CN110746509B - 一种抗人cd147 car-t细胞、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗人CD147 CAR‑T细胞、制备方法和应用，所述抗人CD147 CAR‑T细胞在T细胞内表达人源化抗CD147抗体ScFv‑CD8‑4‑1BB‑CD3ζ融合蛋白CD147 hScFv‑CD8‑4‑1BB‑CD3ζ。所述CD147 hScFv‑CD8‑4‑1BB‑CD3ζ中，所述CD147 hScFv可特异性识别结合人CD147蛋白。该细胞经过对T细胞修饰和改造获得，能够特异性识别和杀伤高表达CD147的肿瘤细胞，可应用于高表达CD147的疾病的预防和治疗。

Description

一种抗人CD147 CAR-T细胞、制备方法和应用
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体来说，本发明涉及一种抗人CD147 CAR-T细胞制备方法和应用。
背景技术
CD147是一种高表达于多种肿瘤细胞表面的跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族成员，在多种肿瘤的发病及临床进程中发挥重要作用，如肝癌、胶质母细胞瘤、肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、口腔鳞状细胞癌、黑色素瘤、膀胱癌以及肾癌等，是一个广谱的肿瘤标志物。CD147在肿瘤发生发展过程中促进肿瘤细胞的增殖、迁移、耐药以及血管生成，并且其表达水平与肿瘤复发和患者预后密切相关。研究数据发现，在临床原发性肝癌组织中CD147阳性率高达80％，在病变区CD147基因表达水平明显高于正常肝组织。其表达量的高低与肝癌的恶性程度，以及复发、转移及耐药性形成等恶性行呈正相关，可作为疗效评价和预后观察的重要标志性分子。在临床在胶质母细胞瘤患者中，CD147表达水平与胶质瘤的临床分级呈正相关；在IV胶质母细胞瘤患者中阳性率高达83.33％。同时，在复发或生存时间＜5年胶质母细胞瘤患者中，CD147表达水平也分别高于非复发或生存时间≥5年的患者。原发乳腺癌患者中，转移到骨髓中的90％以上的乳腺癌细胞的CD147表达呈阳性。在肺腺癌患者中，癌细胞表面CD147表达阳性的病人的存活时间比CD147表达阴性的患者显著缩短。在食道癌中，通过判定CD147的表达阳性和阴性，可以提高预测患者无病存活时间和肿瘤分期的准确率。上述结果均表明，CD147是一种肿瘤相关抗原，可以作为肿瘤生物治疗的理想靶点。
CAR-T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，简称CAR-T cell)是一种表达嵌合抗原受体的T细胞。嵌合抗原受体T细胞技术为临床治疗癌症提供了新的方向。该方法通过提取患者体内的T细胞，经体外改造培养，将携带有特异序列的载体整合进入到正常T细胞中，使其形成CAR-T。改造后的CAR-T细胞具有特异性识别和攻击杀伤肿瘤细胞的能力，回输至患者体内，杀伤具有相应特异性抗原的肿瘤细胞。其本质上是通过人体自身免疫***对病变组织进行攻击，在临床实验中显示出良好的靶向性、杀伤性和持久性，能精确地杀伤肿瘤细胞，而不会损伤正常细胞。CAR-T细胞的嵌合抗原受体(Chimeric antigenreceptor，CAR)主要由一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的ScFv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。其中肿瘤相关抗原结合区是一段单链抗体的可变区结构域(single chain Fv domain，scFv)，具有特异性识别并结合肿瘤相关性抗原的功能。scFv的构成是将单克隆抗体的重链可变区(the variable region of heavy chain，VH)和轻链可变区(the variable regionof light chain，VL)用多肽接头(Linker)进行连接，构成VH-Linker-VL或VL-Linker-VH结构。铰链区通常是由免疫球蛋白超家族组成，比如CD8、CD28和IgG。胞内信号传导区包括共刺激分子(costimulatory molecule，CM)和免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-based activation motifs，ITAM)，其中，CM通常为CD28或4-1BB，ITAM通常为CD3ζ或FcεRIγ。表达CAR的T细胞可通过scFv直接识别并结合肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原，并将信号传入T细胞内，激活T细胞，并分泌细胞因子，如穿孔素、颗粒酶、INF-γ、TNF-a等，从而发挥杀伤肿瘤细胞作用。CAR-T细胞将抗体-抗原特异性结合能力以及T细胞介导的杀伤功能结合于一体，是免疫抗肿瘤治疗的重要方法。
目前，CAR-T治疗在血液***肿瘤中取得了令人瞩目的进展。2017年8月，FDA批准诺华CD19 CAR-T(Kymriah，Tisagenlecleucel)正式上市，适应症是儿童、青少年急性B淋巴细胞白血病。2017年10月，FDA批准Kite Pharma CD19 CAR-T(YESCAR-TA，AxcabtageneCiloleucel)上市，适应症是成人大B细胞淋巴瘤。临床研究结果提示，83％的B细胞急性淋巴细胞白血病患者在接受该疗法后，3个月病情得到部分或完全缓解。接受治疗12个月后，疾病的无复发率为64％，存活率达到79％。
发明内容
目前CAR-T的研究主要集中在血液***肿瘤的研究方面，而针对不同靶点(HER2、CEA、VEGFVIII等)的CAR-T细胞疗法在临床前研究中已经证实具有良好的抗肿瘤效应，并且抗肝癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌以及***癌等实体肿瘤的临床试验也已逐渐开展。由于结合了细胞免疫与体液免疫的优势，CAR-T可能成为上述实体肿瘤治疗的一种有效手段。
但是，也应认识到实体瘤的复杂性远高于血液肿瘤，实体瘤异质性高，针对单一肿瘤靶点的CAR-T细胞不足以杀伤所有肿瘤细胞；并且肿瘤相关抗原往往不仅表达于肿瘤组织，在正常组织中亦有低水平的表达，部分抗原甚至还有维持组织正常生理功能的作用。CAR-T细胞在清除表达相应抗原的肿瘤细胞同时，也可能攻击表达相同抗原的正常组织。基于以上原因，本发明在针对肿瘤相关抗原CD147的抗体基因的基础上，构建anti-CD147CAR的慢病毒表达基因，并制备anti-CD147 CAR-T细胞，有助为抗肿瘤研究和治疗提供一种新的手段。
基于此，本发明其中一个目的是提供抗人CD147抗体ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白。
本发明的抗人CD147抗体ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白是由CD147 hScFv、CD8、4-1BB和CD3ζ组成，所述CD147 hScFv的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1所示序列或与SEQ IDNO:1所示序列具有90％以上同源性的序列；所述CD8的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2所示序列或与SEQ ID NO:2所示序列具有90％以上同源性的序列；所述4-1BB的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3所示序列或与SEQ ID NO:3所示序列具有90％以上同源性的序列；所述CD3ζ的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4所示序列或与SEQ ID NO:4所示序列具有90％以上同源性的序列。
本发明还提供CD8-pre-CD147 hScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因，所提供的融合蛋白基因是由CD8-pre、CD147 hScFv、CD8、4-1BB和CD3ζ组成，所述CD8-pre的核苷酸序列选自SEQ ID NO:5所示序列或与SEQ ID NO:5所示序列具有90％以上同源性的序列；所述CD147 hScFv的核苷酸序列选自SEQ ID NO:6所示序列或与SEQ ID NO:6所示序列具有90％以上同源性的序列；所述CD8的核苷酸序列选自具有如SEQ ID NO:7所示序列或与SEQ IDNO:7所示序列具有90％以上同源性的序列；所述4-1BB的核苷酸序列选自SEQ ID NO:8所示序列或与SEQ ID NO:8所示序列具有90％以上同源性的序列；所述CD3ζ的核苷酸序列选自SEQ ID NO:9所示序列或与SEQ ID NO:9所示序列具有90％以上同源性的序列。
本发明同时提供CD8 pre-anti CD147hScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体，所提供的嵌合抗原受体包括依次串联的CD8pre嵌合受体信号肽、anti CD147单链抗体重链VH、linker、anti CD147单链抗体轻链VL、CD8Hinge嵌合受体铰链和跨膜区、4-1BB嵌合受体的共刺激因子和CD3ζ嵌合受体T细胞激活域；
所述CD8pre嵌合受体信号肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.11所示序列或与SEQID NO:11所示序列具有90％以上同源性的序列；
所述anti CD147单链抗体重链VH的氨基酸序列选自SEQ ID NO.12所示序列或与SEQ ID NO:12所示序列具有90％以上同源性的序列；
所述linker的氨基酸序列选自SEQ ID NO.13所示序列或与SEQ ID NO:13所示序列具有90％以上同源性的序列；
所述anti CD147单链抗体轻链VL的氨基酸序列选自SEQ ID NO.14或与SEQ IDNO:14所示序列具有90％以上同源性的序列；
所述CD8 Hinge嵌合受体铰链和跨膜区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.2所示序列或与SEQ ID NO:2所示序列具有90％以上同源性的序列；
所述4-1BB嵌合受体的共刺激因子的氨基酸序列选自SEQ ID NO.3所示序列或与SEQ ID NO:3所示序列具有90％以上同源性的序列；
所述CD3ζ嵌合受体T细胞激活域的氨基酸序列选自SEQ ID NO.4所示序列或与SEQID NO:3所示序列具有90％以上同源性的序列。
本发明另一目的是提供抗人CD147 CAR-T细胞，该细胞感染有CD8pre-anti CD147ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体的T细胞。
本发明同时提供CD8 pre-anti CD147 ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体的重组表达载体，所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或质粒。
本发明进一步提供抗人CD147 CAR-T细胞(anti CD147 CAR-T细胞)的制备方法，所提供的制备方法包括：
(1)合成CD8 pre-anti CD147 ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体基因；
(2)构建慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体具有所述CD8 pre-anti CD147ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体；
(3)利用所述慢病毒表达载体感染293T细胞，获得慢病毒；该慢病毒被所述的CD8pre-anti CD147 ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白包装；慢病毒的纯化手段可使用本领域常规手段进行，如过滤、超滤等。
(4)用所述慢病毒感染T细胞，获得anti CD147 CAR-T细胞。
进一步，可利用所述的CAR-T细胞表达所述的CD147CD147hScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白。
本发明还提供上述融合蛋白、基因、嵌合抗原受体及细胞用于制备治疗高表达CD147分子疾病药物的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的CAR-T细胞是以人CD147胞外段为靶点的CAR-T细胞，所述的CAR-T细胞是在T细胞内表达CD147 hScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白。
本发明将CD147人源化抗体用于CAR-T细胞的构建，并提出以CD147分子为靶抗原，利用Anti CD147 CART细胞杀伤肿瘤细胞，用于CD147分子高表达肿瘤(如肝癌、胶质母细胞瘤)的治疗。
本发明的抗人CD147 CAR-T细胞制备方法通过修饰和改造T细胞得到，使改造后的T细胞能够特异性识别和杀伤CD147高表达的肿瘤细胞，适用于相应肿瘤疾病的治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本发明所述的慢病毒表达载体结构示意图；
图2是本发明所述的anti CD147CAR-T感染效率的流式结果图；左图示用对照CAR感染细胞的流结果图；右图为用anti-CD147 CAR感染细胞后的流式结果；
图3是本发明实施例的CAR-T细胞对靶细胞的体外杀伤实验结果图；左图为对人CD147高表达的肝癌细胞SMMC-7721的细胞毒作用；右图为对CD147阴性的小鼠原B细胞Baf-3的细胞毒作用；
图4是本发明实施例的CAR-T细胞的体内细胞因子检测结果图；四幅图分别为细胞因子IL-2(A.)细胞因子IL-10(B.)肿瘤坏死因子TNF-α(C.)和干扰素IFN-γ(D.)检测结果
图5是本发明实施例的CAR-T细胞趋化因子检测结果图，九附图分别为肿瘤组织表达的趋化因子CCL2(A)，CCL5(B)，CCL7(C),CCL19(D)，CCL21(E)，CXCL10(F)，CXCL3(G)和趋化因子受体CCR2(H),CCR7(I)表达情况。
具体实施方式
本发明的蛋白或基因具体合成和扩增方法可根据本申请公开的序列采用本领域常规技术手段获得，其中所述anti-CD147 ScFv序列来源于CN201910796766.8公开的人源化抗CD147抗体WBP247.hAb12基因。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是以下实施例中所述蛋白或基因的序列为本申请公开的序列。
实施例一：慢病毒表达载体制备
基因合成CD8 pre-anti CD147 ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因序列(上海生工)；在融合基因序列上下游分别合成限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切位点，基因序列如SEQ IDNO:15所示(图1)；通过BamHI和EcoRI(NEB)酶切所述基因序列，连接到GV401载体(上海吉凯基因)中；载体转化感受态细胞DH 5α，抗生素筛选，获得阳性克隆；摇菌并利用Plasmid抽提Kit(Promega)提取质粒，获得GV401-ScFv(anti CD147 CAR)慢病毒表达载体。
实施例二：慢病毒制备
(1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度约5x 106细胞/15ml，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养；24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；转染前2h更换为无血清培养基；
(2)向灭菌离心管中加入antiCD147 CAR载体质粒20μg、pHelper1.0载体质粒15μg和pHelper 2.0载体质粒10μg(上海吉凯基因)，与相应体积的转染试剂(吉凯)混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育15min；
(3)混合液缓慢滴加至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
(4)培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；
(5)缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO2培养箱内继续培养48-72h。
(6)收集转染后48h(转染即可为0h计起)的293T细胞上清液；于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；
(7)以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中，25000rpm，2h，4℃超速离心；
(8)离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；
(9)经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清分装；
实施例三：anti CD147 CAR-T细胞制备
1.PBMC分离
(1)将新鲜血液转移到50mL离心管中。用生理盐水按照1:1(体积比)进行稀释，轻轻上下吹打3-5次混匀。
(2)将6mL Ficoll加入到15mL离心管中，竖直放置到水平台面上静止备用。将稀释好的血液(总体积8mL)用移液管缓慢均匀加入到竖直放置在台面的含Ficoll溶液的离心管中。
(3)将加好血液与Ficoll的离心管轻轻转移至离心机中。在转移离心管过程尽量减少晃动，保持离心管竖直，以避免打破页面分层。室温400g离心30分钟。
(4)离心结束后，轻轻转移离心管至超净台中。用移液器吸取中间的白膜层(即淋巴细胞层)转移至新的50mL离心管中。
(5)加入30mL生理盐水至上述转移出来的淋巴细胞中，轻轻吹打混匀，60-100g室温离心10分钟；重复洗涤淋巴细胞，去除上清，加入一定量的完全培养基重悬细胞。
(6)计数调整密度为1x 105细胞/ml，预先处理过的6孔板中每孔加入1ml。将培养板放置于37℃，5％CO2培养箱培养48小时。
2、慢病毒感染
(1)收集上述PBMC，室温300g离心4min，调整密度为1x106细胞/ml，新的6孔板中每孔加入1ml细胞，实验组加入6μlanti-CD147CAR的慢病毒(病毒滴度为5x 108/mL，MOI＝3)；对照组加入6μl对照病毒(病毒滴度为2x 108/mL，MOI＝3)，每孔加入一定的TRANS B感染试剂。
(3)将细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱培养；每隔2-3天进行半量换液。
3、CAR-T细胞表型检测
收集细胞，每种细胞取出5.0×105个，加入1ml PBS，2000rpm，离心3min，弃上清；c.每个样品中加入50μl 1：1000PBS稀释的Bio-Protein L(终浓度1ug/ml)，混匀，4℃孵育30min；每个样本中加入1ml PBS，2000rpm，离心3min，弃上清；每个样品中加入50μl 1：200PBS稀释的Streptavidin,(APC)(Invitrogen)，混匀，4℃避光孵育30min；每个样品中加入1ml PBS，2000rpm，离心3min，弃上清；加入100-150μl PBS重悬，用BD Accure C6software检测荧光并对数据进行处理分析。
结果如图2所示：anti CD147CAR-T感染效率约为29.3％。
实施例四：anti CD147 CAR-T细胞体外杀伤功能检测
用乳酸脱氢酶(LDH)法(Promega)评估anti CD147 CAR-T细胞对过表达CD147的肿瘤细胞SMCC-7721和不表达CD147的肿瘤细胞Baf-3细胞的杀伤功能。
(1)用含2％小牛血清的RPMI-1640培养液将靶细胞调整到2×104/ml。收集CAR-T(效应细胞)，用稀释缓冲液将细胞洗涤一次，1000rpm 3min离心，弃上清，以含2％FBS的1640重悬细胞、计数，将细胞密度分别调整为4×105个/ml、2×105个/ml、1×105个/ml、0.4×105个/ml、0.2×105个/ml；
(2)将上述细胞分别加入U型底96孔板中(100μl体系)，分组如下表，效应细胞与靶细胞的比例(E：T)分别为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1；每个实验组设置三个复孔。
表1体外杀伤功能检测实验分组
Figure BDA0002228314380000121
(3)细胞放入含5％CO2的37℃培养箱中进行培养4-6小时；
(4)最大释放孔中(阳性对照)加10μl Lysis Solution(10×)，孵育45min；
(5)培养终点时，1500rpm 5min离心培养板，每孔取50μl上清液转移到新的96孔板中，每孔加入50μlassay buffer和substrate mix检测底物，室温避光孵育30min，加入50μl终止液，490nm检测吸收值；
(8)计算杀伤率＝实验组LDH(OD)/Max LDH释放组(OD)。
(9)计算公式：
杀伤效率＝(experimental-effector spontaneous-target spontaneous)/(target maximum-target spontaneous)×100％。
实验结果显示，制备的Anti CD147 CAR-T细胞能够显著杀伤高表达CD147的靶细胞株SMMC-7721，不同比例的Anti CD147 CAR-T与SMMC-7721细胞共孵育4小时后，随着效靶比的增加，细胞杀伤效率也逐渐增加。对不表达CD147的Baf-3细胞而言，Anti CD147 CAR-T未表现出明确的细胞杀伤效应，与对照CAR-T(Control CAR-T)细胞相比，无明显差异(见图3)。
实施例五：细胞因子分泌检测
用Human TH1/TH2 cytokine CBA kit(BD，Cat#550749)评估anti CD147 CAR-T细胞与肿瘤细胞U87-MG和Baf3细胞共培养时，细胞因子的释放作用。
将1×105的靶细胞(U87-MG)和1×105CAR-T细胞分别混合加入96孔板中，37℃、5％CO2共同培养72小时；1000rpm 5min离心，收集上清，用Human TH1/TH2 cytokine CBA kit(BD，Cat#550749)检测细胞因子分泌情况。
结果如图4所示，anti-CD147 CAR-T细胞与靶细胞U87-MG共培养时，IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ的分泌显著高于对照组，结果提示anti CD147 CAR-T具有明显的促进细胞因子分泌的功能活性。
实施例六：趋化因子检测
anti CD147 CAR-T与肿瘤细胞U87-MG共培养24h后，收集anti CD147 CAR-T细胞检测趋化因子表达水平。
将1×105的靶细胞U87-MG和1×105CART细胞分别混合加入96孔板中，37℃、5％CO2共同培养20～24小时；取培养基，2000rpm，离心5min，弃上清，收集anti CD147 CAR-T细胞。
细胞沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置5min，然后转移至新的1.5mLEP管中；每管加入200μL氯仿，用手上下颠倒EP管15s，室温静置10min。4℃、12800rpm，离心15min。吸取上层液体移至新的1.5mL EP管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃静置10min。4℃、12800rpm离心12min后，弃上清。加入1mL、75％乙醇(用DEPC水新鲜配制)，洗涤沉淀。4℃、11800rpm离心5min，弃去大部分上清。4℃、11800rpm再次离心5min，弃去上清，室温干燥。待RNA沉淀基本透明时，加入RNase-free水溶解Total RNA。用M-MLV试剂盒(Promega)反转录为cDNA。
取上述步骤所获得的cDNA，用如下表所列的引物(广州锐博)，利用SYBR Green(TAKARA)实时PCR分别检测趋化因子和趋化因子受体在anti CD147 CAR-T细胞中的表达水平。实验以GAPDH为内参对照，设3复孔，重复3次。
表2趋化因子检测所用引物序列
目的基因 上游引物序列 下游引物序列
CXCL10 GTGGCATTCAAGGAGTACCTC TGATGGCCTTCGATTCTGGATT
CCR2 TAAAAGCCAGGACGGTCAC CAGGATTCCCGAGTAGCAG
CCR7 TTCATCGGCGTCAAGTTCC AAGGTGGTGGTGGTCTCG
CXCR3 GCCGAGAAAGCAGGGTAGACG GGCATAGAGCAGCGGGTTGAG
CCL2 CAGCCAGATGCAATCAATGCC TGGAATCCTGAACCCACTTCT
CCL5 CCGAAAGAACCGCCAAGTG ACAAGAGCAAGCAGAAACAGG
CCL7 ACAGAAGGACCACCAGTAG CTTGTCCAGGTGCTTCATA
CCL19 GTGGCACCAATGATGCTGAA GCCATCCTTGATGAGAAGGTAGT
CCL21 CCTCCTTATCCTGGTTCTGG ATCTTCCTTTGGCTGTACTTG
GAPDH TGACTTCAACAGCGACACCCA CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA
结果：如图5所示，与对照样本PBMC细胞相比，构建的anti CD147CAR-T细胞中，CCL2，CCL5，CCL19，CCL21，CCR7，CXCR10基因的表达水平显著升高，分别为对照组的5.18倍，1.59倍，6.15倍，17.96倍，4.38倍和5.47倍，以上结果表明并提示制备的anti CD147 CAR-T细胞可有效促进肿瘤组织趋化因子和趋化因子受体的表达，促进anti CD147 CAR-T细胞进一步聚集在肿瘤组织周围。
核苷酸序列表电子文件
<110>中国人民解放军第四军医大学
<120>抗CD147人源化抗体及其应用
<210>1
<211>239
<212>PRT
<213>
<220>CD147 hScFv氨基酸序列
<400>1
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSKANNHAPYYTESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDSTATHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSSGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVINDVAWYQQKPGQAPRLLIYYASNRNTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQDYSPPFTFGQGTKLEIK
<210>2
<211>69
<212>PRT
<213>
<220>CD8氨基酸序列
<400>2
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
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<212>PRT
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<220>4-1BB氨基酸序列
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KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
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<212>PRT
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<220>CD3ζ氨基酸序列
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<210>5
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<212>PRT
<213>
<220>CD8-pre核苷酸序列
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ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG
<210>6
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<212>DNA
<213>
<220>CD147 hScFv核苷酸序列
<400>6
CAAGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGCGGCTGTCTTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGCAAGGGACTTGAGTGGGTTGCCGAAATTAGAAGCAAAGCTAATAATCATGCACCATACTATACTGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCACGAGATGACTCCAAAAACACCCTCTACCTGCAAATGAACAGCTTAAAGACCGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCCAGGGATAGCACGGCTACCCACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGCGGTGGCTCTAGCGGTGGTGGATCGGACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGAGCGCCTCAGTCGGAGACAGGGTTACCATAACCTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGATTAATGATGTAGCTTGGTACCAACAGAAGCCAGGGCAGGCCCCTAGGCTGCTGATATACTATGCATCCAATCGCAACACTGGAGTTCCTGATCGCTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACGGATTTCACTCTCAAAATCAGCCGGGTGGAGGCTGAAGACGTGGGGGTTTATTACTGTCAGCAGGATTATAGTCCTCCATTCACGTTCGGCCAGGGGACAAAGCTGGAAATCAAA
<210>7
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<213>DNA
<213>
<220>CD8铰链及跨膜区核苷酸序列
<400>7
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
<210>8
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<213>
<220>4-1BB核苷酸序列
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<213>
<220>CD3ζ核苷酸序列
<400>9
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
<210>10
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<216>PRT
<213>
<220>CD8 pre-anti CD147 ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体氨基酸序列
<400>10
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSKANNHAPYYTESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDSTATHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSSGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVINDVAWYQQKPGQAPRLLIYYASNRNTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQDYSPPFTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
<210>11
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<217>PRT
<213>
<220>CD8 pre氨基酸序列
<400>11
MALPVTALLLPLALLLHAARP
<210>12
<211>117
<212>PRT
<213>
<220>CD147 hScFvVH氨基酸序列
<400>12
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSKANNHAPYYTESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDSTATHWGQGTLVTVSS
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<220>LINKER 氨基酸序列
<400>13
GGGGSGGGGSSGGGS
<210>14
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<212>PRT
<213>
<220> CD147 hScFvVL氨基酸序列
<400>14
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVINDVAWYQQKPGQAPRLLIYYASNRNTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQDYSPPFTFGQGTKLEIK
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<212>DNA
<213>
<220> CD8 pre-anti CD147 ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体核苷酸序列
<400>15
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGCAAGTGCAGCTTGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGCGGCTGTCTTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGCAAGGGACTTGAGTGGGTTGCCGAAATTAGAAGCAAAGCTAATAATCATGCACCATACTATACTGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCACGAGATGACTCCAAAAACACCCTCTACCTGCAAATGAACAGCTTAAAGACCGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCCAGGGATAGCACGGCTACCCACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGCGGTGGCTCTAGCGGTGGTGGATCGGACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGAGCGCCTCAGTCGGAGACAGGGTTACCATAACCTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGATTAATGATGTAGCTTGGTACCAACAGAAGCCAGGGCAGGCCCCTAGGCTGCTGATATACTATGCATCCAATCGCAACACTGGAGTTCCTGATCGCTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACGGATTTCACTCTCAAAATCAGCCGGGTGGAGGCTGAAGACGTGGGGGTTTATTACTGTCAGCAGGATTATAGTCCTCCATTCACGTTCGGCCAGGGGACAAAGCTGGAAATCAAAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA

Claims (10)

1.抗人CD147抗体ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，该融合蛋白由CD147 hScFv、CD8、4-1BB和CD3ζ组成，所述CD147 hScFv的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1所示序列；所述CD8的氨基酸序列选自SEQ IDNO:2所示序列；所述4-1BB的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3所示序列；所述CD3ζ的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4所示序列。
2.权利要求1所述的融合蛋白用于制备治疗高表达CD147分子疾病药物的应用。
3.CD8-pre-CD147 hScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因，该融合蛋白基因由CD8-pre、CD147 hScFv、CD8、4-1BB和CD3ζ组成，所述CD8-pre的核苷酸序列选自SEQ ID NO:5所示序列；所述CD147 hScFv的核苷酸序列选自SEQ ID NO:6所示序列；所述CD8的核苷酸序列选自SEQ ID NO:7所示序列；所述4-1BB的核苷酸序列选自SEQ ID NO:8所示序列；所述CD3ζ的核苷酸序列选自SEQ ID NO:9所示序列。
4.权利要求3所述的融合蛋白基因用于制备治疗高表达CD147分子疾病药物的应用。
5.CD8 pre-anti CD147hScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体，
该嵌合抗原受体包括依次串联的CD8pre嵌合受体信号肽、antiCD147单链抗体重链VH、linker、anti CD147单链抗体轻链VL、CD8 Hinge嵌合受体铰链和跨膜区、4-1BB嵌合受体的共刺激因子和CD3ζ嵌合受体T细胞激活域；
所述CD8pre嵌合受体信号肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.11所示序列；
所述anti CD147单链抗体重链VH的氨基酸序列选自SEQ ID NO.12所示序列；
所述linker的氨基酸序列选自SEQ ID NO.13所示序列；
所述anti CD147单链抗体轻链VL的氨基酸序列选自SEQ ID NO.14；
所述CD8 Hinge嵌合受体铰链和跨膜区的氨基酸序列选自SEQ IDNO.2所示序列；
所述4-1BB嵌合受体的共刺激因子的氨基酸序列选自SEQ ID NO.3所示序列；
所述CD3ζ嵌合受体T细胞激活域的氨基酸序列选自SEQ ID NO.4所示序。
6.权利要求5所述的嵌合抗原受体用于制备治疗高表达CD147分子疾病药物的应用。
7.抗人CD147 CAR-T细胞，该细胞为感染有权利要求5所述CD8pre-anti CD147 ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体的T细胞。
8.权利要求5所述CD8 pre-anti CD147 ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体的重组表达载体，所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或质粒。
9.抗人CD147 CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，方法包括：
(1)合成权利要求5所述CD8 pre-anti CD147ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体基因；
(2)构建慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体具有所述CD8 pre-anti CD147 ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体；
(3)利用所述慢病毒表达载体感染293T细胞，获得慢病毒；
(4)用所述慢病毒感染T细胞，获得anti CD147 CAR-T细胞。
10.权利要求7所述的抗人CD147 CAR-T细胞或权利要求9所述方法制备的抗人CD147CAR-T细胞用于制备治疗高表达CD147分子疾病药物的应用。
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