CN114163554A - 一步法制备聚多巴胺-两性离子聚合物含铜抗菌涂层及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一步法制备聚多巴胺‑两性离子聚合物含铜抗菌涂层及其应用，先制备以酚羟基为端基两性离子聚合物，再与多巴胺混合均匀溶解于碱性缓冲溶液中，进而再加入硫酸铜和过氧化氢形成涂层溶液，最后将植入医疗材料浸入其中，即可在医疗材料表面形成抗菌涂层。硫酸铜与过氧化氢体系可产生大量自由基的加速聚合反应，在极短时间内可达到良好的修饰效果从并且增加了涂层的稳定性。该发明的涂层具备良好的生物相容性以及极佳的抗菌效果，加入CuSO₄/H₂O₂后涂层更加稳定，且加强了涂层的抗菌效果。

Description

一步法制备聚多巴胺-两性离子聚合物含铜抗菌涂层及其 应用

技术领域

本发明涉及高分子材料和医用植入物领域，具体涉及两性离子聚合物的制备及其应用于医用植入器械。

背景技术

近年来，医用植入材料在临床上大量应用，然而术后感染是医用植入材料应用中的最主要风险来源。在植入过程中，细菌很容易粘附在植入体表面，粘附的细菌会迅速增殖并分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕而形成的大量细菌聚集的膜样物，即细菌生物膜(菌膜)。菌膜为细菌的庇护所，显著增强细菌对抗菌药物的抗性和对宿主免疫***的逃避能力，引发顽固性和复发性的感染。为解决这些问题，目前临床上常用的治疗方法是使用抗生素。但是，抗生素的过度使用可能会对人体造成不可避免的损害以及诱导细菌产生耐药性。因此，赋予植入材料良好的生物相容性和抗菌性能，对其安全、长期的应用具有重要的临床意义。

研究表明，两性离子材料具有绝佳的抗污性及亲水性，适合用于表面改性制备抗菌涂层。两性离子具有等量的阴、阳离子，整体呈电中性。两性离子材料可以通过带电端基官能团的溶剂化作用和氢键作用形成致密、稳定的水化层，对细菌的黏附产生了物理及能量上的障碍，可减少材料表面黏附的细菌，进而抑制生物膜的形成，以达到抗菌的效果。将两性离子聚合物接枝到表面的一种方法是使用含有大量邻苯二酚基团的仿生材料多巴胺，可在氧气存在的弱碱条件下氧化自聚合形成聚多巴胺，牢固地附着在大多数表面上。尽管聚多巴胺在表面改性上具有普适性及简易性，但是多巴胺自聚合速度缓慢，反应时间通常长达一天至数天，这极大的限制了其使用范围。近年来，研究者们尝试用添加氧化剂的方法来加速多巴胺(DOPA)的自聚合过程，并提高聚合物的稳定性。其中，硫酸铜作为氧化剂的一种，也常用作无机抑菌剂，其内含的铜离子，可破坏细菌内的蛋白质，抑制细菌生长。因此，如何利用铜离子应用于高分子材料及其医用植入物，值得深入研究。

现有技术如中国专利文献CN112717207A公开的仿生多巴胺长效抗菌多功能涂层，直接将两性离子单体与多巴胺共混，这样的聚合反应难以控制，且稳定性欠佳，抗菌性能仍然未得到解决。再如中国专利文献CN105112894A公开的多巴胺对无机粒子进行表面化学镀铜方法，采用两步法制备聚多巴胺抗菌涂层，先在基底上制备聚多巴胺涂层作为中间层，再在聚多巴胺涂层上聚合抗菌涂层，此法较为繁琐，反应时间长。也有出现了一步法制备聚多巴胺-两性离子聚合物抗菌涂层，如中国专利文献CN110433530A公开的将硫酸铜、过氧化氢、多巴胺和两性离子单体一起加入到Tris缓冲溶液，直接将两性离子单体与硫酸铜共混，但该方法氧化聚合反应效率低，聚合程度不等，难以形成均匀的涂层。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种聚合快速、稳定、抗菌效果得以增强、无毒性的一步法制备聚多巴胺-两性离子聚合物含铜抗菌涂层及其应用。

为克服该技术缺陷，本发明采用的技术方案是：一步法制备聚多巴胺-两性离子聚合物含铜抗菌涂层，先配制缓冲溶液，再将多巴胺、两性离子聚合物和电解质均匀溶解于缓冲溶液中，进而再加入硫酸铜和过氧化氢形成混合溶液，最后将植入医疗材料浸入混合溶液中，聚合反应后在植入医疗材料表面得到抗菌涂层。

优选地，所述多巴胺、两性离子聚合物、电解质、硫酸铜和过氧化氢的浓度分别为：多巴胺1～5mg/ml、两性离子聚合物1～5mg/ml、电解质1～10mg/ml、硫酸铜2～10mg/ml、过氧化氢1～5mg/ml。

优选地，所述两性离子聚合物的制备方法是：首先，将多巴胺盐酸盐、叔丁基二甲氯硅烷和咪唑溶解于第一溶剂中，在氮气条件下反应，将浓缩的有机相溶液通过硅胶色谱法进行纯化，将剩余的溶液继续浓缩，干燥后得到中间产物；接着，将中间产物和三乙胺溶解于第二溶剂中，逐渐加入2-溴异丁酰溴搅拌反应，将浓缩的有机相溶液通过硅胶色谱法进行纯化，将剩余的溶液继续浓缩，干燥后得到引发剂；接着，两性离子单体、氯化铜、五甲基二乙烯三胺、抗坏血酸和引发剂在第三溶剂中搅拌溶解，在氮气条件下反应，得到端基保护的两性离子聚合物；最后，将端基保护的两性离子聚合物溶解于四丁基氟化铵溶液中，透析后干燥得到酚羟基为端基的两性离子聚合物。

优选地，所述两性离子单体为甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱(SBMA)、甲基丙烯酰乙基羧基甜菜碱(CBMA)、2－甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)或三甲胺-两性离子化合物(TMAO)。

优选地，所述混合溶液还包括硝酸银，硝酸银的浓度为2～10mg/ml。

同时，本发明采用的技术方案是：一种聚多巴胺-两性离子聚合物含铜抗菌涂层的应用，聚多巴胺-两性离子聚合物含铜抗菌涂层修饰植入医疗材料的表面。

实施本发明技术方案，采用一步法即是将多巴胺、以酚羟基为端基两性离子聚合物和硫酸铜、过氧化氢共混聚合反应，由于没有反应中间层且不是直接利用两性离子单体，以酚羟基为端基的两性离子聚合物与多巴胺的碱性环境中，在硫酸铜与过氧化氢产生大量自由基的协同作用下快速诱导聚多巴胺-两性离子氧化聚合反应，在极短时间内达到良好修饰效果从而将两性离子聚合物牢固地锚定在基底上，多巴胺醌的环化和共价连接都会降低C-H的比率，这两种反应产生许多共价部分，使得加入CuSO4/H2O2后涂层更加稳定，额外引入金属铜离子，加强了涂层的抗菌效果且对细胞无明显毒性，广泛应用于植入医疗材料基底。

附图说明

图1为聚多巴胺-两性离子聚合物的反应过程图。

图2是聚多巴胺-两性离子聚合物含铜抗菌涂层的反应过程图。

图3是中间产物和引发剂的核磁共振氢谱图。

图4是中间产物和引发剂的质谱图。

图5是PSB/PDA+CuSO4/H₂O₂抗菌涂层表面的SEM图。

图6是PSB/PDA+CuSO4/H₂O₂抗菌涂层表面的XPS谱图。

图7是不同组分涂层的亲水性实验评价图。图中的PSB/PDA指现有技术的两性离子(不含铜)涂层。PSB/PDA+CuSO4/H2O2抗菌涂层的水接触角为20°证明比现有技术的聚合反应快。

图8是PSB/PDA+CuSO4/H2O2抗菌涂层的细胞安全性实验评价图。L929成纤维细胞/HEI-OC1耳蜗前体细胞在抗菌涂层组与对照组上的细胞存活率无统计学差异，说明涂层的生物相容性好。

图9是不同组分涂层抗金黄色葡萄球菌效果对比。将金黄色葡萄球菌分别接种于不同涂层上，PSB/PDA+CuSO4/H₂O₂抗菌涂层材料有明显抑制金黄色葡萄球菌的作用。

图10是不同组分涂层抗铜绿假单孢杆菌效果对比。将铜绿假单孢杆菌分别接种于不同涂层上，PSB/PDA+CuSO4/H2O2抗菌涂层材料有明显抑制铜氯假单胞杆菌的作用。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

一步法制备聚多巴胺-两性离子聚合物含铜抗菌涂层，首先使用甲醇、水依次清洗基底，待干燥后使用乙醇预激活各类基底；将两性离子聚合物、多巴胺、氯化钠溶于碱性Tris溶液，再加入硫酸铜和过氧化氢，即可制得涂层溶液；最后将基底投入涂层溶液，1小时即可在基底表面形成抗菌涂层，此发明可有效避免临床中常见的植入物感染的问题。氯化钠可以采用氯化钙、氯化钾和硫酸钠等强电解质代替。

步骤一、制备酚羟基为端基的两性离子聚合物(见图1)

1、在冰浴中，将多巴胺盐酸盐1.89g、叔丁基二甲基硅氯烷4.52g和咪唑3.4g溶解在30ml二氯甲烷溶液中，待反应结束后，撤冰浴，在氮气条件下25℃反应2h。离心去除反应后的混合溶液中的沉淀，提取上清并萃取分离出有机相，再用旋蒸法浓缩。浓缩后的溶液再通过硅胶色谱法(二氯甲烷：甲醇，v/v＝4：1)进行纯化，再将纯化后的溶液进行浓缩，真空干燥8小时后得到中间产物，呈黄色油状液体。

2、将中间产物1.9g、三乙胺0.61g溶解在15ml的二氯甲烷中，再逐滴加入2-溴异丁酰溴1.38g，在冰水浴下搅拌1h后，再在25℃条件下继续反应24h。在反应结束后的溶液中加入20ml去离子水后，萃取并分离出有机相，旋蒸浓缩后，再通过硅胶色谱法(正己烷：乙酸乙酯，v/v＝4：1)进行纯化，再将纯化后的溶液进行浓缩，真空干燥8h后得到引发剂，呈白色结晶状固体。

3、将甲基丙烯酸甜菜碱30mmol、氯化铜0.2mmol、五甲基二乙烯三胺0.35mmol、抗坏血酸0.4mmol和引发剂0.3mmol在50ml的甲醇和水(v/v＝1:1)的溶剂中充分搅拌溶解后，再将该反应溶液在50℃条件反应36h。将最终得到的聚合物通过甲醇溶液清洗三次后，真空干燥8h。

4、将聚合物溶于1M四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液中，搅拌24h之后，真空干燥10h，最终获得两性离子聚合物(PSBMA)。

步骤二、一步法修饰基底表面(见图2)。将基底使用无水乙醇预激，配制三羟甲基氨基甲烷TRIS(pH8.5)缓冲溶液10mM，并将多巴胺、两性离子聚合物、氯化钠分别以1mg/ml、5mg/ml、9mg/ml的浓度在其中进行搅拌溶解，最后在体系中加入19.6mM硫酸铜CuSO4和5mM过氧化氢H₂O₂，加速聚合。将不同基底的植入医疗材料置于上述混合溶液中浸泡沉积1h。最后，用去离子水清洗未结合的分子得到抗菌涂层(PSB/PDA+CuSO4/H₂O₂)的植入医疗材料，涂层后的植入医疗材料保存在0.9％的生理盐水中。

上述是一步法制备聚多巴胺-两性离子聚合物含铜抗菌涂层的第一实施例，其中的步骤二(一步法修饰基底表面)还可以有第二实施例和第三实施例。

第二实施例的一步法修饰基底表面的过程是：将基底使用无水乙醇预激，配制三羟甲基氨基甲烷TRIS(pH8.5)缓冲溶液10mM，并将多巴胺、两性离子聚合物、氯化钙分别以2mg/ml、3mg/ml、9mg/ml的浓度在其中进行搅拌溶解，最后在体系中加入19.6mM硝酸银AgNO3和2mM过氧化氢H₂O₂，加速聚合。将不同基底的植入医疗材料置于上述混合溶液中浸泡沉积1h。最后，用去离子水清洗未结合的分子得到抗菌涂层(PSB/PDA+AgNO3/H₂O₂)的植入医疗材料，涂层后的植入医疗材料保存在0.9％的生理盐水中。

第三实施例的一步法修饰基底表面的过程是：将基底使用无水乙醇预激，配制三羟甲基氨基甲烷TRIS(pH8.5)缓冲溶液10mM，并将多巴胺、两性离子聚合物、氯化钾分别以5mg/ml、1mg/ml、10mg/ml的浓度在其中进行搅拌溶解，最后在体系中加入19.6mM氯化铜CuCl2和3mM过氧化氢H₂O₂，加速聚合。将不同基底的植入医疗材料置于上述混合溶液中浸泡沉积1h。最后，用去离子水清洗未结合的分子得到抗菌涂层的植入医疗材料，涂层后的植入医疗材料保存在0.9％的生理盐水中。

以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一步法制备聚多巴胺-两性离子聚合物含铜抗菌涂层，其特征在于：先配制缓冲溶液，再将多巴胺、两性离子聚合物和电解质均匀溶解于缓冲溶液中，进而再加入硫酸铜和过氧化氢形成混合溶液，最后将植入医疗材料浸入混合溶液中，聚合反应后在植入医疗材料表面得到抗菌涂层。

2.根据权利要求1所述的一步法制备聚多巴胺-两性离子聚合物含铜抗菌涂层，其特征在于：所述多巴胺、两性离子聚合物、电解质、硫酸铜和过氧化氢的浓度分别为：多巴胺1～5mg/ml、两性离子聚合物1～5mg/ml、电解质1～10mg/ml、硫酸铜2～10mg/ml、过氧化氢1～5mg/ml。

3.根据权利要求1所述的一步法制备聚多巴胺-两性离子聚合物含铜抗菌涂层，其特征在于：所述两性离子聚合物的制备方法是：首先，将多巴胺盐酸盐、叔丁基二甲氯硅烷和咪唑溶解于第一溶剂中，在氮气条件下反应，将浓缩的有机相溶液通过硅胶色谱法进行纯化，将剩余的溶液继续浓缩，干燥后得到中间产物；

接着，将中间产物和三乙胺溶解于第二溶剂中，逐渐加入2-溴异丁酰溴搅拌反应，将浓缩的有机相溶液通过硅胶色谱法进行纯化，将剩余的溶液继续浓缩，干燥后得到引发剂；

接着，两性离子单体、氯化铜、五甲基二乙烯三胺、抗坏血酸和引发剂在第三溶剂中搅拌溶解，在氮气条件下反应，得到端基保护的两性离子聚合物；

最后，将端基保护的两性离子聚合物溶解于四丁基氟化铵溶液中，透析后干燥得到酚羟基为端基的两性离子聚合物。

4.根据权利要求3所述的一步法制备聚多巴胺-两性离子聚合物含铜抗菌涂层，其特征在于：所述两性离子单体为甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱(SBMA)、甲基丙烯酰乙基羧基甜菜碱(CBMA)、2－甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)或三甲胺-两性离子化合物(TMAO)。

5.根据权利要求1所述的一步法制备聚多巴胺-两性离子聚合物含铜抗菌涂层，其特征在于：所述混合溶液还包括硝酸银，硝酸银的浓度为2～10mg/ml。

6.一种聚多巴胺-两性离子聚合物含铜抗菌涂层的应用，其特征在于：聚多巴胺-两性离子聚合物含铜抗菌涂层修饰植入医疗材料基底的表面。

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