Trametes cubensin)新菌株HMGIM-W150609的来源及鉴定。

2015年5月胡惠萍、冯嘉淇等在江西马头山采集到一份栓孔菌标本，其野生子实体图如图1所示。经组织分离法得到其PDA纯培养物，编号为HMGIM-W150609，该菌种于2021年11月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62030。

取新鲜菌丝使用液氮研磨，利用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(商品编号SK8259，生工生物工程(上海)股份有限公司生产)，进行DNA基因组的提取，得到的DNA溶液-20℃冷藏备用。通过真菌核糖体基因间隔区通用引物ITS1/ITS4(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG(SEQ ID NO：1)，ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC(SEQ ID NO：2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)进行材料的ITS-PCR实验，扩增在Biometra PCR仪上进行，PCR反应液组成(共50μl)为：

TaKaRaTaq(5units/μl) 0.25μl；

10×PCRBuffer 5μl；

dNTP Mixture(各2.5mM) 4μl；

DNA模板 2μl；

引物1(10μmol·L^-1) 5μl；

引物2(10μmol·L^-1) 5μl；

灭菌蒸馏水 28.75μl。

相关试剂(商品编号R001A)由宝生物工程(大连)有限公司生产。反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，55℃反应1min，72℃反应1min，30个循环；72℃反应10min.PCR产物直接送检进行双向测序，由华大基因完成。其ITS序列见SEQ ID NO：3。

测序结果在GenBank进行序列Blast，发现与Trametes cubensin(NCBI:txid1111947)相似性高达100％，结合形态学鉴定，该真菌标本宏观特征和显微特征与Trametes cubensin描述一致，鉴定结果为Trametes cubensin。

实施例2

本实施例为古巴栓孔菌新菌株HMGIM-W150609的人工栽培方法。

1.母种制作

1.1菌种分离

将各营养成分及琼脂(综合PDA：马铃薯20％+葡萄糖2％+琼脂2％+磷酸二氢钾0.3％+硫酸镁0.15％+维生素B1微量)，分装试管，在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，取出冷却摆成斜面。采集回来的野生子实体在无菌条件下用75％酒精擦拭表面后，撕开，以无菌操作方式接入0.2-0.5mm×0.2-0.5mm的内部菌肉组织。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后后则可进行转接。母种长满的时间大概在15-20d之间。

1.2菌种纯化

按配方制作纯化培养基(孟加拉红培养基：蛋白胨0.5％+葡萄糖1％+磷酸二氢钾0.1％+硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.05％+琼脂2％+1/3000孟加拉红溶液10％+氯霉素0.01％+蒸馏水)，分装试管，在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，对于分离后感染细菌的菌种进行转接。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝生长而细菌尚未生长时进行尖端菌丝的挑取与转接。

1.3生产母种制作

常规制作生产母种培养基(加富综合PDA：马铃薯20％+葡萄糖2％+蛋白胨1％+琼脂2％+磷酸二氢钾0.3％+硫酸镁0.15％+维生素B1微量)，分装试管，在0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min，取出冷却无菌操作接入分离成功的菌种。置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝长满斜面后后则可进行转接。母种长满的时间大概在10-15d之间。

2生产种制作

称取所需比例的高粱，经水泡湿过夜，按比例混入碳酸钙(98-99％高粱+1-2％碳酸钙)，装入250ml锥形瓶中，折合每瓶装干料100-150g。以硅胶塞封口。在0.147MPa大气压、128℃高温高压湿热灭菌90min，取出冷却后将培养基抖散后无菌操作接入生产母种。接种时确保母种料块埋入原种料中。把已接种的原种置于25℃培养箱中恒温暗培养，待菌丝吃满料后(20d左右)则可作为生产种使用接入栽培袋中。

3.栽培袋制作

称人工驯化培养基取所需比例的培养料(20％杂木屑、30％棉籽壳，8％麦麸、10％玉米粉、1％白糖、1％石膏，30％灰树花废菌糠)，充分混合并加水(含水量为55-65％)，装入17cm×35cm耐高温的透明聚丙烯菌种袋。折合每袋装干料400-420g。装好料后用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，然后在袋口套上塑料环，扣上配套的盖子，即得一个制好的袋料。在0.147MPa大气压、128℃高温高压湿热灭菌90min，取出冷却后无菌操作接入生产种。接种后在23℃±1℃、空气相对湿度60-70％的培养室中避光培养。待菌丝吃满料后(23天左右)则可进入后熟管理程序。

4.栽培管理

4.1原基形成

去除菌种袋盖子，控制温度在22-29℃，并加大通风量，保持空间二氧化碳含量在1％以下，空气相对湿度调整至80-90％，经15天后，菌丝开始扭结并形成米白色米柆状原基。

4.2子实体生长

继续控制温度在22-29℃，空气相对湿度80-90％之间，每天光照10小时，光照强度350-500lx，并保持空气中二氧化碳浓度300～500ppm，保持空气湿润。经25-30天左右，子实体完全成熟。在此期间，每天向幼菇喷施水雾1-2次，直至子实体大小基本不变，说明子实体已趋成熟，此时应采收。

经本实施例人工栽培方法的出菇情况如下：

(1)出菇期：该品种出菇期为63-68天，只采收了头潮菇。

(2)产量：每个菇袋每潮出菇干重12-18克，平均袋产量为15克。

(3)子实体性状：子实体呈半圆形，色白，中间略有***，老熟后中间呈现褐色，有环状纹，表面略有皱褶。菌孔规则，圆形。

(4)与野生状态相比，该品种在人工驯化后子实体个体增大、均一，外形圆整，产量较高。经本实施例人工驯化的古巴栓孔菌子实体如图2～4所示。

对本发明所得菌株的主要有效成分进行测试。目前对于药用菌的有效成分的考察集中在粗多糖，对于该品种尚未有相关研究，我们针对驯化的子实体开展了多糖的检测。粗多糖的提取按照《NY T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的测定》的测定方法苯酚硫酸法进行。方法如下：

(1)样品提取：称取0.5-1.0g(本实验中取0.6g)粉碎过20mm孔径筛的样品，精确到0.001g，置于50ml具塞离心管内。用5mL水浸润样品，缓慢加入20mL无水乙醇，同时使用涡旋振荡器振摇，使混合均匀，置超声提取器中提取30min。提取结束后，于4000r/min离心10min,弃掉上清液。不溶物用10mL的80％乙醇溶液洗涤、离心。用水将上述不溶物转移入圆底烧瓶，加入50mL蒸馏水，装上磨口的空气冷凝管，于沸水浴中提取2h。冷却至室温，过滤，将上清液转移至100mL容量瓶中，残渣洗涤2-3次，洗涤液转至容量瓶中，加水定容。此溶液为样品测定液。

(2)标准曲线的制备分别吸取100mg/L标准葡萄糖工作溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL分别置20ml具塞试管中，用蒸馏水补至1.0mL，向溶液中加入1.0mL的5％苯酚溶液，然后快速加入5.0mL硫酸(与液面垂直加入，勿接触试管壁，以便与反应液充分混合)，静置10min。使用涡旋振荡器使反应液充分混合，然后将试管放置于30℃水浴中反应20min，490nm测吸光度。以葡聚糖或葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

(3)测定吸取1.00mL样品溶液于20mL具塞试管中，按照上述步骤操作，测定吸光度。同时以蒸馏水做空白试验。

(4)计算

样品中多糖含量以质量分数W计，单位以克每百克(g/100g)表示，按公式计算：

式中：

m₁：从标准曲线上查得样品测定液中含糖量，单位为微克(μg)；

V₁：样品定容体积，单位为毫升(mL)；

V₂：比色测定时所移取测定液的体积，单位为毫升(mL)；

m₂：样品质量，单位为克(g)；

0.9：葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。

计算结果保留至小数点后两位。本品按干燥品计算，含粗多糖以无水葡萄糖(C₆H₁₂O₆)计，多糖含量为7.75±0.07％，远高于药典规定的0.9％。与现有研究的其他栓孔菌相比(如下表1所示)，多糖含量相似。

表1

编号	粗多糖含量(％)
		迷宫栓孔菌Trametes gibbosa	8.051±5.1¹
东方栓孔菌Trametes orientalis	7.29±0.17²

1.张峰等.迷宫栓孔菌生物学特性、驯化栽培及抗氧化活性.菌物学报.2019,38(9):1480-1490；

2.郑义等.东方栓孔菌子实体营养成分与生物活性物质分析.食品科学.2016,37(10):139-143。

由栽培及检测结果来看，古巴栓孔菌是一个尚未开展研究的新品种，通过野生菌株的分离及人工驯化实验，可实现人工栽培，子实体性状好，多糖含量较高等特性，是一个具有潜在开发前景的菌株。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）、广东粤微生物技术有限公司

<120> 一种古巴栓孔菌新菌株及其人工栽培方法

<130> 2021-12-15

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

cgtaggtgaa cctgcggaag gatcattaac gagttttgac atgggttgta gctggcctca 60

cgaggcatgt gcacgccctg ctcatccact ctacacctgt gcacttactg taggtttggc 120

gtgggctttc ggggccttca cgggctttga gagcattctg cctgcctatg tatcactata 180

aacactacga agtaacagaa tgtaatcgcg tctaacgcat cttaatacaa ctttcagcaa 240

cggatctctt ggctctcgca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat 300

tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacctt gcgctccttg gtattccgag 360

gagcatgcct gtttgagtgt catggtattc tcaacccaca catccttgtg atgcttgtga 420

ggcttggact tggaggcttg ctggcccatc gcggtcggct cctcttgaat gcattagctt 480

ggttccttgc ggatcggctc tcagtgtgat aattgtctac gctgtgaccg tgaagcgttt 540

ggcgagcttc taaccgtcct gctagggaca acttacttga catctgacct caaatcaggt 600

aggactaccc gctgaactta agcatatcaa taagcggag 639

Claims

1.一种古巴栓孔菌(Trametescubensin)新菌株HMGIM-W150609，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:62030。