CN114107218B - 一株分泌山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用 - Google Patents
一株分泌山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114107218B CN114107218B CN202111474497.7A CN202111474497A CN114107218B CN 114107218 B CN114107218 B CN 114107218B CN 202111474497 A CN202111474497 A CN 202111474497A CN 114107218 B CN114107218 B CN 114107218B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- goat
- tumor virus
- monoclonal antibody
- intranasal
- hybridoma cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000283707 Capra Species 0.000 title claims abstract description 48
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 45
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 39
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims abstract description 32
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 abstract description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 13
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 10
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical group P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 229940100656 nasal solution Drugs 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 241001149897 Plethobasus cyphyus Species 0.000 description 2
- 208000004062 Tumor Virus Infections Diseases 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 1
- 241001231757 Betaretrovirus Species 0.000 description 1
- 241000283705 Capra hircus Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000907514 Entebbe bat virus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 241001148556 Mycoplasma ovipneumoniae Species 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 206010042682 Swelling face Diseases 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 208000002399 aphthous stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 125000005587 carbonate group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/35—Valency
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及细胞工程技术领域。本发明提供了一株分泌山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用，所述杂交瘤细胞的保藏名称为杂交瘤细胞系6E4，保藏日期：2021年10月27日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:C202181。本发明的单克隆抗体特异性好，抗体效价高达1:819200，纯化方法简单，纯度高，可用于制备山羊地方性鼻内肿瘤病毒ELISA等快速检测试剂盒，适用于山羊地方性鼻内肿瘤病毒病的临床快速检测，对山羊地方性鼻内肿瘤病毒病的净化具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，尤其涉及一株分泌山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用。
背景技术
山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)属于反转录病毒科正反转录病毒亚科β反转录病毒属B/D型反转录病毒，病毒粒子呈球形，病毒的基因组是单股正链线性RNA，长约7.5kb。ENTV-2是山羊(Capra hircus)地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor，ENT)的病原。山羊地方性鼻内肿瘤是一种患病羊以流鼻液、面部肿胀、体重减轻，剖检可见鼻腔内一侧或两侧类似菜花状肿瘤为特征的慢性接触性传染病，该病发病率为1％～40％，病死率为100％，该病潜伏期长达数月甚至数年，该病在亚洲、欧洲都有发生，给世界养羊业造成较严重的经济损失。我国于1995年首次报道了内蒙古山羊发生了该病，随后，湖南、四川和陕西等地均有该病发生的报道。
目前，ENTV-2尚无体外培养***，限制了该病原的研究，目前国内外均无能预防该病的疫苗，给该病的防治带来巨大困难。目前唯一的方法就是通过检测病原，淘汰带毒羊群实现该病的净化。然而目前的检测方法仅限于PCR方法，未有免疫学检测方法。而获得能稳定分泌山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株对建立免疫学检测方法及其它快速检测方法都至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一株分泌山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用，为建立快速检测山羊地方性鼻内肿瘤病毒的免疫学方法奠定基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株分泌山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞的保藏名称为杂交瘤细胞系6E4，保藏日期：2021年10月27日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:C202181。
本发明还提供了所述杂交瘤细胞分泌的山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体。
本发明还提供了所述的山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体在制备山羊地方性鼻内肿瘤病毒检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种山羊地方性鼻内肿瘤病毒感染检测试剂盒，所述试剂盒中包含山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体。
作为优选，所述试剂盒中还包括包被缓冲液、封闭液、稀释液、PBST洗涤液、过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、TMB显色液、2％H2SO4。
本发明提供了一株分泌山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用，所述杂交瘤细胞的保藏名称为杂交瘤细胞系6E4，保藏日期：2021年10月27日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:C202181。本发明的单克隆抗体特异性好，抗体效价高达1:819200，纯化方法简单，纯度高，可用于制备山羊地方性鼻内肿瘤病毒ELISA等快速检测试剂盒，适用于山羊地方性鼻内肿瘤病毒病的临床快速检测。
附图说明
图1为单克隆抗体亚类鉴定结果；
图2为纯化的单克隆抗体SDS-PAGE分析结果。
保藏说明
杂交瘤细胞系6E4，该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2021年10月27日，保藏编号为：CCTCC NO:C202181。
具体实施方式
本发明提供了一株分泌山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞的保藏名称为杂交瘤细胞系6E4，保藏日期：2021年10月27日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:C202181。
本发明还提供了所述杂交瘤细胞分泌的山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体。
本发明还提供了所述的山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体在制备山羊地方性鼻内肿瘤病毒检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种山羊地方性鼻内肿瘤病毒感染检测试剂盒，所述试剂盒中包含山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体。
在本发明中，所述试剂盒中还包括包被缓冲液、封闭液、稀释液、PBST洗涤液、过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、TMB显色液、2％H2SO4。
在本发明中，所述包被缓冲液优选为0.04～0.06mol/L的碳酸盐缓冲液，进一步优选为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。
在本发明中，所述封闭液优选为1～5％牛血清白蛋白，进一步优选为3％牛血清白蛋白。
在本发明中，所述稀释液优选为PBS。
在本发明中，所述PBS的pH值优选为7.0～7.5，进一步优选为7.2。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)单克隆抗体的制备
1.免疫原的制备
纯化后的病毒作为免疫抗原。收集山羊地方性鼻内肿瘤病(Enzootic nasaladenocarcinoma,ENA)的自然感染病例的山羊鼻液，用PBS将鼻液1:1稀释，充分搅拌均匀；鼻液经6000r/min，4℃，离心20min，取上清液；上清液12000r/min，4℃，离心30min，弃沉淀取上清；上清液4℃离心3h，转速为36000r/min，弃去上清液。沉淀用PBS缓冲液溶解，置4℃冰箱备用；依次向管底注入60％、50％、40％、30％和20％的蔗糖，再加入病毒。然后，于4℃、36000r/min蔗糖密度梯度离心4h。小心吸取40％-50％蔗糖带(含病毒)，加适量PBS，4℃，38000r/min离心2h，弃上清液。用PBS重悬，获得纯化的病毒。
2.动物的免疫
取6-8周龄的雌性Balb/c小鼠4只进行免疫，前三次免疫时，蛋白与佐剂等体积混合，第三次免疫7d后，采血，分离血清，测定效价，当ELISA效价大于1:5000时，即用于细胞融合。融合前3d，加强免疫。免疫程序见表1，3d后用于细胞融合。
表1
| 免疫时间 | 佐剂 | 免疫量 | 免疫方式 |
| 6周龄 | 弗氏完全佐剂 | 100μg/只 | 皮下多点注射 |
| 8周龄 | 弗氏不完全佐剂 | 120μg/只 | 皮下多点注射 |
| 10周龄 | 弗氏不完全佐剂 | 120μg/只 | 皮下多点注射 |
| 融合前3d | 无佐剂 | 100μg/只 | 腹腔注射 |
3.杂交瘤细胞株的建立
3.1骨髓瘤细胞准备
取处于对数生长期的SP2/0细胞6瓶，融合时用DMEM不完全培养液将细胞从细胞瓶壁洗下，所有SP2/0细胞收集到50mL灭菌离心管中，1200rpm离心10min，收集细胞沉淀，计数。
3.2脾细胞制备
取抗体效价>1:102400，且经过加强免疫的BALB/c小鼠2只，摘除眼球采血，分离血清作为单抗检测时阳性对照血清。拉颈处死小鼠，浸泡在乙醇中消毒5min。在无菌操作台上，将小鼠固定于塑料板上，掀开腹部皮肤及腹膜，暴露脾脏。用眼科剪、眼科镊取出脾脏，并移至灭菌平皿中，在平皿中加少量不完全培养液，用200目铜网将脾细胞挤压到不完全培养液中，然后小心吸到50mL灭菌离心管中，1300rpm离心8min，收集沉淀下来的细胞，记数。
3.3细胞融合
于细胞融合前一天制备饲养细胞，用HAT培养液调成2*105个/mL的细胞悬液，分装到细胞融合板上，1滴/孔。37℃，5％CO2培养备用。脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以7：1混合，融合剂为50％的PEG1500，接种于96孔细胞培养板，于37℃、5％CO2。融合后培养3天，观察细胞生长情况，5天后用HAT培养基换出1/2培养基。7-10天后用HT培养基换出HAT培养基，两周后换为普通DMEM完全培养液(含10％胎牛血清、1％双抗)。待细胞覆盖孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
3.4阳性杂交瘤细胞的筛选
取其上清液用建立的间接ELISA方法进行检测，检测阳性的细胞进行扩大培养并克隆。间接ELISA方法：包被ENTV-2纯化病毒(0.5μg/孔)，4℃包被过夜，用PBST洗涤3次，加入杂交瘤细胞的培养上清液，37℃孵育45min，用PBST洗涤3次，加入1：12000稀释的过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，置于37℃孵育45min，用PBST洗涤3次，加入底物TMB显色10min，终止反应后在酶标仪上测定OD450值。经过3次亚克隆，筛选到分泌山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为6E4。
4.小鼠腹水的制备及抗体效价测定
取BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌弗式不完全佐剂0.5mL/只，1周后向小鼠腹腔注射6E4单克隆抗体杂交瘤细胞106个/只(不含血清)，1周左右可见小鼠腹腔明显膨大，此时抽取小鼠腹水，3000r/min离心10min，取上清液，弃掉沉淀。取其上清液用建立的间接ELISA方法进行检测，测定结果以P/N≥2.1的抗体最大稀释度作为抗体效价的终值，结果显示检测的抗体效价为1:819200。
5.单克隆抗体亚类鉴定
参照Mouse MonoclonalAntibody Isotyping Kit试剂盒说明书，6E4腹水1：20000稀释，测定腹水的亚类。6E4这株单克隆抗体的亚类鉴定结果为κ链、IgG1亚型(见图1)。
6.腹水的纯化
参照
ProteinA Resin(北京全式金生物技术有限公司)试剂盒说明书进行纯化。纯化的6E4单克隆抗体进行变性SDS-PAGE分析，结果见图2。
7.单克隆抗体特异性检测
包被：以ENTV-2纯化病毒、ENTV-2患病羊鼻液、羊口疮病毒、绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、含10％胎牛血清的DMEM、PBS、ddH2O包被ELISA板，100μL/孔，4℃包被过夜，用PBST洗涤液洗涤5次，拍干。封闭：加入封闭液，200μL/孔，37℃封闭2h，吸弃。一抗：加入6E4纯化的单克隆抗体(1.5μg/孔)，37℃孵育45min，用PBST洗涤液洗涤5次，拍干。二抗：加入过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(1:12000稀释)，37℃孵育45min，用PBST洗涤液洗涤5次，拍干。显色：加入TMB显色液，100μL/孔，孵育10min。终止：加入2％H2SO4，50μL/孔，450nm读取OD值。结果显示：该单克隆抗体只能与ENTV-2纯化病毒以及ENTV患病羊鼻液反应，与阴性对照及空白对照均无反应。说明6E4单克隆抗体对ENTV-2病毒具有特异性。
实施例2检测山羊地方性鼻内肿瘤病毒(EVTV-2)的试剂盒及使用方法
1、包被抗原：用包被缓冲液分别稀释ENTV-2患病羊鼻液、阳性对照(ENTV-2纯化病毒(20μg/mL)、鼻液样品1-8(通过荧光定量PCR验证均为ENTV-2阳性)、鼻液样品9-18(通过荧光定量PCR验证均为ENTV-2阴性)以及空白对照，稀释时包被缓冲液和被稀释样品按照体积比3:1混合，100μL/孔，4℃包被过夜。用PBST洗涤液洗涤5次，拍干；
2、封闭：加入封闭液，200μL/孔，37℃孵育45min，用PBST洗涤液洗涤5次，拍干；
3、加一抗：加入6E4纯化的单抗(0.7μg/孔)，37℃孵育45min，用PBST洗涤液洗涤5次，拍干；
4、加二抗：加入1:6000稀释的过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，100μL/孔，37℃孵育45min，用PBST洗涤液洗涤5次；
5、显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃孵育10min；
6、终止：加入2％H2SO4，50μL/孔；
7、读数：酶标仪OD450读取OD值。
8、结果判定：OD450值≥0.3220时判定为EVTV-2阳性，否则，判为EVTV-2阴性。(ELISA结果与荧光定量PCR结果相符合)
由以上实施例可知，本发明提供了一株分泌山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用，所述杂交瘤细胞的保藏名称为杂交瘤细胞系6E4，保藏日期：2021年10月27日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:C202181。本发明的单克隆抗体特异性好，抗体效价高达1:819200，纯化方法简单，且纯度高，可用于制备山羊地方性鼻内肿瘤病毒ELISA等快速检测试剂盒，适用于山羊地方性鼻内肿瘤病毒病的临床快速检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一株分泌山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞的保藏名称为杂交瘤细胞系6E4，保藏日期：2021年10月27日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:C202181。
2.权利要求1所述杂交瘤细胞分泌的山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体。
3.权利要求2所述的山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体在制备山羊地方性鼻内肿瘤病毒检测试剂盒中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111474497.7A CN114107218B (zh) | 2021-12-03 | 2021-12-03 | 一株分泌山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111474497.7A CN114107218B (zh) | 2021-12-03 | 2021-12-03 | 一株分泌山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114107218A CN114107218A (zh) | 2022-03-01 |
| CN114107218B true CN114107218B (zh) | 2023-07-14 |
Family
ID=80366657
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111474497.7A Active CN114107218B (zh) | 2021-12-03 | 2021-12-03 | 一株分泌山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114107218B (zh) |
-
2021
- 2021-12-03 CN CN202111474497.7A patent/CN114107218B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114107218A (zh) | 2022-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101825633B (zh) | 用于检测非洲猪瘟病毒的竞争elisa试剂盒 | |
| CN105348372A (zh) | 一种猪伪狂犬病毒的检测方法 | |
| CN101597334A (zh) | 蓝舌病病毒单克隆抗体及制备方法和应用 | |
| CN106589124A (zh) | Cd146单克隆抗体在胶质瘤血管周细胞检测及分离鉴定中的应用 | |
| CN114107218B (zh) | 一株分泌山羊地方性鼻内肿瘤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用 | |
| CN101671655B (zh) | 一种艾滋病毒p24的单克隆抗体杂交瘤细胞及应用 | |
| CN113801854B (zh) | 分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其应用 | |
| AU603774B2 (en) | Specific mycoplasma membrane antigen and antibody and their clinical applications | |
| CN113980908B (zh) | 一种胸膜肺炎放线杆菌ApxIV蛋白单克隆抗体及其阻断ELISA试剂盒 | |
| CN102391993B (zh) | 布鲁氏菌检测用杂交瘤细胞株17c8及其产生的单克隆抗体 | |
| CN116338193A (zh) | 一种基于抗体捕获的非洲马瘟间接elisa抗体检测试剂盒及其应用 | |
| CN111825764B (zh) | 一种犬种布鲁氏菌单克隆抗体及其应用 | |
| CN110607282B (zh) | 牛细小病毒单克隆抗体及其在检测牛细小病毒感染中的应用 | |
| CN116444673B (zh) | 人源膜cd14单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN112898419B (zh) | 用于检测高致病性prrsv的单克隆抗体及应用 | |
| CN110452883A (zh) | 禽白血病p27蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN114231496B (zh) | 马流产沙门氏菌竞争elisa抗体检测试剂盒及其应用 | |
| CN110256555A (zh) | 一种丝状支原体簇单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN114507644B (zh) | 一种副猪嗜血杆菌MnSOD蛋白单克隆抗体及其阻断ELISA试剂盒 | |
| CN116621976B (zh) | 抗PDCoV核衣壳蛋白的单克隆抗体2H7及其应用方法 | |
| CN112946285B (zh) | 检测高致病性prrsv感染的elisa试剂盒 | |
| CN104046594B (zh) | 一种羊口疮病毒蛋白orfv086单克隆抗体杂交瘤细胞株2g8d10及其单克隆抗体 | |
| CN116948032B (zh) | 人源cd4单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN114075551B (zh) | 沙林鼠种布鲁氏菌脂多糖的单克隆抗体及应用 | |
| CN116731186B (zh) | 抗人IgG-Fc兔单克隆抗体及其制备方法、多核苷酸分子、表达载体和宿主细胞 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |