CN114085293A

CN114085293A - 用于预防禽安卡拉病的重组蛋白及构建方法和应用

Info

Publication number: CN114085293A
Application number: CN202111344248.6A
Authority: CN
Inventors: 任洪林; 郭珣; 柳溪林; 胡盼; 卢士英; 柳增善; 李岩松; 张英; 祝万菊; 闫守庆
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2021-11-14
Filing date: 2021-11-14
Publication date: 2022-02-25
Anticipated expiration: 2041-11-14
Also published as: CN114085293B

Abstract

本发明涉及一种用于预防禽安卡拉病的重组蛋白及构建方法和应用，属于基因工程生物医药技术领域。分别构建并化学合成4型禽腺病毒四种结构蛋白的多抗原表位串联蛋白的编码DNA，再将这四种多抗原表位串联蛋白的编码DNA连接，获得编码多联融合重组蛋白的基因，构建用于大肠杆菌原核表达***的重组表达质粒，并转入大肠杆菌感受态细胞，获得大肠杆菌基因工程表达菌，并诱导表达和大量纯化多联融合重组蛋白，将多联融合重组蛋白与免疫佐剂混合制备禽安卡拉病多表位亚单位疫苗。本发明亚单位疫苗具有强免疫原性，能够刺激机体产生保护性抗体，且抗体维持时间长，可以有效预防禽4型腺病毒感染发病，对禽安卡拉病具有预防保护作用。

Description

用于预防禽安卡拉病的重组蛋白及构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程生物医药技术领域，具体涉及一种用于预防禽安卡拉病的多联融合重组蛋白及构建方法与应用。

背景技术

禽安卡拉病由禽安卡拉病毒引起的一种家禽疫病，该病对3-6周龄的肉鸡影响尤为显著，种鸡和蛋鸡亦可在相似年龄段发病，死亡率高达20％-80％。禽安卡拉病毒是禽腺病毒科Ⅰ亚群禽腺病毒属禽腺病毒C种血清型4型病毒(FAdV-4)。根据群特异性抗原的不同，将禽腺病毒分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个亚群，Ⅰ亚群有A、B、C、D、E五个种，12个血清型(FAdV-1、2、3、4、5、6、7、8a、8b、9、10、11)。该群病毒在鸡、鸭、猪体内普遍存在，常呈隐性感染，作为继发病原共同作用于家禽，并能垂直传播，污染鸡胚。该病于1987年3月在巴基斯坦的安卡拉地区发现，2015年以来，在我国山东、辽宁、吉林、河北等地区暴发，给我国养禽业造成巨大的经济损失。目前，有效预防该病的疫苗较少，抗生素及抗病毒药物对该病疗效不大，没有特效药物，常造成该病防控不利。

安卡拉病毒为DNA病毒,病毒粒子无囊膜成球形，呈二十面体对称结构。粒子直径一般在70-90nm,由252个衣壳粒构成，其中12个顶角壳粒为五邻体(Penton)，240个非顶角壳粒为六邻体(Hexon)和纤突蛋白(Fiber1、Fiber2)。五邻体、六邻体、纤突蛋白是病毒的衣壳蛋白，具有免疫原性。五邻体蛋白与纤突蛋白在病毒吸附、进入细胞的过程中发挥作用，且能有效刺激机体产生体液免疫，诱导中和抗体产生。六邻体蛋白含有特异性抗原决定簇，是抗体的中和目标，与致病性关系密切。

由于禽安卡拉病发病快、死亡率高，扩散能力强，可垂直传播和水平传播，已对养禽业造成巨大危害。因此，为解决这个问题，迫切需要研制开发一种新型有效的疫苗。目前预防该病主要靠灭活苗和弱毒苗，但是这两种疫苗存在很多的缺点，存在保护效果不稳定、易引起继发感染、毒力返强等问题。

发明内容

本发明提供一种用于预防禽安卡拉病的重组蛋白及构建方法和应用，以解决目前灭活苗和弱毒苗存在的保护效果不稳定、易引起继发感染、毒力返强等问题。制备禽安卡拉病亚单位疫苗，应用于预防禽安卡拉病。

本发明采取的技术方案是：

用于预防禽安卡拉病的重组蛋白为多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述重组蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明用于预防禽安卡拉病的重组蛋白的编码基因构建方法，包括下列步骤：

利用柔性Linker和限制性内切酶酶切位点连接方法，将源自4型禽腺病毒Fiber1的多抗原表位串联蛋白的编码DNAFAdV4:F1、源自4型禽腺病毒Penton的多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:P、源自4型禽腺病毒Fiber2的多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:F2和源自4型禽腺病毒Hexon的多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:H进行串联，得所述编码基因FAdV4:F1-P-F2-H。

本发明所述源自4型禽腺病毒Fiber1的多抗原表位串联蛋白的编码DNA包括4型禽腺病毒Fiber1多个抗原表位的基因片段，以柔性linker间隔串联，化学合成所述的经密码子优化的编码DNAFAdV4:F1，如SEQ ID NO.2的1-348bp所示，对应氨基酸序列如SEQ IDNO.1的1-116aa所示；

所述源自4型禽腺病毒Penton的多抗原表位串联蛋白的编码DNA包括4型禽腺病毒Penton多个抗原表位的基因片段，以柔性linker间隔串联，化学合成所述的经密码子优化的编码DNAFAdV4:P，如SEQ ID NO.2的382-714bp所示，对应氨基酸序列如SEQ ID NO.1的128-238aa所示；

所述源自4型禽腺病毒Fiber2的多抗原表位串联蛋白的编码DNA包括4型禽腺病毒Fiber2多个抗原表位的基因片段，以柔性linker间隔串联，化学合成所述的经密码子优化的编码DNAFAdV4:F2，如SEQ ID NO.2的742-1077bp所示，对应氨基酸序列如SEQ ID NO.1的248-359aa所示；

所述源自4型禽腺病毒Hexon的多抗原表位串联蛋白的编码DNA包括4型禽腺病毒Hexon多个抗原表位的基因片段，以柔性linker间隔串联，化学合成所述的经密码子优化的编码DNAFAdV4:H，如SEQ ID NO.2的1099-1404bp所示，对应氨基酸序列如SEQ ID NO.1的367-468aa所示。

本发明所述的编码基因构建方法，所述限制性内切酶酶切位点连接方法是引入Nco I、NdeI、Hind III、XhoI、Bam HI五种限制性内切酶酶切位点到四种多抗原表位，串联蛋白的编码DNA的上游引物和下游引物，包括：

源自4型禽腺病毒Fiber1的多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:F1的上游引物含有NcoI限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.3所示,下游引物含有NdeI限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.4所示；

源自4型禽腺病毒Penton的多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:P的上游引物依次含有NdeI、Hind III、XhoI限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.5所示,下游引物含有BamHI限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.6所示；

源自4型禽腺病毒Fiber2的多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:F2的上游引物依次含有NdeI、Bam HI、Hind III限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.7所示,下游引物含有XhoI限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.8所示；

源自4型禽腺病毒Hexon的多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:H的上游引物依次含有NdeI、Bam HI、XhoI限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.9所示,下游引物含有Hind III限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.10所示。

本发明所述重组表达体系包括真核表达体系或原核表达体系。

本发明表达用于预防禽安卡拉病的重组蛋白的重组表达载体：重组表达载体的基础载体包括pET-28a，重组蛋白编码DNAFAdV4:F1-P-F2-H上游引物引入NcoI限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.3所示，下游引物引入Eco RI限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.11所示，通过酶切连接***pET-28a的NcoI和Eco RI酶切位点之间，构建多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H的重组表达质粒pET28a-FAdV4:F1-P-F2-H。

本发明所述用于预防禽安卡拉病的重组蛋白的诱导表达方法，包括以下步骤：

将重组表达载体pET28a-FAdV4:F1-P-F2-H转入大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中，获得可表达多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H的大肠杆菌基因工程表达菌Ec-RD-FAdV4:F1-P-F2-H，利用IPTG诱导表达和Ni柱亲和层析纯化，得所述重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H。

本发明所述预防禽安卡拉病的重组蛋白在制备禽安卡拉病亚单位疫苗中的应用。

一种禽安卡拉病亚单位疫苗，包括预防禽安卡拉病的重组蛋白与免疫学上接受的疫苗佐剂以1:1体积配比混合，所述疫苗佐剂包括弗氏佐剂或氢氧化铝溶胶佐剂。

本发明的优点是：

本发明选择4型禽腺病毒的四种衣壳蛋白多个抗原表位构建多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H，使用该蛋白制备禽安卡拉病亚单位疫苗具有更多衣壳蛋白抗原表位，刺激机体产生更多种类、更多数量的保护性抗体，显著提高对禽安卡拉病的保护力。选择的多抗原表位以及根据大肠杆菌密码子偏爱性优化多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H的编码DNA的密码子，显著提高了大肠杆菌表达***可溶性表达多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H的蛋白量，保障了有充足的多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H用于制备禽安卡拉病亚单位疫苗。而且本发明所制备多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H亚单位疫苗只需要免疫一次即可以产生完全的免疫保护力，显著降低了免疫防疫的成本支出。总之，使用多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H制备的可以预防禽安卡拉病的亚单位疫苗，具有抗原表达量高，抗体维持时间长，纯度高，安全性好，具有强免疫原性，保护性强等特点，可以有效预防禽安卡拉病。

附图说明

图1是本发明实施例2步骤(1)中源自四种多抗原表位串联蛋白编码DNA FAdV4:F1、FAdV4:P、FAdV4:F2、FAdV4:H经酶切连接后获得六种不同排列连接方式的多联融合重组蛋白的编码基因的PCR扩增结果图；其中：

泳道M为DL 2000DNA Marker；

泳道1-6分别为多联融合重组蛋白的编码基因FAdV4:F1-P-H-F2、FAdV4:F1-P-F2-H、FAdV4:F1-H-P-F2、FAdV4:F1-H-F2-P、FAdV4:F1-F2-P-H、FAdV4:F1-F2-H-P；

图2是本发明实施例2步骤(2)中多联融合重组蛋白的编码基因经限制性内切酶NcoI和Eco RI双酶切鉴定后，双酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果图；其中：

泳道M为DL 2000DNA Marker；泳道1-6分别为酶切后多联融合重组蛋白编码基因FAdV4:F1-P-H-F2、FAdV4:F1-P-F2-H、FAdV4:F1-H-P-F2、FAdV4:F1-H-F2-P、FAdV4:F1-F2-P-H、FAdV4:F1-F2-H-P；

图3是本发明实施例3步骤(1)中各重组蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果图；

图中A为基因工程表达菌Ec-RD-FAdV4:F1-P-F2-H的IPTG诱导表达总蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果图，其中：泳道M为蛋白Marker；泳道1为Ec-RD-FAdV4:F1-P-F2-H未诱导的全菌体；泳道2为Ec-RD-FAdV4:F1-P-F2-H诱导的全菌体；泳道3为Ec-RD-FAdV4:F1-P-F2-H破碎菌体离心后的上清液；泳道4为Ec-RD-FAdV4:F1-P-F2-H破碎菌体离心后的包涵体；

图中B、C、D、E、F分别为其他五种多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-H-F2、FAdV4:F1-H-F2-P、FAdV4:F1-F2-P-H、FAdV4:F1-F2-H-P、FAdV4:F1-H-P-F2的诱导表达蛋白SDS-PAGE电泳检测结果图；

图4是本发明实施例3步骤(2)中各纯化后的重组蛋白的电泳检测结果图；

图中A是基因工程表达菌Ec-RD-FAdV4:F1-P-F2-H的诱导表达纯化蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果图，其中：泳道M为蛋白Marker；泳道1为只含有pET-28a空载体的E.coliRosetta(DE3)对照菌，泳道2为纯化前的Ec-RD-FAdV4:F1-P-F2-H经诱导表达破碎菌体离心后的上清液，泳道3为纯化后的多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H；

图中B、C、D、E分别为纯化后的多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-H-F2、FAdV4:F1-H-F2-P、FAdV4:F1-F2-P-H、FAdV4:F1-F2-H-P的SDS-PAGE电泳检测结果图；

图5是本发明实施例4步骤(2)中的1)免疫原性实验分析多联融合重组蛋白免疫原性，蛋白免疫后不同时期鸡血清抗体变化水平图；

图6是本发明实施例4步骤(2)中的2)免疫攻毒保护性实验中免疫后抗体消长规律图；

图7是本发明实施例4步骤(2)中的2)免疫攻毒保护性实验中一次免疫攻毒后生存曲线图。

具体实施方式

实施例1多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H的制备

(1)、根据NCBI GenBank中禽腺病毒4型基因序列(GenBank登录号KU587519.1)下载Penton、Hexon、Fiber1、Fiber2四种衣壳蛋白的基因核苷酸序列，根据抗原表位特点，选取四种衣壳蛋白位于膜外区、亲水性好且抗原表位集中的蛋白片段，利用蛋白linkerGGGGS的编码DNA核苷酸序列将选择的抗原表位集中的蛋白片段的编码DNA连接构建为四种多抗原表位串联蛋白编码DNA FAdV4:F1、FAdV4:P、FAdV4:F2和FAdV4:H。将四种多抗原表位串联蛋白编码DNA，根据大肠杆菌表达***密码子使用偏爱性，经过大肠杆菌密码子优化后直接通过化学方法合成DNA，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

(2)、利用Premier 5设计出含有NcoI、NdeI、Hind III、XhoI、BamHI酶切位点的引物，以构建的四种多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:F1、FAdV4:P、FAdV4:F2、FAdV4:H为模板，利用表1中的引物按表2中PCR体系和条件进行PCR扩增，获得5′和3′两端带有不同限制性酶切位点的多抗原表位串联蛋白的编码DNA。具体方法如下：以多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:F1为模板，以含有NcoI限制性内切酶位点的上游引物Fiber1-F(如SEQID NO.3所示)和含有NdeI限制性内切酶位点的下游引物Fiber1-R(如SEQ ID NO.4所示)进行PCR扩增，扩增出长度为369bp的DNA片段Nc-FAdV4:F1-Nd；以多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:P为模板，以含有NdeI、Hind III、XhoI限制性内切酶位点的上游引物Penton-F(如SEQ ID NO.5所示)和含有Bam HI限制性内切酶位点的下游引物Penton-R(如SEQ IDNO.6所示)进行PCR扩增，扩增出长度为372bp的DNA片段Nd-Hi-Xh-FAdV4:P-Ba；以多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:F2为模板，以含有NdeI、Bam HI、Hind III限制性内切酶位点的上游引物Fiber2-F(如SEQ ID NO.7所示)和含有XhoI限制性内切酶位点的下游引物Fiber2-R(如SEQ ID NO.8所示)进行PCR扩增，扩增出长度为375bp的DNA片段Nd-Ba-Hi-FAdV4:F2-Xh；以多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:H为模板，以含有NdeI、Bam HI、XhoI限制性内切酶位点的上游引物Hexon-F(如SEQ ID NO.9所示)和含有Hind III限制性内切酶位点的下游引物Hexon-R(如SEQ ID NO.10所示)进行PCR扩增，扩增出长度为345bp的DNA片段Nd-Ba-Xh-FAdV4:H-Hi。PCR反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，将4种上下游两端带有不同限制性酶切位点的多抗原表位串联蛋白的编码DNA片段Nc-FAdV4:F1-Nd、Nd-Hi-Xh-FAdV4:P-Ba、Nd-Ba-Hi-FAdV4:F2-Xh、Nd-Ba-Xh-FAdV4:H-Xh进行胶回收，使用T载体连接试剂盒，分别与pMD-18T载体16℃水浴过夜进行连接，连接体系如表3所示。

表1所有引物信息

表2、实施例1步骤(2)中PCR扩增体系和条件

注：PCR反应程序为94℃5min；32个循环(94℃40s；70℃30s；72℃

90s)；72℃10min；4℃保存。

表3、实施例1步骤(2)中连接体系

试剂	体积
		目的片段胶回收产物	4μl
pMD-18T	1μl
		solution I	5μl
总体积	10μl

实施例2多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H的原核表达基因工程菌的构建

(1)、将实施例1步骤(2)中连接之后的含有目的DNA的重组克隆质粒转进大肠杆菌感受态细胞E.coliDH5α中，挑取阳性转化菌送至长春库美生物科技有限公司测序，并提取***正确DNA片段的重组克隆质粒。

使用质粒提取试剂盒分别提取四种***目的DNA片段的重组克隆质粒，按照不同排列组合方式，利用限制性内切酶酶切位点连接方法构建不同的多联融合重组蛋白的编码基因。具体方法如下：分别用NcoI、NdeI、HindIII、XhoI、BamHI、EcoRI进行双酶切，双酶切体系如表4所示，37℃恒温酶切3-4h后，利用DNA凝胶回收试剂盒，胶回收目的DNA片段，获得带有不同酶切位点粘末端的目的DNA片段，用T4DNA连接酶进行连接，获得多联融合重组蛋白的编码基因。将多抗原表位串联蛋白的编码DNAFAdV4:F1定于首位，其余三种多抗原表位串联蛋白的编码DNA以排列组合方式构建成六种不同连接方式的多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-H-F2、FAdV4:F1-P-F2-H、FAdV4:F1-H-P-F2、FAdV4:F1-H-F2-P、FAdV4:F1-F2-P-H、FAdV4:F1-F2-H-P的编码基因，连接体系如表5所示，将连接体系置于16℃恒温水浴锅中连接过夜。经酶切连接后获得六种不同连接方式的多联融合重组蛋白的编码基因的PCR扩增结果如图1所示，之后将连接产物进行转化，测序，提取质粒备用。根据制备的亚单位疫苗免疫攻毒保护率实验结果筛选出一种优选的多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H，本发明将围绕FAdV4:F1-P-F2-H进行具体阐述，其他不同连接方式多联融合重组蛋白的实验操作方法与FAdV4:F1-P-F2-H相同。

(2)以步骤(1)中多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H的编码基因为模板，以含有NcoI限制性内切酶位点的上游引物Fiber1-F(如SEQ ID NO.3所示)和含有EcoRI限制性内切酶位点的下游引物FPBH-R(如SEQ ID NO.11所示)进行PCR扩增，PCR反应体系与反应程序与实施例1中相同。将NcoI和EcoRI酶切位点引入多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H的编码基因的5′和3′端，用NcoI和EcoRI两种限制性内切酶进行双酶切，双酶切体系如表6所示，酶切体系置于37℃恒温水浴锅中作用3-4h，双酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，之后将双酶切产物进行胶回收。利用DNA凝胶回收试剂盒回收双酶切后的编码基因DNA，然后用T4DNA连接酶将回收后编码基因DNA与NcoI/EcoRI双酶切线性化的pET-28a质粒连接，连接体系如表7所示，将连接体系置于16℃恒温水浴锅中连接过夜，之后将连接产物进行转化，测序，提取质粒备用，制备重组质粒命名为：pET28a-FAdV4:F1-P-F2-H。然后将重组质粒通过热激方法转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，经常规菌液PCR鉴定后，将阳性重组质粒送交长春库美生物科技有限公司测序，测序得到多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过摸索不同温度、不同诱导剂浓度筛选获得可以大量表达多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H的基因工程表达菌Ec-RD-FAdV4:F1-P-F2-H。其余5种多联融合重组蛋白的编码基因的PCR扩增上游引物均为含有NcoI限制性内切酶位点的引物Fiber1-F，下游引物不同，但均含有EcoRI限制性内切酶位点。其中，多联融合重组蛋白FAdV4:F1-F2-P-H的编码基因的PCR扩增下游引物与FAdV4:F1-P-F2-H的下游引物相同为引物FPBH-R；多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-H-F2和FAdV4:F1-H-P-F2的编码基因PCR扩增下游引物为引物FPHB-R，如SEQID NO.12所示；多联融合重组蛋白FAdV4:F1-H-F2-P和FAdV4:F1-F2-H-P的编码基因PCR扩增下游引物FHBP-R，如SEQ ID NO.13所示。

表4、实施例2步骤(1)中酶切体系

注：A：NcoI-FAdV4:F1-NdeI；B：NdeI-FAdV4:P-BamHI；C：BamHI-FAdV4:F2-XhoI；D：XhoI-FAdV4:H-HindШ；E：BamHI-FAdV4:H-HindШ；F：HindШ-FAdV4:F2-XhoI；G：NdeI-FAdV4:H-HindШ；H：HindШ-FAdV4:P-BamHI；I：BamHI-FAdV4:F2-XhoI；J：HindШ-FAdV4:F2-XhoI；K：XhoI-FAdV4:P-BamHI；L：NdeI-FAdV4:F2-XhoI；M：XhoI-FAdV4:P-BamHI；N：BamHI-FAdV4:H-HindШ；O：XhoI-FAdV4:H-HindШ；P：HindШ-FAdV4:P-BamHI；

表5、实施例2步骤(1)中连接体系

连接体系组份	体积(μl)
		10* T4 DNA buffer	2
T4 DNA ligase	2
		NcoI-FAdV4:F1-NdeI	4
NdeI-FAdV4:P-BamHI	4
		BamHI-FAdV4:F2-XhoI	4
XhoI-FAdV4:H-HindШ	4
		总体积	20

表6、实施例2步骤(2)中酶切体系

表7、实施例2步骤(2)中连接体系

实施例3多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H的表达及纯化

(1)、将基因工程表达菌Ec-RD-FAdV4:F1-P-F2-H接种到含有100μg/ml卡那霉素的5ml液体LB培养基中，37℃培养2h，再加入IPTG，使其终浓度为0.1mmol/L，诱导8h。通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况，其中多联融合重组蛋白FAdV4:F1-H-P-F2经诱导后不能表达，其余5种连接方式多联融合重组蛋白均成功表达，故后续免疫原性与攻毒保护性实验基于表达成功的5种多联融合重组蛋白进行操作。将诱导后表达菌株进行超声破碎菌体，将超声后菌液8000rpm4℃离心10min后，收集上清和沉淀，通过SDS-PAGE电泳检测基因工程表达菌中目的蛋白的表达量以及溶解状态。

基因工程表达菌Ec-RD-FAdV4:F1-P-F2-H的SDS-PAGE电泳检测结果如图3A，其它多联融合重组蛋白SDS-PAGE电泳检测结果如图3B-F，由检测结果图3F可知多联融合重组蛋白FAdV4:F1-H-P-F2不能成功诱导表达。

(2)、多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H的纯化

基因工程表达菌Ec-RD-FAdV4:F1-P-F2-H用IPTG诱导表达后，超声破碎菌体，将超声后菌液8000rpm4℃离心50min后，收集上清，使用亲和层析介质Ni-NTA对收集到的上清进行目的蛋白纯化。

由SDS-PAGE检测结果可知重组蛋白在上清和包涵体中均有表达，上清中表达量远大于包涵体中，所以采用上清纯化方式对重组蛋白进行纯化。将5ml37℃过夜培养的Ec-RD-FAdV4:F1-P-F2-H菌液接入1L灭菌过的LB中，加入100μg/ml卡那青霉素，37℃，160rpm，摇床培养2h，再加入IPTG，使其终浓度为0.1mmol/L，37℃摇床160rpm，诱导8h。诱导后菌液8000rpm，4℃离心10min，收集菌体沉淀，用结合缓冲液Buffer A(Tris 6.058g、甘油100ml、Nacl29.25g、咪唑0.68g定容至1L调PH7.2-7.4)重悬，超声破碎菌体，将超声后菌液8000rpm，4℃离心50min后，收集上清，使用亲和层析介质Ni-NTA对收集到的上清进行目的蛋白纯化。

具体过程为将收集的菌体用Buffer A悬起进行超声破碎，将离心后上清与镍柱结合；再用洗脱缓冲液Buffer B(Tris 6.058g、甘油100ml、Nacl29.25g、咪唑34.04g定容至1L调PH为7.2-7.4)冲洗柱子去除杂蛋白；分别用含60mM咪唑的洗脱缓冲液(由89.80mlBufferA与0.20mlBuffer B混匀制备)和含80mM咪唑的洗脱缓冲液(由85.71mlBuffer A 与14.29mlBuffer B混匀制备)洗除杂蛋白；用含220mM咪唑的洗脱缓冲液(由57.14mlBufferA与42.86mlBuffer B混匀制备)洗脱目的蛋白，并收集蛋白洗脱液。将收集的蛋白洗脱液装进3500Dal截留分子量的透析袋中，以除去蛋白洗脱液中的220mM咪唑，将装有蛋白洗脱液的透析袋浸入PBS中进行透析3-4次，每次间隔3个小时更换新的PBS进行透析，透析结束后，用PEG20000进行浓缩2个小时，获得的浓缩后液体即为纯化的目的蛋白FAdV4:F1-P-F2-H。使用碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒测定纯化后的目的蛋白浓度。经测定，纯化后多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H蛋白浓度为1-2mg/ml。

纯化后多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H的SDS-PAGE电泳检测结果如图4A，其它多联融合重组蛋白的检测结果如图4B-E。

实施例4禽安卡拉病基因工程亚单位疫苗的制备及免疫保护性分析实验

(1)、亚单位疫苗的制备

将实施例3中纯化的5种多联融合重组蛋白稀释至100μg/ml，与弗氏佐剂按体积比1:1混匀制备成亚单位疫苗。

(2)、亚单位疫苗免疫原性分析实验

1)免疫原性分析

14日龄无特定病原体SPF海兰白蛋鸡分为6组，每组6只鸡，前5组分别免疫5种多联融合重组蛋白制备的亚单位疫苗为免疫组，第6组为PBS对照组，注射同体积的PBS，其中首次免疫用等体积的弗氏完全佐剂乳化，后续免疫用弗氏不完全佐剂乳化，免疫周期为7天，免疫程序为四次免疫，免疫方式为腿部肌肉注射接种。于鸡群首次免疫之后的一个星期开始每周以翅静脉采血的方式收集免疫鸡血清样品用于抗体效价变化水平检测，用间接ELISA方法检测血清中抗体效价并计算P/N值。结果如图5所示，由结果可知5种多联融合重组蛋白制备的亚单位疫苗均能够刺激机体产生抗体，且抗体维持时间较长，说明制备的5种多联融合重组蛋白免疫原性好，能够刺激机体产生结合能力强、维持时间长的抗体。

2)动物攻毒免疫保护性实验

①实验鸡分组及免疫

选取14日龄SPF海兰白蛋鸡，每组6只，免疫周期为14天，免疫程序分为一次免疫和两次免疫，免疫方式为腿部肌肉注射。

实验组：一次免疫组在鸡14日龄时免疫上述5种亚单位疫苗(100μg蛋白/只)，免疫14天后攻毒；两次免疫组于一免14天后再次进行免疫，免疫剂量和方式与一免相同，二免14天后进行攻毒；

阴性对照：不免疫不攻毒组；

阳性对照(PBS组)：注射PBS的攻毒组。

②免疫后抗体效价检测

结果表明，各免疫组实验鸡只血清抗体滴度的P/N值无显著性差异，但是在免疫后1周大部分实验鸡体内血清抗体已经显示为阳性；与PBS组之间有显著性差异，结果如图6所示。

③攻毒保护性实验

第一次免疫后14天，免疫组及阳性对照组鸡群肌肉注射接种FAdV-4分离株SDBZ-1，病毒滴度为10⁴TCID₅₀，按100TCID₅₀剂量进行攻毒。攻毒后一周，每天观察鸡只临床症状、记录感染鸡死亡情况，对死亡鸡进行剖检，并进行病变观察。攻毒保护性实验结果如表8所示，生存曲线如图7所示。一次免疫组的攻毒保护率说明了多联融合重组蛋白具有不同地诱导免疫保护的能力。与其它多联融合重组蛋白(FAdV4:F1-P-H-F2、FAdV4:F1-H-F2-P、FAdV4:F1-F2-P-H和FAdV4:F1-F2-H-P)的亚单位疫苗相比，本发明的亚单位疫苗FAdV4:F1-P-F2-H具有最好的免疫保护力，只需一次免疫即可以产生100％的免疫保护率。二免攻毒后，各免疫组之间的攻毒保护力没有显著性差异，5种亚单位疫苗均能提供接近100％的保护率。

表8、一次免疫攻毒保护性实验结果

根据攻毒保护性实验结果可知，本发明的亚单位疫苗FAdV4:F1-P-F2-H在免疫组的能够提供完全的保护，一次免疫即可使全部免疫鸡获得完全保护，攻毒后死亡率为0。而PBS阳性对照组鸡只在攻毒后，大部分出现发病、死亡，阴性对照组无鸡只出现发病、死亡情况。本发明优选的多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H的亚单位疫苗，只需一次免疫即可发挥完全的保护作用，大大降低了免疫成本，说明所述的多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H制备的疫苗既高效又经济。

本发明中所用氢氧化铝溶胶佐剂代替弗氏佐剂制备亚单位疫苗，其免疫原性分析和动物攻毒免疫保护性实验的方法和结果与使用弗氏佐剂的相同，能够刺激机体产生结合能力强、维持时间长的抗体，并且攻毒保护率达100％。弗氏佐剂和氢氧化铝溶胶都可以作为本发明中亚单位疫苗的免疫佐剂，能够达到理想的免疫与攻毒保护效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 用于预防禽安卡拉病的重组蛋白及构建方法和应用

<130> jlu-rhl2021p

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 1

Met Asp His His His His His His Arg Ala Leu Ser Glu Pro Ser Arg

1 5 10 15

Tyr Leu Ser Glu Gly Asp Glu Arg Arg Lys Pro Lys Arg Ala Arg Pro

20 25 30

Ala Thr Arg Ala Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asn Gly Asn Val Lys

35 40 45

Ser Lys Gly Leu Gln Asn Trp Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Pro Pro

50 55 60

Thr Val Ser Pro Thr Asn Gln Asn Gly Gly Gly Gly Ser Pro Asn Ser

65 70 75 80

Asn Gln Ser Asp Val Gly Tyr Leu Gly Leu Pro Pro His Thr Arg Asp

85 90 95

Asn Trp Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Ser Gly Ser Asn Trp Phe

100 105 110

Asp Gln Asn Ala Gly Gly Gly Gly Ser His Met Lys Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Pro Pro Pro Thr Glu Leu Thr Pro Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ala

130 135 140

Pro Thr Gly Gly Arg Asn Ser Ile Lys Tyr Arg Asp Tyr Thr Pro Cys

145 150 155 160

Arg Asn Gly Gly Gly Gly Ser Lys Ala Ser Asp Ile Asp Thr Tyr Asn

165 170 175

Lys Asp Ala Asn His Ser Asn Phe Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gln Asn

180 185 190

Asn Val Gln Lys Ser Asp Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Gly Lys

195 200 205

Arg Glu Pro Tyr Ser Lys Gly Phe Val Ile Gly Gly Gly Gly Ser Phe

210 215 220

Ile Ala Pro Thr Gly Phe Lys Glu Asp Asn Thr Thr Asn Leu Gly Gly

225 230 235 240

Gly Gly Ser Gly Ser Lys Leu Gly Lys Pro Glu Thr Glu Ala Gly Pro

245 250 255

Ser Pro Ala Gly Gly Gly Gly Ser Ile Lys Asn Arg Ser Val Asp Leu

260 265 270

Ala His Asp Pro Ser Leu Asp Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Val Asp

275 280 285

Glu Ser Leu Gln Ile Val Asn Asn Thr Leu Glu Val Lys Pro Asp Pro

290 295 300

Ser Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ala Thr Met Gly Asn Arg Pro

305 310 315 320

Gly Asp Leu Asn Ser Ala Asn Ala Lys Gly Gly Gly Gly Ser Pro Met

325 330 335

Ala Asn Arg Ser Val Thr Ser Pro Trp Thr Tyr Ser Ala Asn Gly Tyr

340 345 350

Tyr Glu Pro Ser Ile Gly Glu Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Asn Val

355 360 365

Thr Thr Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Thr Asp Asp Thr Ser

370 375 380

Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro

385 390 395 400

Tyr Cys Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ser Met Phe Asn Asn Trp Ser

405 410 415

Glu Thr Ala Pro Gly Gln Asn Gly Gly Gly Gly Ser Phe Pro Asn Pro

420 425 430

Asn Gln Gly Pro Gly Arg Asn Pro Leu Arg Arg Val Gln Asn Ala Asn

435 440 445

Thr Gly Val Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asp Tyr Asp Asp Tyr Asn Ile

450 455 460

Gly Thr Thr Arg

465

<210> 2

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 2

atggatcatc atcaccatca ccatcgggcg ctgagcgaac cgagccgcta tctgagtgag 60

ggtgacgagc gacgtaagcc taagagggct agacctgcca cacgtgctaa tggcgggggc 120

gggggcagta atgggaacgt gaagagcaaa ggactccaga actggtcggg cggtggtgga 180

tcagttccac ctactgtatc tcctactaat cagaatggtg gcggcgggag cccgaacagc 240

aaccagagcg atgtgggcta tctgggcctg ccgccgcata cccgcgataa ctggtatggt 300

ggcggaggct cacagactag cggcagcaac tggtttgatc agaacgcggg cggaggcgga 360

agccatatga agcttctcga gccaccacct cctaccgaat taacgccgag cactggtgga 420

ggcgggtcgg caccgaccgg gggtcggaac agcattaaat atcgcgatta tacgccatgt 480

cgcaacggag gaggtggtag caaagctagc gatattgata cctataacaa agatgcgaac 540

catagcaact tcggcggtgg agggtcgcgt cagaataatg tgcagaagag tgacatagga 600

ggcggagggt ccggaatcgg caaacgcgaa ccgtatagca aaggctttgt gattggtggg 660

ggtgggtctt tcattgctcc aacaggtttc aaggaagata acaccaccaa cctgggcgga 720

ggcggaagcg gatccaagct tgggaaaccg gaaaccgaag cgggcccgag cccggccgga 780

ggtggcggat cgataaagaa ccggtccgtt gacttggcgc atgatccgag cctggatgga 840

ggtggcggta gcgtctcggt ggatgaaagc ctgcagattg tgaacaatac gttagaggtt 900

aagcccgacc cttctggacc cggaggcggt ggctctagcg cgacgatggg caatagacca 960

ggagacctca atagtgccaa tgccaagggc ggaggcggga gcccgatggc gaatcgatct 1020

gtaacaagtc cgtggaccta tagcgcgaac ggctattatg aaccgagcat tggcgaaggc 1080

ggaggcggaa gcctcgagaa cgtgaccacc gagaagggtg ggggaggaag tatccagacc 1140

gatgatacct ctacaggagg tggtggcgga agccttgatc gcggcccgag ctttaaaccg 1200

tattgcggta caggtggcgg agggtcctcc atgtttaata attggtccga gacggctcca 1260

ggccagaacg gagggggtgg atcgtttcca aatcctaatc aaggtccagg aaggaatccc 1320

ttacggagag tacagaacgc gaataccggc gtgggtggtg ggggcagcga ggactatgat 1380

gattataaca ttggcaccac ccgctaagaa ttc 1413

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 3

catgccatgg atcatcatca ccatcaccat cgggcgctga gcgaac 46

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 4

ggaattccat atggcttccg cctccgcccg cgttctgatc aaaccagttg c 51

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 5

ggaattccat atgaagcttc tcgagccacc acctcctacc gaattaac 48

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 6

cgggatccgc ttccgcctcc gcccaggttg gtggtgttat cttc 44

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 7

ggaattccat atgggatcca agcttgggaa accggaaacc gaagcgggc 49

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 8

ccctcgaggc ttccgcctcc gccttcgcca atgctcggtt c 41

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 9

ggaattccat atgggatccc tcgagaacgt gaccaccgag aagggtgggg 50

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 10

cccaagcttg cttccgcctc cgcccaggtt ggtggtgtta tcttccttg 49

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 11

ggaattctta gcgggtggtg ccaatgttat aatcatcata gtcctcgctg 50

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 12

ggaattctta ttcgccaatg ctcggttcat aatagccgtt cgcgctatag 50

<210> 13

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工合成(人工合成)

<400> 13

ggaattctta caggttggtg gtgttatctt ccttgaaacc tgttggagca atg 53

Claims

1.一种用于预防禽安卡拉病的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白为多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的用于预防禽安卡拉病的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1或2所述的用于预防禽安卡拉病的重组蛋白的编码基因构建方法，其特征在于，包括下列步骤：

利用柔性Linker和限制性内切酶酶切位点连接方法，将源自4型禽腺病毒Fiber1的多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:F1、源自4型禽腺病毒Penton的多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:P、源自4型禽腺病毒Fiber2的多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:F2和源自4型禽腺病毒Hexon的多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:H进行串联，得所述编码基因FAdV4:F1-P-F2-H。

4.根据权利要求3所述的编码基因构建方法，其特征在于：

所述源自4型禽腺病毒Fiber1的多抗原表位串联蛋白的编码DNA包括4型禽腺病毒Fiber1多个抗原表位的基因片段，以柔性linker间隔串联，化学合成所述的经密码子优化的编码DNAFAdV4:F1，如SEQ ID NO.2的1-348bp所示，对应氨基酸序列如SEQ ID NO.1的1-116aa所示；

5.根据权利要求3所述的编码基因构建方法，其特征在于：所述限制性内切酶酶切位点连接方法是引入Nco I、NdeI、Hind III、XhoI、Bam HI五种限制性内切酶酶切位点到四种多抗原表位，串联蛋白的编码DNA的上游引物和下游引物，包括：

源自4型禽腺病毒Fiber1的多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:F1的上游引物含有NcoI限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.3所示,下游引物含有NdeI限制性内切酶位点，如SEQID NO.4所示；

源自4型禽腺病毒Penton的多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:P的上游引物依次含有NdeI、Hind III、XhoI限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.5所示,下游引物含有Bam HI限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.6所示；

源自4型禽腺病毒Hexon的多抗原表位串联蛋白的编码DNA FAdV4:H的上游引物依次含有NdeI、Bam HI、XhoI限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.9所示,下游引物含有HindIII限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.10所示。

6.如权利要求1或2所述用于预防禽安卡拉病的重组蛋白的重组表达体系，其特征在于：所述重组表达体系包括真核表达体系或原核表达体系。

7.表达如权利要求1或2所述用于预防禽安卡拉病的重组蛋白的重组表达载体，其特征在于：重组表达载体的基础载体包括pET-28a，重组蛋白编码DNAFAdV4:F1-P-F2-H上游引物引入NcoI限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.3所示，下游引物引入Eco RI限制性内切酶位点，如SEQ ID NO.11所示，通过酶切连接***pET-28a的NcoI和Eco RI酶切位点之间，构建多联融合重组蛋白FAdV4:F1-P-F2-H的重组表达质粒pET28a-FAdV4:F1-P-F2-H。

8.如权利要求1或2所述用于预防禽安卡拉病的重组蛋白的诱导表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.如权利要求1或2所述预防禽安卡拉病的重组蛋白在制备禽安卡拉病亚单位疫苗中的应用。

10.包括如权利要求1或2所述预防禽安卡拉病的重组蛋白的一种禽安卡拉病亚单位疫苗，其特征在于：所述预防禽安卡拉病的重组蛋白与免疫学上接受的疫苗佐剂以1:1体积配比混合，所述疫苗佐剂包括弗氏佐剂或氢氧化铝溶胶佐剂。