RU2691302C1 - Иммуногенная композиция на основе рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, а также на основе белковых антигенов и способ получения иммуногенной композиции - Google Patents
Иммуногенная композиция на основе рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, а также на основе белковых антигенов и способ получения иммуногенной композиции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2691302C1 RU2691302C1 RU2018118941A RU2018118941A RU2691302C1 RU 2691302 C1 RU2691302 C1 RU 2691302C1 RU 2018118941 A RU2018118941 A RU 2018118941A RU 2018118941 A RU2018118941 A RU 2018118941A RU 2691302 C1 RU2691302 C1 RU 2691302C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tul4
- fopa
- dnak
- protein
- recombinant
- Prior art date
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 60
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 49
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 181
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 117
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 76
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 claims abstract description 65
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 101100278084 Nostoc sp. (strain PCC 7120 / SAG 25.82 / UTEX 2576) dnaK1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 101100117145 Synechocystis sp. (strain PCC 6803 / Kazusa) dnaK2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 20
- 229940118764 francisella tularensis Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 31
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 claims description 21
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 8
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 claims description 7
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 6
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims description 6
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 6
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 6
- 241000626959 Franciella Species 0.000 claims description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 5
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 5
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 4
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 claims description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 claims description 2
- 101001014231 Francisella tularensis subsp. holarctica (strain LVS) 17 kDa major membrane protein Proteins 0.000 claims 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 108700040494 Francisella tularensis FopA Proteins 0.000 abstract description 2
- 241000768462 Leuconostoc citreum KM20 Species 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 99
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 38
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 36
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 29
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 27
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 26
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 20
- 208000034784 Tularaemia Diseases 0.000 description 20
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 229940046168 CpG oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 7
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 7
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006101 laboratory sample Substances 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 4
- 241000589601 Francisella Species 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 3
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 3
- 230000009429 distress Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VQWNELVFHZRFIB-UHFFFAOYSA-N odn 1826 Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C(O1)CC(O)C1COP(O)(=O)OC1CC(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OC1COP(O)(=O)OC1CC(N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OC1COP(O)(=O)OC1CC(N2C(N=C(N)C=C2)=O)OC1COP(O)(=O)OC1CC(N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)OC1COP(O)(=O)OC1CC(N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OC1COP(O)(=O)OC1CC(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OC1COP(O)(=O)OC1CC(N2C(N=C(N)C=C2)=O)OC1COP(O)(=O)OC1CC(N2C(N=C(N)C=C2)=O)OC1COP(O)(=O)OC1CC(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OC1COP(O)(=O)OC(C(O1)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(O)=O)CC1N1C=C(C)C(=O)NC1=O VQWNELVFHZRFIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazol-3-ium;chloride Chemical compound [Cl-].[NH2+]1C=CN=C1 JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 235000004507 Abies alba Nutrition 0.000 description 1
- 241000191291 Abies alba Species 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007064 DNA hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000701988 Escherichia virus T5 Species 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 241000701796 Fowl aviadenovirus 1 Species 0.000 description 1
- 108700031441 Francisella tularensis TUL4 Proteins 0.000 description 1
- 101100063726 Francisella tularensis dnaK gene Proteins 0.000 description 1
- 241000266827 Francisella tularensis subsp. holarctica Species 0.000 description 1
- 101710160621 Fusion glycoprotein F0 Proteins 0.000 description 1
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000007938 Juquitiba virus Species 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101150105115 PA gene Proteins 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035472 Zoonoses Diseases 0.000 description 1
- NKVLDFAVEWLOCX-GUSKIFEASA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl] (4ar,5r,6as,6br,9s,10s,12ar)-10-[(2r,3r,4s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)CO[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](C)O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1OC(=O)[C@]12CCC(C)(C)CC1C1=CCC3[C@@]([C@@]1(C[C@H]2O)C)(C)CCC1[C@]3(C)CC[C@@H]([C@@]1(C)C=O)O[C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO2)O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O)C(=O)NCCCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@](O)(CO)[C@H]1O NKVLDFAVEWLOCX-GUSKIFEASA-N 0.000 description 1
- FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N [2-[3-[6-[3-[(5R,6aS,6bR,12aR)-10-[6-[2-[2-[4,5-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]ethoxy]ethyl]-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carbonyl]peroxypropyl]-5-[[5-[8-[3,5-dihydroxy-4-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]octoxy]-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxyoxan-2-yl]propoxymethyl]-5-hydroxy-3-[(6S)-6-hydroxy-2,6-dimethylocta-2,7-dienoyl]oxy-6-methyloxan-4-yl] (2E,6S)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methylocta-2,7-dienoate Chemical compound C=C[C@@](C)(O)CCC=C(C)C(=O)OC1C(OC(=O)C(\CO)=C\CC[C@](C)(O)C=C)C(O)C(C)OC1COCCCC1C(O)C(O)C(OCC2C(C(O)C(OCCCCCCCCC3C(C(OC4C(C(O)C(O)CO4)O)C(O)CO3)O)C(C)O2)O)C(CCCOOC(=O)C23C(CC(C)(C)CC2)C=2[C@@]([C@]4(C)CCC5C(C)(C)C(OC6C(C(O)C(O)C(CCOCCC7C(C(O)C(O)CO7)OC7C(C(O)C(O)CO7)O)O6)O)CC[C@]5(C)C4CC=2)(C)C[C@H]3O)O1 FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 108010042194 dextransucrase Proteins 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 101150077981 groEL gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000002477 vacuolizing effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Представлена иммуногенная композиция, включающая (i) прайм-компонент, состоящий из рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц: частиц, несущих ген tul4 Francisella tularensis с последовательностью SEQ ID NO 1, частиц, несущих ген fopA Francisella tularensis с последовательностью SEQ ID NO 3, и частиц, несущих ген dnaK Francisella tularensis с последовательностью SEQ ID NO 5, при этом указанные гены оптимизированы для экспрессии в эукариотических клетках, и/или (ii) бустерный компонент, включающий рекомбинантные белки: белок DBD-Tul4 с последовательностью SEQ ID NO 16, молекулярной массой 30,0 кДа, содержащий декстрансвязывающий домен декстрансукразы из L. citreum КМ20, представленный аминокислотными остатками 1-140 SEQ ID NO 16, Gly-Ser спейсер, представленный остатками 141-150 SEQ ID NO 16, и последовательность белка Tul4 Francisella tularensis, представленную остатками 151-282 SEQ ID NO 16; белок 6-His-FopA с последовательностью SEQ ID NO 18, молекулярной массой 40,5 кДа; белок DnaK-6His с последовательностью SEQ ID NO 20, молекулярной массой 70,4 кДа, а также содержащая фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и способ ее получения. Изобретение позволяет получить стабильный и устойчивый иммунный ответ на Francisella tularensis. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 21 ил., 1 табл., 9 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и иммунологии, в частности, к получению композиции на основе рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих рекомбинантные гены tul4, fopA и dnaK антигенов Francisella tularensis Tul4, FopA и DnaK, и белков DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His, обладающей способностью продуцировать стабильный, устойчивый иммунный ответ на Francisella tularensis, и способу получения такой композиции.
Уровень техники:
Francisella tularensis является возбудителем такого заболевания человека и животных, как туляремия. Туляремия - это острое или хроническое системное природно-очаговое зоонозное заболевание, которое характеризуется лихорадкой, интоксикацией и поражением лимфатических узлов [Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии - М.: Медицина, 1975 - 192 с; . Epidemiology of tularemia // Balkan Med. J - 2014 - Vol. 31, №1 - P. 3-10]. Одним из важнейших факторов сдерживания инфекции и предупреждения вспышек является наличие надежной и безопасной вакцины, дающей длительную защиту от инфекции [Мещерякова И.С., Михайлова Т.В., Демидова Т.Н., Кормилицына М.И. Эпизоотическая и эпидемическая активность природных очагов туляремии различных ландшафтно-эпидемиологических типов в период 2009-2014 гг. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни - 2016 - №1 - С. 42-61].
В настоящее время имеется только одна вакцина против туляремии - живая туляремийная вакцина на основе аттенуированного штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 [Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. - М.: Медицина, 1975 - 192 с, Гузовская Т.С., Близнюк A.M., Чистенко Г.Н. Эпидемиологический надзор за туляремией // Минск. - 2004 - 24 с.]. Данная вакцина производится ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ под названием «Вакцина туляремийная живая сухая».
Вакцины на основе аттенуированных штаммов обладают рядом недостатков, основными из которых являются ограниченная протективность в отношении наиболее патогенных штаммов, остаточная вирулентность и спонтанные перерождения в непротективную форму, высокая реактогенность и нестабильность штамма при хранении и пересеве из-за высокой частоты рекомбинации и появления точечных мутаций [Rohmer L., Brittnacher М., Svensson K. et al. Potential source of Francisella tularensis live vaccine strain attenuation determined by genome comparison // Infect. Immun. - 2006. - Vol. 74, №12. - P. 6895-6906; Hong K.G., Park P.G., Seo S.H. et al. Current status of vaccine development for tularemia preparedness // Clin. Exp. Vaccine Res. - 2013 - Vol. 2, №1. - P. 34-39; Rowe H.M., Huntley J.F. From the outside, in: the Francisella tularensis envelope and virulence // Front. Cell. Infect. Microbiol. - 2015. - Vol. 5. - Article 94].
Поэтому перспективным направлением является разработка субъединичной вакцины на основе белков F. tularensis. Для создания иммуногенной композиции в данной работе были выбраны антигены FopA, Tul4 и DnaK.
Tul4 - один из наиболее изученных белков наружной мембраны F. tularensis. Молекулярная масса Tul4 около 17 кДа. Последовательность белка Tul4 консервативна у различных штаммов F. tularensis, узнается Т-клетками лиц, вакцинированных F. tularensis. Определена локализация некоторых Т-клеточных детерминант белка Tul4.
FopA - белок с молекулярной массой 43 кДа находится в наружной мембране F. tularensis. Этот белок был выделен из экстрактов F. tularensis, используя сыворотки больных. Он был назван Fop (Francisella outer membrane protein), поскольку при клонировании гена fopA и его экспрессии в кишечной палочке локализовался вместе с главным белком клеточной стенки. FopA из F. tularensis LVS был клонирован в Е. coli, определена его нуклеотидная последовательность.
DnaK - белок теплового шока (70-75 кДа), возможный компонент наружной мембраны клетки F. tularensis, обнаруживаемый в периплазме. Белки теплового шока, появляющиеся в клетке в стрессовых условиях, участвуют в индукции защитного клеточного иммунитета. Белок DnaK кодируется геном dnaK, входящим в состав оперона groE Francisella. Известна последовательность туляремийного белка DnaK, во многом сходная с таковой белка DnaK Escherichia coli.
Иммуногенность данных белков и их способность защищать иммунизированных мышей от летальной инфекции была показана в ряде работ. Так, в работе [Ashtekar AR, Katz J, Xu Q, Michalek SM. A mucosal subunit vaccine protects against lethal respiratory infection with Francisella tularensis LVS // PLoS One. - 2012. - 7(11). - e50460] была сделана первая попытка создания препарата на основе комбинации двух иммуннодоминантных белков F. tularensis. В работе авторы исследовали иммуногенность препарата, содержащего рекомбинантные белки DnaK и Tul4, с GPI-0100 (полусинтетическое производное сапонина) в качестве адъюванта. Данный препарат вызывал клеточный и гуморальный иммунный ответ у иммунизированных мышей, при этом авторы показали, что иммунизация рекомбинантными белками DnaK и Tul4 вместе, но не каждым из них по отдельности, защищает 80% мышей от летальной респираторной инфекции F. tularensis LVS.
В работе [Oh Н, Kim CY, Kim СН, Hur GH, Park JH. A Synthetic Tul4 and FopA Peptide Cocktail of Francisella tularensis Induces Humoral and Cell-Mediated Immune Responses in Mice // J Microbiol Biotechnol. - 2016. - 26(9). - 1613 - 9] показано, что препарат, состоящий из рекомбинантных пептидов, являющихся фрагментами белков Tul4 и FopA, а также CpG в качестве адъюванта, вызывает иммунный ответ у мышей на клеточном и гуморальном уровне. Иммунизация проводилась трижды с интервалом в две недели. Спустя шесть недель после иммунизации, в сыворотке мышей детектировались специфические антитела к белку Tul4. Антитела к белку FopA не были обнаружены, что авторы в работе объясняют нерастворимостью использованных пептидов FopA. Таким образом, в данной работе высказана идея о важности иммунизации двумя белками внешней мембраны F. tularensis, но фактически, проведена иммунизация пептидами, представляющими собой эпитоп белка Tul4 и, в качестве адъюванта в препарат были добавлены CpG олигонуклеотиды.
При этом в работе [Hickey AJ, Hazlett KR, Kirimanjeswara GS, Metzger DW. Identification of Francisella tularensis outer membrane protein A (FopA) as a protective antigen for tularemia. Vaccine // 2011. - 29(40). - 6941-7] показано, что иммунизация мышей рекомбинантным белком FopA была способна индуцировать специфичный антительный ответ, защищать мышей от летальной дозы вакцинного штамма LVS, но не вирулентного штамма SchuS4.
В настоящее время активно разрабатываются вакцины на основе вирусных векторов. Они представляют собой рекомбинантные вирусы, в геном которых встроен целевой ген с набором регуляторных элементов. При введении в организм таких вакцин происходит попадание генетического материала в клетки организма и экспрессия в них генов целевых белков патогена. Иммунная система распознает антигены, что приводит к индукции, как гуморального, так и клеточного иммунного ответа [Draper S., Heeney J. Viruses as vaccine vectors for infectious diseases and cancer // Nat. Rev. Microbiol. - 2010. - V. 8. - c. 62-73]. Системы на основе вирусных векторов использовались для разработки субъединичных вакцин против туляремии. В работе [Banik S, Mansour АА, Suresh RV, Wykoff-Clary S, Malik M, McCormick AA, Bakshi CS. Development of a Multivalent Subunit Vaccine against Tularemia Using Tobacco Mosaic Virus (TMV) Based Delivery System // PLoS One. - 2015. - 10(6). - e0130858.] авторы использовали систему на основе вируса табачной мозаики (ВТМ) в качестве носителя иадъюванта для мультивалентной субъединичной вакцины против туляремии. В качестве белков были использованы OmpA - подобный белок, шаперон DnaK или попротеин Tul4 из высоковирулентного штамма F. tularensisSchuS4. Полученные результаты показали, что иммунизация ВТМ с рекомбинантными белками F. tularensis индуцировала гуморальный и клеточный иммунный ответ, а также обладала ограниченной протективностью, защищая 40% мышей от летальных доз штамма F. tularensis LVS.
В настоящей работе в качестве носителей использованы аденовирусы. Аденовирусы обладают рядом преимуществ. Они не патогенны, так как из их генома удалены области, ответственные за патогенность. Такие векторы способны обеспечивать высокий уровень экспрессии целевого трансгена в клетке-мишени, заражать как делящиеся, так и постмитотические клетки. Аденовирусы способны накапливаться в культуре клеток в высоких титрах. Еще одним положительным свойством таких вирусов является то, что они выводятся из организма в течение 4-5 недель. Также процесс получения нового рекомбинантного аденовируса занимает всего несколько недель, что позволяет реагировать на меняющуюся эпидемиологическую обстановку в максимально сжатые сроки [Карпов А. и др. Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, экспрессирующих гены гликопротеинов GB, GE, GI вируса болезни Марека // Биотехнология. - 2007. - Т. 5. - С. 38-44]. Наиболее хорошо изученным и часто используемым в качестве вакцинного вектора является рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа. Безопасность таких аденовирусов с делетированными Е1 и E3 областями генома подтверждается целым рядом проведенных клинических испытаний различных вакцинных и терапевтических препаратов на их основе [Hoelscher М.А. et al., Development of adenoviral-vector-based pandemic influenza vaccine against antigenically distinct human H5N1 strains in mice, Lancet, 2006, №367 (9509), c. 475-81; Van Kampen K.R. et al., Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans // Vaccine, 2005. - №23(8). - c. 1029-36]. Применение генетических вакцин на основе данного аденовируса может быть ограничено наличием предсуществующего иммунного ответа у людей, уже встречавшихся ранее с этим вирусом [Bangari D.S. et al., Comparative transduction efficiencies of human and nonhuman adenoviral vectors in human, murine, bovine, and porcine cells in culture // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2005. - №327. - c. 960-966]. Такого воздействия предсуществующего иммунного ответа можно избежать при интраназальной иммунизации, вместо парентерального введения.
Разработаны быстрые и гибкие технологии получения рекомбинантных аденовирусов, позволяющие реализовать масштабное производство различных кандидатных вакцин на основе аденовирусных векторов на одной технологической линии, без ее переоборудования и изменения регламента. Вышеперечисленные свойства делают рекомбинантные аденовирусы хорошей технологической платформой для создания широкого спектра вакцин против различных заболеваний [Harrop R. et al., Recombinant viral vectors: cancer vaccines // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2006. - №58(8). - c. 931-947; Tang D.C. et al., Overexpression of adenovirus-encoded transgenes from the cytomegalovirus immediate early promoter in irradiated tumor cells // Hum. Gene Ther. - 1997. - №8(17). - c. 2117-2124; Tang D.C. et al., Butyrate-inducible and tumor-restricted gene expression by adenovirus vectors // Cancer Gene Ther. - 1994. - №1(1). - c. 15-20].
Возможность использования аденовирусных частиц для создания вакцин против туляремии обсуждается в патенте US 9,624,510 В2 "Adenoviral vectors comprising partial deletions of e3". При этом патент описывает аденовирусный вектор с частичной делецией в домене E3, как систему для разработки вакцин и генной терапии, но не конкретный вариант иммуногенной композиции против туляремии.
Наиболее близкими аналогами данного изобретения являются описанные в заявке на изобретение US 2015/0030632 A1 и в патенте RU 2270249 С1 «субъединичные» вакцины - иммуногенные композиции на основе белка Tul4. Для композиции, включающей белок Tul4 из патента US 2015/0030632 A1 показана не только иммуногенность, но и протективность - после заражения F. Tularensis SchuS4 выжило 75% мышей, иммунизированных препаратом, содержащим белок Tul4.
Отличие настоящего изобретения от обоих аналогов состоит в том, что, во-первых, для прайм-вакцинации используются аденовирусные частицы в качестве носителей антигенов - белков Tul4, FopA и DnaK, для последующих, бустерных, вакцинаций используются рекомбинантные белки Tul4, FopA и DnaK. Кроме того, в отличие от патентов US 2015/0030632 A1 и RU 2270249 С1 для иммунизации был использован не один белок, а смесь рекомбинантных белков - Tul4, FopA и DnaK. Третьим отличием является то, что для повышения иммуногенности используются два адъюванта - гидроксид алюминия и CpG олигонуклеотиды: частицы гидроксида алюминия применяются для иммобилизации белков на их поверхности, а смесь двух олигонуклеотидов CpG - для дополнительной стимуляции иммунного ответа.
Еще одним аналогом настоящего изобретения является US 2014/0356415 A1, где раскрыта иммуногенная композиция, содержащая белки Tul4, FopA и DnaK. Отличием настоящего изобретения от указанного аналога является использование рекомбинантных белков DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His, что позволяет избегать нежелательных побочных эффектов при введении композиции, так как рекомбинантные белки имеют высокую степень очистки, а также стабильность, что позволяет добиваться высокой стандартизации препаратов.
Раскрытие изобретения:
Техническое решение изобретения выражается в получении композиции на основе рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц (РПАН), несущих гены белковых антигенов F. tularensisDBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His, а также рекомбинантных белков Tul4, FopA и DnaK, которые получают по средствам их экспрессии в клетках непатогенных прокариотических микроорганизмов (штаммов Е. coli) и их дальнейшей аффинной очистке, и двух адъювантов - гидроксида алюминия и двух олигонуклеотидов CpG.
Сущность изобретения выражается в получении композиции на основе рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, экспрессирующих гены tul4, fopA и dnaK белковых антигенов F. Tularensis и отдельных высокоочищенных и стабильных рекомбинантных белков DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His, которые характеризуются высоким уровнем экспрессии и стабильности в бактериальных экспрессионных системах. Полученные РПАН и белки обладают иммуногенностью, как показано в примерах 3 и 5, а также нетоксичны, что делает возможным их использование в составе иммуногенных композиций, направленных на специфическую активацию иммунитета и формирование иммунологической памяти.
Для реализации изобретения решены следующие задачи: (i) сконструированы рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие гены tul4, fopA и dnaK белковых антигенов F. tularensis; (ii) проведена проверка экспрессии генов антигенов из состава рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц методом вестерн-блот на Fc-часть химерных белков; (iii) показана иммуногенность полученных по заявленному изобретению рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих гены tul4, fopA и dnaK белковых антигенов F. tularensis на мышах. Для решения данных задач получают три типа псевдоаденовирусных частиц, несущих гены tul4, fopA и dnaK белковых антигенов F. tularensis, соответственно. При создании конструкций бактериальный лидерный пептид удаляют, и добавляют эукариотический лидерный пептид для индукции гуморального иммунного ответа. Гены клонируют в плазмидный вектор pSh-PA-ILZ-Fc, таким образом, что полученная конструкция содержит ген DnaK (FopA или Tul4, соответственно), а также изолейциновый зиппер (ILZ) и Fc-фрагмент антитела IgG2a (Fc), которые необходимы для гексамеризации антигена, что значительно увеличивает их иммуногенность. Полученные линеаризованные векторы pSh-FopA, pSh-Tul4 и pSh-DnaK смешивают с геномной ДНК рекомбинантного аденовируса Ad5 и котрансформировали в клетки Е. coli (штамм BJ5183). Полученные плазмиды трансформируют в другой штамм Е. coli (DH5alpha), в котором в отличие от штамма BJ5183 возможно препаративное накопление рекомбинантных плазмид. На следующем этапе клетки линии 293 трансфецируют линеаризованными плазмидами, лизируют, и из полученного лизата выделяют псевдоаденовирусные частицы.
Для получения рекомбинантных белков получают плазмиды, содержащие нуклеотидные последовательности рекомбинантных генов, кодирующих рекомбинантные белки DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His. Синтетические ДНК с последовательностями, соответствующими генам, кодирующим белки DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His, спланированные таким образом, чтобы нуклеотидный состав кодонов был оптимизирован для гетерологичной экспрессии в непатогенном лабораторном штамме Е. coli.
После трансформации полученными плазмидами pTUL4, pFOPA и pDNAK получают штаммы-продуценты Е. coli М15 [pREP4, pTul4], Е. coli Ml 5 [pREP4, pFopA] и E.coli M15 [pREP4, pDnaK] с высокой продукцией рекомбинантных белков Tul4, FopA и DnaK в тельцах включения (ТВ). Расчетные молекулярные массы рекомбинантных белков Tul4, FopA и DnaK составляют 30,0, 40,5 и 70,4 кДа, соответственно. Дальнейшая очистка всех индивидуальных рекомбинантных белков DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His производится путем растворения ТВ в денатурирующих условиях и очистки колоночной аффинной хроматографией в денатурирующих условиях на носителях, содержащих в качестве неподвижной фазы декстран (сефадекс), в случае DBD-Tul4 или содержащих иммобилизованный металл (металл-хелатная хроматография) в случае 6-His-FopA и DnaK-6His, с последующим удалением денатурирующих агентов из раствора белков.
В результате очистки получают с высоким выходом высокой степени чистоты рекомбинантные белки DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His, которые характеризуются стабильностью при очистке, обладают иммуногенностью при введении лабораторным животным, что делает возможным их использование в составе иммуногенной композиции, содержащей смесь данных рекомбинантных белков и направленной на специфическую активацию иммунитета и формирование иммунологической памяти.
На этапе получения синтетической последовательности ДНК, кодирующей белок Tul4, настоящий способ отличается от аналога RU 2270249 С1 тем, что слитные (конъюгированные) белки в настоящем изобретении и в аналоге различаются: аминокислотная последовательность белка, заявленного в RU 2270249 С1, содержит последовательность Tul4, слитную с аффинным целлюлозосвязывающим доменом CBD, а в настоящем изобретении последовательность Tul4 конъюгирована с декстрансвязывающим доменом DBD, кодируемым геном белка с декстрансвязывающим доменом из Leuconostoc mesenteroides (DBD1).
Техническим результатом, достигаемым при реализации заявляемой группы изобретений, является получение оптимальных для гетерологичной экспрессии синтетических последовательностей ДНК, кодирующих псевдоаденовирусные частицы, несущие гены tul4, fopA и dnaK, а также рекомбинантные белки, обеспечивающие высокий уровень продукции белков DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His, в непатогенных лабораторных экспрессионных штаммах Е. coli; простую и эффективную очистку белков, обладающих высокой иммунореактивностью; создание вакцинного препарата, содержащего смесь этих белков с двумя адъювантами - гидроксидом алюминия, выступающим в качестве носителя для иммобилизации белков, и CpG, дополнительно стимулирующим иммунную реакцию. Указанный технический результат достигается за счет получения рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих гены белков DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 5, соответственно. Аминокислотная последовательность соответствующих генов SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 и SEQ ID NO 6, соответственно.
Для достижения указанного технического результата также были получены рекомбинантные белки DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His в клетках лабораторных штаммов-продуцентов Е. coli. Для синтеза рекомбинантных белков DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His в клетках лабораторных штаммов-продуцентов Е. coli используются соответствующие рекомбинантные плазмиды с рекомбинантными генами с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 15 или нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 17 или нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 19.
Рекомбинантный белок DBD-Tul4 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO 16, включающую последовательность аминокислотных остатков декстрансвязывающего домена (DBD) из Leuconostoc mesenteroides, глицин-сериновый спейсер и аминокислотную последовательность белка Tul4 F. tularensis.
Рекомбинантный белок 6-His-FopA имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO 18 включающую последовательность 6His, и аминокислотную последовательность белка FopA F. tularensis.
Рекомбинантный белок DnaK-6His имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO 20, включающую аминокислотную последовательность белка DnaK F. tularensis и последовательность 6His.
Кроме того, техническим результатом, достигаемым при осуществлении настоящей группы изобретений, является получение высокого уровня продукции белков DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His (см. пример 1, фиг. 11), которые после очистки способны взаимодействовать с соответствующими антителами (см. пример 4, фиг. 14) и способны вызывать активный иммунный ответ в мышиной модели (см. пример 5, фиг. 15-17).
Наличие в рекомбинантных белках DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His эпитопов (антигенных детерминант), идентичных таковым у природных белков, подтверждается тем, что специфические поликлональные сывороточные антитела кроликов, полученные к рекомбинантным белкам, взаимодействуют с белковыми антигенами вакцинного штамма F. tularensis (см. пример 4, фиг. 14).
Иммуногенность препарата рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих гены tul4, fopA и dnaK подтверждается появлением выраженной иммунной реакции in vivo в мышиной модели (см. пример 3). Что является еще одним техническим результатом.
Для получения такого технического результата как иммуногенность препарата рекомбинантных белков DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His, созданные рекомбинантные белки с последовательностями SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 были включены в состав вакцинного препарата, содержащего адъюванты - гидроксид алюминия и CpG олигонуклеотиды. В части формулирования вакцинного препарата, содержащего смесь рекомбинантных белков с адъювантами - гидроокисью алюминия и олигонуклеотидов CpG, технический результат достигается за счет создания белков DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His с указанными последовательностями SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, а также за счет иммобилизации этих белков на поверхности частиц в суспензии гидроокиси алюминия и за счет дополнительной стимуляции иммунного ответа олигонуклеотидами CpG.
Иммуногенность смеси рекомбинантных белков в составе вакцинного препарата с адъювантами - гидроокисью алюминия и CpG олигонуклеотидами - была исследована in vivo в мышиной модели. Результат проявился в виде формирования выраженной иммунной реакции и стимуляции образования специфических антител ко всем трем белковым антигенам, входящим в состав вакцинной композиции (см. пример 5, фиг. 15-18).
Изобретение также позволяет специфически индуцировать иммунитет, включающий иммунизацию мышей рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами, несущими гены tul4, fopA и dnaK белковых антигенов F. tularensis и последующую двукратную иммунизацию мышей подкожно с интервалом в две недели препаратом, содержащим рекомбинантные белки DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His и адъюванты - гидроксид алюминия и CpG олигонуклеотиды (см. пример 6).
Таким образом, изобретение позволяет получить стабильный и устойчивый иммунный ответ на Franciella tularensis.
Изобретение проиллюстрировано следующими примерами, приведенными ниже.
Описание фигур
На представленных фигурах обозначения Tul4, FopA и DnaK соответствуют белкам DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His.
На фиг. 1 показана Схема экспрессирующей кассеты рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, несущей гены белковых антигенов F. tularensis (tul4 или fopA или dnaK соответственно). Где: CMV - промотор цитомегаловируса человека; трансген - ген белковых антигенов F. tularensistul4 или fopA или dnaK; рА - сигнал полиаденилирования SV40 (Simian vacuolating virus 40); Ad5 - геномная часть аденовируса человека 5 серотипа, ΔЕ1, ΔЕ3 - делеции Е1 и E3 областей аденовирусного генома.
На фиг. 2 показаны результаты анализа клонов методом ПЦР на наличие генов, кодирующих антигены DnaK, Tul4, FopA. Дорожки 1-5 в виде полос детектируются клоны плазмиды pSh-DnaK, К+ - положительный контроль, К - - отрицательный контроль (полоса отсутствует), М - маркер молекулярной массы pUC19, гидролизованный по Hpall, на треках 6, 7 в виде полос детектируются клоны плазмиды pSh-Tul4, К+ - положительный контроль, К- - отрицательный контроль (полоса отсутствует), на треках 8-12 в виде полос детектируются клоны плазмиды pSh-FopA, К+ - положительный контроль, К- - отрицательный контроль (полоса отсутствует).
На фиг. 3 представлены результаты анализа клонов: с использованием эндонуклеаз рестрикции NotI+HinDIII. Дорожки 1 - pET-FopA, 2 - pSh-FopA, 3 - pET-Tul4, 4 - pSh-Tul4, 5 - pET-DnaK, 6 - pSh-DnaK; с использованием эндонуклеаз рестрикции NotI+XhoI: 7 - pET-FopA, 8 - pSh-FopA, 9 - pET-Tul4, 10 - pSh-Tul4, 11 - pET-DnaK, 12 - pSh-DnaK; не гидролизованные плазмиды: 13 - pET-FopA, 14 - pSh-FopA, 15 - pET-Tul4,16 - pSh-Tul4, 17 - pET-DnaK, 18 - pSh-DnaK.
На фиг. 4 представлены результаты анализа клонов методом ПЦР a) Ad5-DnaK, б), Ad5-FopA, в) Ad5-Tul4. Дорожки 1-16 - ПЦР-продукты, полученные при анализе, (М) Маркер молекулярной массы (ДНК фага лямбда, гидролизованная по сайту PstI).
На фиг. 5 представлены результаты анализа положительных клонов методом ПЦР. Дорожки К- - отрицательный контроль (полоса отсутствует), 3 pAd5-DnaK, 7 pAd5-DnaK, К+ - pSh-DnaK (положительный контроль), К- - отрицательный контроль (полоса отсутствует), 1 pAd5-FopA, 5 pAd5-FopA, К+ - pSh-FopA (положительный контроль), К- - отрицательный контроль (полоса отсутствует), 5 pAd5-Tul4, 9 pAd5-Tul4, К+ - pSh-Tul4 (положительный контроль).
На фиг. 6 показана электрофореграмма результатов гидролиза плазмидной ДНК эндонуклеазой рестрикции NotI. Дорожки (1) pAd5-Tul4, (2) pAd5-FopA, (3) pAd5-DnaK, (4) pAd5-EASY, M - маркер молекулярных масс (ДНК фага лямбда, гидролизованная по сайту PstI).
На фиг. 7 показаны результаты вестерн-блоттинга. Дорожки (М) Маркер молекулярной массы №266166, (1) Отрицательный контроль (К-), (2) Экспрессированный антиген Tul4 рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами, несущими ген белкового антигена F. tularensis Tul4, (3) Экспрессированный антиген FopA рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами, несущими ген fopA белкового антигена F. tularensis, (4) Экспрессированный антиген DnaK рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами, несущими ген dnaK белкового антигена F. tularensis, (5) - Положительный контроль (К+) (PA-ILZ-Fc), а - тример Tul4-ILZ-Fc (137 кДа), б - тример FopA-ILZ-Fc (213 кДа), в - тример DnaK-ILZ-Fc (303 кДа), г - тример PA-ILZ-Fc (144 кДа).
На фиг. 8 показана диаграмма изменения титра антител к белку FopA, полученная при анализе пулированных сывороток мышей, иммунизированных вакцинным препаратом, содержащим аденовирусные частицы в сравнении с контрольной группой, а) Иммунный ответ на FopA в контрольной группе; б) Иммунный ответ на FopA-компоненты препарата.
На фиг. 9 показана диаграмма изменения титра антител к белку DnaK, полученная при анализе пулированных сывороток мышей, иммунизированных вакцинным препаратом, содержащим аденовирусные частицы в сравнении с контрольной группой, а) Иммунный ответ на DnaK в контрольной группе; б) Иммунный ответ на DnaK-компоненты препарата.
На фиг. 10 показана диаграмма изменения титра антител к белку Tul4, полученная при анализе пулированных сывороток мышей, иммунизированных вакцинным препаратом, содержащим аденовирусные частицы в сравнении с контрольной группой, а) Иммунный ответ на Tul4 в контрольной группе; б) Иммунный ответ на Tul4-компоненты препарата.
На фиг. 11 представлена электрофореграмма экстрактов клеток продуцентов рекомбинантных белков Tul4, FopA и DnaK до и после индукции IPTG. Дорожки (1) Е. coli M15 [pRep4, pTul4] до индукции; (2) Е. coli M15 [pRep4, pTul4] после индукции - рекомбинантный белок Tul4, 30 кДа; (3) Е. coli M15 [pRep4, pFopA] до индукции; (4) Е. coli M15 [pRep4, pFopA] после индукции - рекомбинантный белок FopA, 40 кДа; (5) Е. coli M15 [pRep4, pDnaK] до индукции; (6) Е. coli M15 [pRep4, pDnaK] после индукции - рекомбинантный белок DnaK, 70 кДа; (7) маркеры молекулярной массы.
На фиг. 12 представлена электрофореграмма образцов рекомбинантного белка DBD-Tul4 на различных стадиях очистки. Дорожки: М - маркеры молекулярной массы, (1) экстракт клеток продуцента после индукции IPTG, (2) супернатант (легко растворимые клеточные белки продуцента), (3) отмытые тельца включения, (4) элюат с колонки с сефадексом G-150.
На фиг. 13 представлена электрофореграмма образцов рекомбинантного белка FopA на различных стадиях очистки. Дорожки: (М) маркеры молекулярной массы, (1) экстракт клеток продуцента после индукции IPTG, (2) супернатант (легко растворимые клеточные белки продуцента), (3) - отмытые тельца включения, (4) элюат с колонки с сорбентом WorkBeads 40 Ni.
На фиг. 14 представлена нитроцеллюлозная мембрана с перенесенными белками, окрашенная мышиными антисыворотками, полученными после иммунизации препаратом трех рекомбинантных белков Tul4, FopA, DnaK с адъювантами, и субстратами пероксидазы - ДАБ и перекисью водорода. Дорожки 1, 2 - лабораторный образец раствора рекомбинантного белка Tul4 0,5 и 0,05 мг/мл, соответственно; 4,5 - лабораторный образец раствора рекомбинантного белка FopA 0,5 и 0,05 мг/мл, соответственно; 7,8 - лабораторный образец раствора рекомбинантного белка DnaK 0,5 и 0,05 мг/мл, соответственно; 3,6,9 - экстракт вакцинного штамма F. tularensis; М - белковые маркеры молекулярной массы.
На фиг. 15 представлена диаграмма изменения титра антител к FopA. а) в ответ на введение раствора адъювантов в контрольной группе животных; б) в сыворотке мышей после двукратного введения препарата трех рекомбинантных белков Tul4, FopA, DnaK с адъювантами.
На фиг. 16 представлена диаграмма изменения титра антител к DnaK. а) в ответ на введение раствора адъювантов в контрольной группе животных; б) в сыворотке мышей после двукратного введения препарата трех рекомбинантных белков Tul4, FopA, DnaK с адъювантами.
На фиг. 17 представлена диаграмма изменения титра антител к Tul4. а) в ответ на введение раствора адъювантов в контрольной группе животных; б) в сыворотке мышей после двукратного введения препарата трех рекомбинантных белков Tul4, FopA, DnaK с адъювантами.
На фиг. 18 представлен результат иммуноблоттинга - нитроцеллюлозная мембрана с перенесенными белками, окрашенная мышиными антисыворотками, полученными после иммунизации препаратом трех рекомбинантных белков Tul4, FopA, DnaK с адъювантами, и субстратами пероксидазы - ДАБ и перекисью водорода. (1) лабораторный образец раствора рекомбинантного белка Tul4, (2) лабораторный образец раствора рекомбинантного белка FopA, (3) лабораторный образец раствора рекомбинантного белка DnaK, (4) экстракт клеток вакцинного штамма.
На фиг. 19 представлена диаграмма изменения титра антител к FopA. а) в ответ на введение раствора адъювантов в контрольной группе животных; б) в сыворотке мышей после иммунизации рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами в качестве прайм-компонента и двукратной иммунизации препаратом трех рекомбинантных белков Tul4, FopA, DnaK с адъювантами в качестве бустерного компонента.
На фиг. 20 представлена диаграмма изменения титра антител к DnaK. а) в ответ на введение раствора адъювантов в контрольной группе животных; б) в сыворотке мышей после иммунизации рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами в качестве прайм-компонента и двукратной иммунизации препаратом трех рекомбинантных белков Tul4, FopA, DnaK с адъювантами в качестве бустерного компонента.
На фиг. 21 представлена диаграмма изменения титра антител к Tul4. а) в ответ на введение раствора адъювантов в контрольной группе животных; б) в сыворотке мышей после иммунизации рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами в качестве прайм-компонента и двукратной иммунизации препаратом трех рекомбинантных белков Tul4, FopA, DnaK с адъювантами в качестве бустерного компонента.
Конкретно настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, включающей (i) прайм-компонент, состоящий из рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц: частиц, несущих ген tul4 Francisella tularensisc последовательностью SEQ ID NO 1, частиц, несущих ген fopA Francisella tularensis с последовательностью SEQ ID NO 3 и частиц, несущих ген dnaK Francisella tularensis с последовательностью SEQ ID NO 5, при этом указанные гены оптимизированы для экспрессии в эукариотических клетках, и/или (ii) бустерный компонент, включающий рекомбинантные белки: белок DBD-Tul4 с последовательностью SEQ ID NO 16, молекулярной массой 30,0 кДа, содержащий декстрансвязывающий домен декстрансукразы из L. citreum КМ20, представленный аминокислотными остатками 1-140 SEQ ID NO 16, Gly-Ser спейсер, представленный остатками 141-150 SEQ ID NO 16 и последовательность белка Tul4 Franciella tularensis, представленной остатками 151-282 SEQ ID NO 16; белок 6-His-FopA с последовательностью SEQ ID NO 18, молекулярной массой 40,5 кДа; белок DnaK-6His с последовательностью SEQ ID NO 20, молекулярной массой 70,4 кДа, а также содержащая фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
Предпочтительно иммуногенная композиция представляет собой вакцину, индуцирующую иммунный ответ против Franciella tularensis.
Предпочтительно иммуногенная композиция используется для индукции специфического клеточного и гуморального иммунитета против Franciella tularensis, по средствам введения прайм-компонента интраназально и введения бустерного компонента подкожно, дважды с интервалом в две недели.
Настоящее изобретение также относится к способу получения указанной иммуногенной композиции, включающему получение трех типов псевдоаденовирусных частиц, несущих гены tul4, fopA и dnaK белковых антигенов F. tularensis, соответственно, при этом бактериальный лидерный пептид удаляют, и добавляют эукариотический лидерный пептид, каждый ген клонируют в свой плазмидный вектор pSh-PA-ILZ-Fc, куда также клонируют изолейциновый зиппер (ILZ) и Fc-фрагмент антитела IgG2a (Fc), полученные линеаризованные векторы pSh-FopA, pSh-Tul4 и pSh-DnaK смешивают с геномной ДНК рекомбинантного аденовируса Ad5 и котрансформируют в клетки Е. coli штамма BJ5183, полученные плазмиды трансформируют в штамм Е. coli DH5alpha, затем клетки линии 293 трансфецируют линеаризованными плазмидами, лизируют, и из полученного лизата выделяют псевдоаденовирусные частицы; получают рекомбинантные белки Tul4, FopA и DnaK, для чего получают плазмиды, содержащие, синтетические ДНК с последовательностями, соответствующими генам, кодирующим белки DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His, где нуклеотидный состав кодонов оптимизирован для гетерологичной экспрессии в непатогенном лабораторном штамме Е. coli, на основе указанных плазмид pTUL4, pFOPA и pDNAK получают штаммы-продуценты Е. coli М15 [pREP4, pTul4], Е. coli М15 [pREP4, pFopA] и E.coli M15 [pREP4, pDnaK] с высокой продукцией рекомбинантных белков Tul4, FopA и DnaK в тельцах включения (ТВ), дальнейшая очистка всех индивидуальных рекомбинантных белков DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His производится путем растворения ТВ в денатурирующих условиях и проведении колоночной аффинной хроматографией в денатурирующих условиях на носителях, содержащих в качестве неподвижной фазы декстран (сефадекс), в случае DBD-Tul4 или содержащих иммобилизованный металл (металл-хелатная хроматография) в случае 6-His-FopA и DnaK-6His, с последующим удалением денатурирующих агентов из раствора белков, на основе полученных псевдовирусных частиц и белков готовят композицию, содержащую либо псевдовирусные частицы, либо белки, либо комбинацию псевдовирусных частиц и белков.
В одном из вариантов воплощения настоящего способа псевдовирусные частицы и белки подвергают лиофильной сушке.
Примеры
Пример 1. Конструирование и получение рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих гены белковых антигенов F. tularensis Tul4, FopA и DnaK.
В данном примере показан ход конструирования рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих гены tul4, fopA и dnaK белковых антигенов F. tularensis, и процесс их получения.
Первым этапом является процесс разработки генетических конструкций и в дальнейшем получение соответствующих рекомбинантных аденовирусов, несущих гены tul4, fop А и dnaK белковых антигенов F. tularensis Tul4, FopA и DnaK (Ad-tul4, Ad-fop A, Ad-dnaK) (см. Фиг. 1).
Аминокислотные последовательности антигенов Francisella tularensis были получены из базы данных UniProt: DnaK - Q14GW9, FopA - Q5NH85, Tul4 - P18149. Бактериальный лидерный пептид в генах fopA и tul4 был удален. Для индукции гуморального иммунного ответа ко всем трем генам был добавлен эукариотический лидерный пептид. Кодонный состав генов был оптимизирован под экспрессию в клетках Mus musculus. В ЗАО «Евроген» были синтезированы гены fopa, dnak и tul4 и включены в составе плазмид рЕТ28а. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности генов белков Tul4 (SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2), FopA (SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 4), DnaK (SEQ ID NO 5 и SEQ ID NO 6) приведены в списке последовательностей.
Гены были клонированы по рестрикционным сайтам NotI и XhoI в плазмидный вектор pSh-PA-ILZ-Fc, таким образом, удален ген РА (ген протективного антигена) и вместо него вставлен ген dnaK (fopA или tul4 соответственно). Изолейциновый зиппер (ILZ) и Fc-фрагмент антитела IgG2a (Fc) необходимы для гексамеризации антигена, что значительно увеличивает иммуногенность антигенов [Shcherbinin D.N. et al. Protective immune response against Bacillus anthracis induced by intranasal introduction of a recombinant Adenovirus Expressing the Protective Antigen Fused to the Fc-fragment of IgG2a // Acta Naturae - 2014, - V. 6 - №1 - c. 76-84].
С целью определения наличия антигена был проведен анализ клонов методом ПЦР. Результаты представлены на фиг. 2. При анализе использовали следующие пары праймеров, представленные в перечне последовательностей, для определения dnaK были использованы праймеры SEQ ID NO 7 и SEQ ID NO 8, fopA SEQ ID NO 9 и SEQ ID NO 10, tul4 - SEQ ID NO 11 и SEQ ID NO 12.
Также был проведен анализ клонов по молекулярному весу и рестрикционным картированием. Результаты представлены на фиг. 3.
Полученные векторы pSh-FopA, pSh-Tul4 и pSh-DnaK линеаризовали с помощью эндонуклеазы рестрикции Pmel, смешивали с геномной ДНК рекомбинантного аденовируса Ad5 и котрансформировали в клетки Е. coli (штамм BJ5183). Далее полученные клоны анализировали методом ПЦР на наличие гексона Ad5. Результаты представлены на фиг. 4. Для постановки ПЦР использовали праймеры на наличие гексона Ad5 (SEQ ID NO 13 и SEQ ID NO 14). Положительные клоны анализировали методом ПЦР на наличие антигена. Результаты представлены на фиг. 5.
Полученные клоны трансформировали в штамм Е. coli (DH5 alpha), в котором возможно препаративное накопление рекомбинантных плазмид. Выделенную плазмидную ДНК анализировали рестрикцией по сайту NotI (Фиг. 6).
На следующем этапе клетки линии 293 были трансфецированы плазмидами, гидролизованными с помощью эндонуклеазы рестрикции PacI. Трансфекцию проводили в 24-луночном планшете с использованием реактива Lipofectamine 2000 ("Invitrogen"). Через 10 дней после трансфекции клетки собирали, замораживали-оттаивали и полученным лизатом, содержащим рекомбинантные аденовирусы, заражали клетки 293 линии в 35 мм чашке. Через 5 дней наблюдали специфический лизис клеток, обусловленный цитопатическим действием вирусов. Из полученного препарата рекомбинантные вирусы были размножены на клетках 293 линии и получено препаративное количество данного вируса. Для этого клетки 293 линии, выращенные на 150 мм культуральных чашках, были инфицированы рекомбинантными аденовирусами в дозе 107 БОЕ/чашку (бляшкообразующих единиц на чашку). Инфицированную культуру инкубировали 72 часа, после чего клетки были собраны, путем перемораживания был приготовлен лизат. Лизированные клетки отделяли от жидкости, содержащей вирус, центрифугированием при 2000 об/мин. Концентрирование и очистку вируса проводили двукратным ультрацентрифугированием в градиенте хлористого цезия. Титр препарата вирусов определяли методом бляшкообразования в культуре клеток линии 293. В результате было получено около 50 о.е. (оптических единиц) каждого вируса с титром 5×109 БОЕ/мл (бляшкообразующих единиц на чашку).
Пример 2. Проверка экспрессии антигенов из состава рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц методом вестерн-блоттинга со специфическими антителами к Fc-части химерных белков.
Клетки А549 на 25 см матрасе были трансдуцированы рекомбинантными аденовирусами. Через 24 часа среду меняли на среду DMEM, содержащую 2% бычьей сыворотки, и инкубировали 6 дней. Среду собирали, концентрировали в 10 раз, добавляли 1/3 объема буфера образца, содержащего дитиотреитол, и прогревали 10 минут при 98°С. Для детекции использовали мышиные антитела анти-IgG, меченные пероксидазой хрена. Обнаружение полос проводили методом хемилюминесценции.
Поскольку антиген может быть в мультимерной форме, были рассчитаны молекулярные массы для каждой из форм, представленные в Табл. 1.
По результатам вестерн-блоттинга были обнаружены тримерные формы антигенов (Фиг. 7). Ниже 100 кДа не наблюдалось полос ни в одном из треков. Цистеиновые S-S связи в Fc-фрагменте восстановились дитиотреитолом до SH-групп. Благодаря гидрофобным взаимодействиям изолейциновый зиппер после прогревания, по-видимому, вновь образовал тримеры. Вестерн-блоттинг образцов в неденатурирующих условиях не проводили, так как из-за большой молекулярной массы возможно не вхождение белков в гель даже с минимальной процентным содержанием акриламида/метиленбисакриламида. Наблюдаемые в некоторых пробах при специфическом окрашивании полосы выше зон, соответствующих трехмерным формам, свидетельствуют о возможной гексамеризации антигенов.
Таким образом, в данном примере продемонстрирована эффективная экспрессия DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His полученными конструкциями (псевдоаденовирусными частицами, несущими гены tul4, fopA и dnaK белковых антигенов F. tularensis Tul4, FopA, DnaK).
Пример 3. Определение в опытах на мышах иммуногенности полученных по заявленному изобретению рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих гены белковых антигенов F. tularensis Tul4, FopA и DnaK.
Иммуногенность рекомбинантных аденовирусов, содержащих гены tul4, fopA и dnaK F. tularensis Tul4, FopA и DnaK оценивали на мышиной модели. Объектом исследования служили мыши (Mus musculus) линии Balb/c, самки, в возрасте ~4-5 недель.
Животные распределялись по группам по 10 особей по критерию массы тела таким образом, чтобы индивидуальное значение массы не отклонялось от среднего значения более чем на ±10%. В экспериментальной группе животные были иммунизированы интраназально по 50 мкл в каждую ноздрю препаратом, содержащим аденовирусные частицы трех типов. Одна доза вакцинного препарата (100 мкл) содержала: РПАН, несущие ген белка 6-His-FopA F. tularensis - 1,4×108 БОЕ; РПАН, несущие ген белка DBD-Tul4F. tularensis - 1,2×108 БОЕ; РПАН, несущие ген белка DnaK-6HisF. tularensis - 1,3×108 БОЕ. В контрольной группе мыши были иммунизированы физиологическим раствором.
Оценка состояния здоровья во время клинического осмотра проводилась по демонстрации животными неспровоцированного поведения, внешним признакам благополучного состояния здоровья, изменению массы тела, изменениям измеряемых клинических показателей и проявлению ожидаемой ответной реакции на стимул. Оценка выраженности боли, дистресса и страданий осуществлялась в соответствии с международными руководствами [Kohn D.F. et al. Public statement: guidelines for the assessment and management of pain in rodents and rabbits // J Am Assoc Lab Anim Sci, 2007. - №46(2). - c. 97-108; Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals, Washington, D.C., THE NATIONAL ACADEMIES PRESS, 2008, 132 p.],
В течение всего эксперимента состояние животных соответствовало физиологическому. Отклонений в поведении не отмечено. Проявлений болевого синдрома, признаков дистресса не выявлено. Животные на протяжении всего исследования были активные, реагировали на внешние стимулы. Выделение кала и мочи было нормальное. Шерстный покров был чистый и опрятный. Гибели животных зарегистрировано не было, вынужденная эвтаназия не проводилась. Для оценки иммуногенности проводили определение титров специфичных антител к каждому компоненту в сыворотке крови иммунизированных мышей до иммунизации, спустя 2 и 4 недели после иммунизации. Титр антител к белку FopA со временем менялся незначительно и к финалу эксперимента достигал значений немногим более 1:10000, как видно из фиг. 8б. В случае с DnaK, даже на ранних стадиях эксперимента титр к DnaK превышал 1:10000, а финальный титр достигал значений более 1:100000 (Фиг. 9б). Иммунный ответ на препарат, содержащий три вида аденовирусных частиц, продемонстрировал близкие показатели титра специфичных антител к Tul4, который составлял примерно 100000 в финальной пункции сыворотки (Фиг. 10б).
В контрольной группе животных не наблюдалось повышения уровня антител ни к одному из трех белков, как видно из фиг. 8а, 9а, 10а.
Таким образом, продемонстрирована иммуногенность полученных по заявленному изобретению рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих гены белковых антигенов F. tularensis Tul4, FopA и DnaK.
Пример 4. Получение экспрессионных плазмид pTUL4, pFOPA и pDNAK.
а) Получение синтетических генов, кодирующих белки DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His.
Генно-инженерные и микробиологические манипуляции, амплификацию и секвенирование ДНК проводили по стандартным методикам [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир. 1984. Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера, Пер. с англ., М.: Мир. 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science - 1988. Vol. 239 - P. 487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors (DNA polymerase/nucleotide sequences/bacteriophage ФХ174) // Proc. Nat. Acad. Sci. - 1977. - Vol. 74, - Р. 5463-5467].
Синтетическая последовательность ДНК, соответствующая гену, кодирующему белок Tul4 (WP 003014685.1), была спланирована таким образом, чтобы нуклеотидный состав кодонов был оптимизирован для гетерологичной экспрессии в непатогенном лабораторном штамме Е. coli. Оптимизацию кодонного состава синтетического гена проводили с помощью программы JCat (http://www.jcat.de/), корректировку вторичной структуры транскрибируемой РНК - с помощью веб-сервера DINAMelt (http://mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Two-state-folding). Синтетический ген tul4 был фланкирован на 5'-конце сайтом Ncol, а на 3'-конце - сайтом Kpn2I. Аналогичным образом были получены последовательности генов dnaK и fopA.
Нуклеотидные последовательности трех генов tul4, fopA, dnaK были синтезированы твердофазным амидофосфитным методом (ЗАО «Евроген», Россия) на синтезаторе Applied Biosystems ABI 3900.
б) Получение и клонирование рекомбинантных генов tul4, fopA, dnaK в плазмидные вектора.
Последовательности генов tul4, fopA, dnaK были встроены в плазмиду pQE6 под промотор фага Т5. Затем последовательность гена tul4 была клонирована в плазмиду pR1073, содержащую последовательность декстрансвязывающего домена из Leuconostoc mesenteroides (DBD1) и нуклеотидную последовательность GS-спейсера на С-конце. Полученная рекомбинантная плазмида pTul4 содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 15, включающую ген, кодирующий DBD, последовательность, кодирующую GS-спейсер, и нуклеотидную последовательность гена, кодирующего белок Tul4. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO 16 соответствующего рекомбинантного белка DBD-Tul4 приведена в списке последовательностей.
Последовательности гена fopA была переклонирована в плазмиду pQE13, содержащую последовательность, кодирующую 6His на N-конце. Полученная рекомбинантная плазмида pFopA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 17, включающую последовательность гена белка FopA и последовательность, кодирующую 6His на N-конце. Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка 6-His-FopA SEQ ID NO 18 приведена в списке последовательностей.
Последовательность гена dnaK была переклонирована в плазмиду pQE16, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую 6His на С-конце. Полученная рекомбинантная плазмида pDnaK содержит SEQ ID NO 19, включающую нуклеотидную последовательность гена белка DnaK и нуклеотидную последовательность, кодирующую 6His на С-конце. Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка DnaK-6His SEQ ID NO 20 приведена в списке последовательностей.
Полученными конструкциями pTul4, pFopA и pDnaK трансформировали штамм Е. coli M15 [pREP4] и получали штаммы-продуценты Е. coli М15 [pREP4, pTul4], Е. coli М15 [pREP4, pFopA] и E.coli M15 [pREP4, pDnaK] с уровнем продукции белка Tul4 30%, уровнем продукции белка FopA 25% и уровнем продукции белка DnaK 20% от тотального белка клетки (фиг. 11).
Пример 5. Очистка рекомбинантного белка DBD-Tul4.
Для получения рекомбинантного белка DBD-Tul4 биомассу продуцента Е. coli М15 [pREP4, pTul4] ресуспендировали в 5 - 10-кратном объеме буферного раствора. Для лизиса продуцента DBD-Tul4 использовали буфер: 10 мМ Tris-HCl, рН 8,0; 50 мМ NaCl; 0,15 мМ PMSF; 0,1% Тритон Х-100; 0,5 мг/мл лизоцима. Инкубировали 1 ч при комнатной температуре, периодически перемешивая. Обрабатывали полученную суспензию ультразвуком для дезинтеграции клеток с помощью ультразвукового дезинтегратора. Центрифугировали 30 мин при 10000 g и температуре 5°C. Целевой белок DBD-Tul4 находился в тельцах включения (ТВ), т.е. в осадочной фракции. Осадок, полученный после лизиса биомассы и центрифугирования (ТВ), отмывали 10-кратным объемом буферного раствора: 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 500 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100 и растворяли в буфере: 10 мМ Tris-HCl, рН 8,0; 50 мМ NaCl; 8 М мочевины; 0,1% Тритон X-100. Центрифугировали при 12000 об/мин в течение 30 мин. Очистку белка проводили методом аффинной хроматографии на декстран содержащем сорбенте (сефадекс G-150). Раствор белка перед адсорбцией на сорбенте разбавляли в 4 раза буфером без мочевины 10 мМ Tris-HCl, рН 8,0; 50 мМ NaCl; 0,1% Тритон Х-100. Элюцию целевого белка проводили раствором 8 М мочевины в 10 мМ Tris-HCl, рН 8,0. Инкубировали полученные белковые фракции в буфере для элюции в течение суток для обеспечения конформационной гомогенности белка. Для удаления мочевины образцы диализовали против дистиллированной воды с двукратной сменой при температуре 4°C. Полученный раствор белка DBD-Tul4 расфасовывали в полипропиленовые пробирки и замораживали при температуре минус 20°C. Далее их хранили в замороженном виде при -70°C. Электрофореграмма образцов рекомбинантного белка DBD-Tul4 на различных стадиях очистки представлена на фиг. 12.
Пример 6. Очистка рекомбинантного белка 6-His-FopA.
Для получения рекомбинантного белка 6-His-FopA биомассу продуцента Е. coli М15 [pREP4, pFopA] ресуспендировали в 5 - 10-кратном объеме буферного раствора. Для лизиса использовали буфер: 20 мМ имидазол-HCl, рН 8,0; 50 мМ NaCl; 0,15 мМ PMSF; 0,1% Тритон Х-100; 0,5 мг/мл лизоцима. Инкубировали 1 ч при комнатной температуре, периодически перемешивая. Обрабатывали полученную суспензию ультразвуком для дезинтеграции клеток с помощью ультразвукового дезинтегратора. Центрифугировали 30 мин при 10000 g и температуре 5°C. Целевой белок 6-His-FopA находился в тельцах включения, т.е. в осадочной фракции. Осадок, полученный после лизиса и дезинтеграции 1 г биомассы и центрифугирования (ТВ), отмывали 10-кратным объемом буферного раствора: 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 500 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100 и растворяли в буфере: 20 мМ имидазол-HCl, рН 8,0; 0,5 М NaCl; 8 М мочевины; 0,1% Тритон Х-100. Центрифугировали при 12000 об/мин в течение 30 мин. Очистку белка проводили методом колоночной металл-хелатной аффинной хроматографии на сорбенте WorkBeads 40 Ni в денатурирующих условиях. Элюцию целевого белка проводили градиентом имидазола от 20 до 500 мМ в 7 М мочевине.
Инкубировали полученные белковые фракции в том же буфере, в котором проводилась элюция, в течение суток для обеспечения конформационной стабилизации белка. Для удаления имидазола и мочевины элюат диализовали против 1 л 10 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, рН 8,0 при температуре 4°C с двукратной сменой буфера. Раствор белка FopA расфасовывали в полипропиленовые пробирки и замораживали при температуре минус 20°C. Далее их хранили в замороженном виде при -70°C.
Электрофореграмма образцов рекомбинантного белка 6-His-FopA на различных стадиях очистки представлена на фиг. 13.
Пример 7. Иммунноблоттинг рекомбинантных белков DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His.
Для подтверждения сходства антигенных детерминант (эпитопов) рекомбинантных белков и соответствующих белков F. tularensis был проведен электрофорез рекомбинантных белков в полиакриламидном геле с последующим иммуноблоттингом с применением специфических кроличьих антисывороток (поликлональных антител), полученных к высокоочищенным рекомбинантным белкам DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His, и белкового экстракта аттенуированного вакцинного штамма туляремии (F. tularensis вакцинный штамм 15 НИИЭГ). Кроличьи антисыворотки к высокоочищенным рекомбинантным белкам DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His были получены с высокими титрами (в ИФА от 1:100000 до 1:500000), что позволило выявить присутствие соответствующих природных белков-антигенов в экстракте аттенуированного вакцинного штамма туляремии (F. tularensis вакцинный штамм 15 НИИЭГ), и, с другой стороны, подтвердило идентичность антигенных свойств природных белков и соответствующих рекомбинантных белков. В качестве отрицательного контроля использовался экстракт белков, приготовленный из суспензии клеток нетрансформированного штамма Е. coli M15, вкачестве положительного - экстракт клеточных белков вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. После электрофореза по Лэммли в полиакриламидном геле рекомбинантные белки перенесли на нитроцеллюлозную мембрану. Далее мембрану разделили на части, соответствующие отдельным белкам (как показано на фиг. 14) и инкубировали с растворами соответствующих кроличьих антисывороток (первичных антител) в разведении 1:2500 в TBS-TW с 0,5 мг/мл БСА. После инкубации мембрану промыли и инкубировали на шейкере при комнатной температуре в течение часа с козлиными антителами к иммуноглобулинам кролика, коньюгированными с пероксидазой хрена (p-GAR, ИМТЕК, Россия) в разведении 1:5000 и окрасили в растворе субстратов пероксидазы (диаминобензидина - ДАБ и перекиси водорода) в темноте до проявления четко видимых коричневых полос. Результат окрашивания ДАБ представлен на фиг. 14. В контрольном образце - экстракте белков штамма Е. coli M15, производными которого являются штаммы-продуценты рекомбинантных белков, окраска отсутствует.
Пример 8. Проверка иммуногенности рекомбинантных белков DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His.
Для эксперимента были использованы две группы самок мышей линии Balb/c с SPF-статусом здоровья, по 10 штук в каждой. Экспериментальной группе подкожно два раза с интервалом две недели вводили 50 мкл препарата, содержащего три типа рекомбинантных белков, а также адъювант. Препарат содержал по 10 мкг каждого рекомбинантного белка (DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His), в качестве адъюванта были использованы гидроксид алюминия - 1 мг и CpG олигонуклеотиды - 0,3 мг (по 0,15 мг CpG ODN 1585 и ODN 1826). Контрольной группе вводили раствор, содержащий адъюванты без рекомбинантных белков (гидроксид алюминия - 1 мг и CpG олигонуклеотиды - 0,3 мг (по 0,15 мг CpG ODN 1585 и ODN 1826)). Перед введением препарата и спустя 2 недели после каждого введения у всех животных брали кровь для оценки гуморального иммунного ответа. Для оценки иммуногенности компонентов препарата было проведено определение титров антител, специфичных к каждому из рекомбинантных белков, в контрольной и опытной группах.
Как видно на фиг. 15а, 16а, 17а, в течение всего эксперимента в пулированных сыворотках контрольной группы, которой был введен адъювант без рекомбинантных белков, не происходит нарастания титра антител, специфичных к FopA, DnaK и Tul4 - компонентам препарата, соответственно.
В то же время после двукратной иммунизации препаратом наблюдались высокие титры антител, специфичных к белку FopA (фиг. 15б). Столь же высокий финальный титр наблюдался для белка DnaK (см. фиг. 16б) и Tul4 (как показано на фиг. 17б).
Специфичность иммунного ответа к выбранным антигенам подтверждена с помощью иммуноблоттинга к рекомбинантным белкам и белкам лизата вакцинного штамма (см. фиг. 18). Нитроцеллюлозные мембраны после переноса белков инкубировали с первичной мышиной антисывороткой в разведении 1:2500. Затем мембраны инкубировали со вторичными антителами (конъюгированными с пероксидазой хрена кроличьими антителами против иммуноглобулинов мыши, IMTEK) в разведении 1:5000. Проявляли реакцией с диаминобензидином (ДАБ) и перекисью водорода.
Неспецифичной реакции в ответ на введение растворов и адъювантов, включенных в вакцину, не было обнаружено (фиг. 18). Результаты свидетельствуют о том, что полученные рекомбинантные белковые антигены F. tularensis (Tul4, DnaK, FopA) в совокупности с выбранными адъювантами обладают высокой иммуногенностью.
Пример 9. Введение рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, несущих гены белковых антигенов F. tularensis Tul4, FopA и DnaK в качестве прайм-компонента и препарата, содержащего рекомбинантные белки DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6HisH адъювант в качестве бустерного компонента.
Для эксперимента были использованы две группы самок мышей линии Balb/c с SPF-статусом здоровья. Экспериментальной группе (10 животных) вводили прайм-компонент интраназально, по 50 мкл в каждую ноздрю, затем спустя две недели подкожно в качестве бустерной иммунизации вводили 50 мкл препарата, содержащего три типа рекомбинантных белков, а также адъювант.Бустерную иммунизацию повторяли спустя две недели.
Одна доза прайм-компонента (100 мкл) содержала: РПАН, несущие ген белка FopA F. tularensis - 1,4×108 БОЕ; РПАН, несущие ген белка Tul4 F. tularensis - 1,2×108 БОЕ; РПАН, несущие ген белка DnaK F. tularensis - 1,3×108 БОЕ.
Буст-компонент содержал по 10 мкг каждого рекомбинантного белка (Tul4, FopA и DnaK), в качестве адъюванта были использованы гидроксид алюминия - 1 мг и CpG олигонуклеотиды - 0,3 мг (по 0,15 мг CpG ODN 1585 и ODN 1826). Контрольной группе (10 животных) вводили физиологический раствор, затем, спустя две недели, раствор, содержащий адъюванты без рекомбинантных белков. На каждом этапе и спустя две недели после последней иммунизации у всех животных брали кровь для оценки гуморального иммунного ответа. Для оценки иммуногенности компонентов препарата было проведено определение титров антител, специфичных к каждому из рекомбинантных белков, в контрольной и опытной группах.
Как видно на фиг. 19а, 20а, 21а, в течение всего эксперимента в пулированных сыворотках контрольной группы, которой был введен адъювант без рекомбинантных белков, не происходит нарастания титра антител, специфичных к FopA, DnaK и Tul4 белкам, соответственно.
При иммунизации полной вакциной по 3-этапной схеме для белка FopA был получен титр, превышающий 1:100000 (см. фиг. 19), что заметно больше значений титров, полученных при введении прайм- и буст-компонентов по-отдельности (см. примеры 3 и 8, фиг. 8 и 15, соответственно).
В случае с DnaK также наблюдался высокий финальный титр, достигавший уровня 1:100000, как показано на фиг. 20.
Для белка Tul4, как и для антигенов FopA и DnaK, при иммунизации псевдоаденовирусными частицами с последующей двукратной буст-иммунизацией рекомбинантными антигенами в количестве 10 мкг (адъювант: CpG и А1) был получен высокий финальный титр, как показано на фиг. 21.
Claims (5)
1. Иммуногенная композиция, включающая (i) прайм-компонент, состоящий из рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц: частиц, несущих ген tul4 Francisella tularensis с последовательностью SEQ ID NO 1, частиц, несущих ген fopA Francisella tularensis с последовательностью SEQ ID NO 3, и частиц, несущих ген dnaK Francisella tularensis с последовательностью SEQ ID NO 5, при этом указанные гены оптимизированы для экспрессии в эукариотических клетках, и/или (ii) бустерный компонент, включающий рекомбинантные белки: белок DBD-Tul4 с последовательностью SEQ ID NO 16, молекулярной массой 30,0 кДа; белок 6-His-FopA с последовательностью SEQ ID NO 18, молекулярной массой 40,5 кДа; белок DnaK-6His с последовательностью SEQ ID NO 20, молекулярной массой 70,4 кДа, а также содержащая фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
2. Иммуногенная композиция по п. 1, где указанная композиция представляет собой вакцину, индуцирующую иммунный ответ против Francisella tularensis.
3. Иммуногенная композиция по пп. 1 и 2, где указанная композиция используется для индукции специфического клеточного и гуморального иммунитета против Franciella tularensis посредством введения прайм-компонента интраназально и введения бустерного компонента подкожно, дважды с интервалом в две недели.
4. Способ получения иммуногенной композиции по п. 1, включающий получение трех типов псевдоаденовирусных частиц, несущих гены белковых антигенов F. tularensis Tul4, FopA и DnaK соответственно, при этом бактериальный лидерный пептид удаляют и добавляют эукариотический лидерный пептид, каждый ген клонируют в свой плазмидный вектор pSh-PA-ILZ-Fc, куда также клонируют изолейциновый зиппер (ILZ) и Fc-фрагмент антитела IgG2a (Fc), полученные линеаризованные векторы pSh-FopA, pSh-Tul4 и pSh-DnaK смешивают с геномной ДНК рекомбинантного аденовируса Ad5 и котрансформируют в клетки Е. coli штамма BJ5183, полученные плазмиды трансформируют в штамм Е. coli DH5alpha, затем клетки линии 293 трансфецируют линеаризованными плазмидами, лизируют и из полученного лизата выделяют псевдоаденовирусные частицы; получают рекомбинантные белки DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His, для чего получают плазмиды, содержащие синтетические ДНК с последовательностями, соответствующими генам, кодирующим белки DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His, где нуклеотидный состав кодонов оптимизирован для гетерологичной экспрессии в непатогенном лабораторном штамме Е. coli, на основе указанных плазмид TUL4, pFOPA и pDNAK получают штаммы-продуценты Е. coli М15 [pREP4, pTul4], Е. coli M15 [pREP4, pFopA] и E. coli M15 [pREP4, pDnaK] с высокой продукцией рекомбинантных белков DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6HisB тельцах включения (ТВ), дальнейшая очистка всех индивидуальных рекомбинантных белков DBD-Tul4, 6-His-FopA и DnaK-6His производится путем растворения ТВ в денатурирующих условиях и проведения колоночной аффинной хроматографии в денатурирующих условиях на носителях, содержащих в качестве неподвижной фазы декстран (сефадекс) в случае DBD-Тil4 или содержащих иммобилизованный металл (металл-хелатная хроматография) в случае 6-His-FopA и DnaK-6His, с последующим удалением денатурирующих агентов из раствора белков, на основе полученных псевдовирусных частиц и белков готовят композицию, содержащую либо псевдовирусные частицы, либо белки, либо комбинацию псевдовирусных частиц и белков.
5. Способ по п. 4, где псевдовирусные частицы и белки подвергают лиофильной сушке.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018118941A RU2691302C1 (ru) | 2018-05-23 | 2018-05-23 | Иммуногенная композиция на основе рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, а также на основе белковых антигенов и способ получения иммуногенной композиции |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018118941A RU2691302C1 (ru) | 2018-05-23 | 2018-05-23 | Иммуногенная композиция на основе рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, а также на основе белковых антигенов и способ получения иммуногенной композиции |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2691302C1 true RU2691302C1 (ru) | 2019-06-11 |
Family
ID=66947424
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018118941A RU2691302C1 (ru) | 2018-05-23 | 2018-05-23 | Иммуногенная композиция на основе рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, а также на основе белковых антигенов и способ получения иммуногенной композиции |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2691302C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111394490A (zh) * | 2020-05-15 | 2020-07-10 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 用于土拉杆菌的CRISPR-Cas12a检测引物组及其应用 |
RU2745161C1 (ru) * | 2019-10-25 | 2021-03-22 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ) | Способ получения аттенуированного бесплазмидного штамма F.tularensis 15 CMSA, синтезирующего микобактериальный антиген супероксиддисмутазу А |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2270249C1 (ru) * | 2004-12-08 | 2006-02-20 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. Н.Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА TUL4spCBD, ШТАММ ESCHERICHIA COLI M15 [pREP4, pTUL4spCBD] - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА TUL4spCBD, РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК TUL4spCBD И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К БЕЛКУ TUL4spCBD |
US20140356415A1 (en) * | 2013-06-03 | 2014-12-04 | University Of Maryland, College Park | Compositions and vaccines comprising vesicles and methods of using the same |
-
2018
- 2018-05-23 RU RU2018118941A patent/RU2691302C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2270249C1 (ru) * | 2004-12-08 | 2006-02-20 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. Н.Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА TUL4spCBD, ШТАММ ESCHERICHIA COLI M15 [pREP4, pTUL4spCBD] - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА TUL4spCBD, РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК TUL4spCBD И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К БЕЛКУ TUL4spCBD |
US20140356415A1 (en) * | 2013-06-03 | 2014-12-04 | University Of Maryland, College Park | Compositions and vaccines comprising vesicles and methods of using the same |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2745161C1 (ru) * | 2019-10-25 | 2021-03-22 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ) | Способ получения аттенуированного бесплазмидного штамма F.tularensis 15 CMSA, синтезирующего микобактериальный антиген супероксиддисмутазу А |
CN111394490A (zh) * | 2020-05-15 | 2020-07-10 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 用于土拉杆菌的CRISPR-Cas12a检测引物组及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN113164586B (zh) | 免疫组合物及其制备方法与应用 | |
JP6048845B2 (ja) | ジフテリア毒素の無毒性突然変異体crm197又はその断片を含む融合タンパク質 | |
KR102482994B1 (ko) | 사스-코로나바이러스-2 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물 | |
KR20230049084A (ko) | Sars-cov-2 및 인플루엔자 조합 백신 | |
JP2015502353A (ja) | インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用 | |
ES2367128T3 (es) | Procedimiento para preparar una variante del antígeno protector de superficie de erysipelothrix rhusiopathiae en e. coli. | |
CN113666990A (zh) | 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用 | |
Sadraeian et al. | Induction of antitumor immunity against cervical cancer by protein HPV-16 E7 in fusion with ricin B chain in tumor-bearing mice | |
WO2022003119A1 (en) | Cross-reactive coronavirus vaccine | |
KR101600959B1 (ko) | 가금 레오바이러스 시그마 c 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 단백질 및 이에 대한 항체 | |
US10117923B2 (en) | Production of an immunogen using a plant virus | |
RU2691302C1 (ru) | Иммуногенная композиция на основе рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, а также на основе белковых антигенов и способ получения иммуногенной композиции | |
Katalani et al. | In silico design and in vitro analysis of a recombinant trivalent fusion protein candidate vaccine targeting virulence factor of Clostridium perfringens | |
WO2023023940A1 (zh) | 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用 | |
JP5730204B2 (ja) | インフルエンザm2由来の改変ペプチドワクチン | |
CN109251235A (zh) | 一种人***瘤病毒16型l1蛋白的突变体 | |
CN116568324A (zh) | 融合蛋白和疫苗 | |
CN105085671B (zh) | 抗肠道病毒3d蛋白的单克隆免疫球蛋白g抗体及其免疫原性组合物 | |
JP2022553258A (ja) | インフルエンザウイルスワクチン及びその使用 | |
WO2019059817A1 (en) | VACCINE BASED ON FUSION PROTEIN AND PLASMIDIC DNA | |
CN114085293B (zh) | 用于预防禽安卡拉病的重组蛋白及构建方法和应用 | |
CA2548483A1 (en) | Induction of antiviral neutralizing antibodies in humans and animals | |
EP3202780A1 (en) | Fusion protein comprising the n protein of a virus of the pneumovirinae subfamily | |
US20240092840A1 (en) | Vaccine formulation comprising recombinant overlapping peptides and native proteins | |
TW200844227A (en) | Recombinant viral proteins and particles |