CN114075279B - 非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用。具体地，本发明提供了非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体的VHH链框架区FR和互补决定区CDR的氨基酸序列。本发明还提供了编码上述纳米抗体的核苷酸序列。本发明提供的抗血清白蛋白纳米抗体在不同pH条件下均能结合人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白；且能够显著延长蛋白药物半衰期，为长效蛋白药物开发提供了研发基础。

Description

非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，更具体地涉及一种非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用。
背景技术
作为药代动力学的一个重要参数，抗体的半衰期综合体现了抗体在体内吸收、分布的过程。提高半衰期可以有效提高抗体的药效，减少给药剂量与频率，降低可能的副作用，降低病人的治疗负担。所以如何改变抗体药物半衰期一直以来都是抗体工程领域的一个重要研究方向。影响抗体药物半衰期的各种因素，包括：分子量、FcRn结合、等电点、糖基化、靶点介导的清除、抗药物抗体等。目前抗体药物延长半衰期的实现策略包括糖基化改造、聚乙二醇化、白蛋白融合、转铁蛋白融合、Fc融合、惰性蛋白融合、负电蛋白融合等。
人血清白蛋白是人体血浆中含量最丰富的可溶性蛋白，也是许多内源因子和外源药物的载体。人血清白蛋白由585个氨基酸构成，相对分子质量约为66.5kDa。由于正常情况下不易透过肾小球，人血清白蛋白在血浆中的半衰期较长(可达14～20天，平均约为19天)，没有酶学和免疫学活性，安全无毒，生物相容性好，而且体内分布极广，是理想的药物载体。各种基于人血清白蛋白的药物长效化技术得到了广泛的应用和发展，目前主要包括构建人血清白蛋白融合蛋白、通过共价化学键与人血清白蛋白偶联、通过非共价键与人血清白蛋白可逆性结合等。
纳米抗体(nanobody，Nb)，即重链单域抗体VHH(variable domain of heavychainof heavy-chain antibody)—骆驼体内存在着天然缺失轻链的重链抗体(heavy-chainantibody，HCAb)。克隆其可变区而得到的只由一个重链可变区组成的单域抗体，是目前可以得到的具有完整功能的稳定的可结合抗原的最小单位。纳米抗体具有稳定性高、水溶性好、人源化简单、靶向性高、穿透性强等特点，在免疫实验、诊断与治疗中，发挥着超乎想象的巨大功能。Ablynx公司作为全球纳米抗体领域的领军企业，是最早将纳米抗体用于治疗型抗体开发的企业，其已经拥有超过45种专有和合作的纳米抗体，其中有多款产品是用以抗人血清白蛋白为长效因子而构建的融合蛋白，例如靶点为IL-6R、TNF-α、RANKL或IL-17A/IL17F的产品等。
尽管现有技术中已有多篇专利文献报道了针对人血清白蛋白的纳米抗体，但现有的纳米抗体在应用上还有一些不足，本领域还需要开发新的具有更好功能的纳米抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用。
具体地，本发明提供了4株特异性结合血清白蛋白的纳米抗体，同时提供纳米抗体的编码序列、制备方法以及应用。
在本发明的第一方面，提供了一种抗血清白蛋白纳米抗体，所述纳米抗体能够特异性结合血清白蛋白，且所述纳米抗体的VHH链的互补决定区CDR为选自下组的一种或多种：
(1)SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2、和SEQ ID NO:3所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:11所示的CDR2、和SEQ ID NO:12所示的CDR3；
(3)SEQ ID NO:19所示的CDR1、SEQ ID NO:20所示的CDR2、和SEQ ID NO:21所示的CDR3；和
(4)SEQ ID NO:28所示的CDR1、SEQ ID NO:29所示的CDR2、和SEQ ID NO:30所示的CDR3。
在另一优选例中，所述的抗血清白蛋白纳米抗体为非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体。
在另一优选例中，所述抗血清白蛋白纳米抗体包含一个特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域。
在另一优选例中，所述抗血清白蛋白纳米抗体包含两个或更多个特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域。
在另一优选例中，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含选自下组的CDR1、CDR2和CDR3:
(1)SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2、和SEQ ID NO:3所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:11所示的CDR2、和SEQ ID NO:12所示的CDR3；
(3)SEQ ID NO:19所示的CDR1、SEQ ID NO:20所示的CDR2、和SEQ ID NO:21所示的CDR3；和
(4)SEQ ID NO:28所示的CDR1、SEQ ID NO:29所示的CDR2、和SEQ ID NO:30所示的CDR3。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能保留与血清白蛋白非pH依赖性特异性结合能力的衍生序列。
在另一优选例中，所述的CDR1、CDR2和CDR3由VHH链的框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
在另一优选例中，所述血清白蛋白为人或非人哺乳动物的血清白蛋白。
在另一优选例中，所述血清白蛋白为人、小鼠、大鼠或食蟹猴血清白蛋白。
在另一优选例中，所述抗血清白蛋白纳米抗体具有非pH依赖性。
在另一优选例中，所述抗血清白蛋白纳米抗体在不同pH条件下均能结合血清白蛋白。
在另一优选例中，所述抗血清白蛋白纳米抗体在pH3.0-10.0，较佳地pH4.0-9.0，更佳地pH5.0-8.0的条件下能结合血清白蛋白。
在另一优选例中，所述单克隆抗体在约pH≥7.4(优选地≥7.8，更优选地≥8.0；并且pH≤8.5)的条件下与血清白蛋白的结合活性为A1；所述单克隆抗体在约pH≤5.0(优选地≤4.8，更优选地≤4.5；并且pH≥4.0)的条件下与血清白蛋白的结合活性为A2；则0.5≤A1/A2≤2，优选地0.7≤A1/A2≤1.5，更优选地0.8≤A1/A2≤1.2。
在另一优选例中，所述纳米抗体的框架区包含选自下组的FRl、FR2、FR3和FR4:
(1)SEQ ID NO:4所示的FR1、SEQ ID NO:5所示的FR2、SEQ ID NO:6所示的FR3、和SEQ ID NO:7所示的FR4；
(2)SEQ ID NO:13所示的FR1、SEQ ID NO:14所示的FR2、SEQ ID NO:15所示的FR3、和SEQ ID NO:16所示的FR4；
(3)SEQ ID NO:22所示的FR1、SEQ ID NO:23所示的FR2、SEQ ID NO:24所示的FR3、和SEQ ID NO:25所示的FR4；
(4)SEQ ID NO:31所示的FR1、SEQ ID NO:32所示的FR2、SEQ ID NO:33所示的FR3、和SEQ ID NO:34所示的FR4；
(5)SEQ ID NO:37所示的FR1、SEQ ID NO:38所示的FR2、SEQ ID NO:39所示的FR3、和SEQ ID NO:40所示的FR4；
(6)SEQ ID NO:43所示的FR1、SEQ ID NO:44所示的FR2、SEQ ID NO:45所示的FR3、和SEQ ID NO:46所示的FR4；
(7)SEQ ID NO:49所示的FR1、SEQ ID NO:50所示的FR2、SEQ ID NO:51所示的FR3、和SEQ ID NO:52所示的FR4；和
(8)SEQ ID NO:55所示的FR1、SEQ ID NO:56所示的FR2、SEQ ID NO:57所示的FR3、和SEQ ID NO:58所示的FR4。
在另一优选例中，所述抗体中的VHH链的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:8、SEQID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:53、SEQID NO:59、或其组合。
在另一优选例中，所述抗体中的VHH链的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:41、SEQID NO:47、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:59、或其组合。
在另一优选例中，所述的纳米抗体包括人源化抗体、骆驼源抗体、嵌合抗体。
在另一优选例中，本发明的血清白蛋白特异性纳米抗体还涵盖能够与由SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:53或SEQ ID NO:59中任一的氨基酸序列组成的VHH结合人血清白蛋白的抗血清白蛋白抗体分子。
在本发明的第二方面，提供了一种抗血清白蛋白抗体，所述的抗体包括一个或多个本发明第一方面所述的纳米抗体的VHH链。
在另一优选例中，所述的抗血清白蛋白抗体可以为单体、二价抗体、和/或多价抗体。
在本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体或本发明第二方面所述的抗血清白蛋白抗体。
在另一优选例中，所述多核苷酸为组合形式。
在另一优选例中，所述多核苷酸的序列选自下组：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:60、或其组合。
在另一优选例中，本发明涉及编码本发明的抗血清白蛋白纳米抗体的核酸分子。本发明的核酸可为RNA、DNA或cDNA。
在本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体表达本发明第三方面的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移***、或其组合。
在另一优选例中,所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、AAV病毒载体、逆转录病毒载体、或其组合。
在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
在本发明的第六方面，提供了一种产生抗血清白蛋白纳米抗体的方法，包括步骤：
(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗血清白蛋白纳米抗体的培养物；以及
(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗血清白蛋白纳米抗体；及任选的
(c)纯化和/或修饰步骤(b)所获得的抗血清白蛋白纳米抗体。
在另一优选例中，所述的抗血清白蛋白纳米抗体具有如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:53或SEQ IDNO:59所示的氨基酸序列。
在本发明的第七方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：
(a)如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体，或如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
在另一优选例中,所述的组分(a)和(b)可操作性连接。
在另一优选例中，所述的偶联部分为化学标记和生物标记。
在另一优选例中，所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物。
在另一优选例中，所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。
在另一优选例中，所述的放射性核素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188，或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169、Yb-177，或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联部分选自下组：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂，或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))或任何形式的纳米颗粒。
在本发明的第八方面，提供了一种结合物，所述结合物含有：
(a)如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体，或如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体；和可操作性连接的
(b)选自下组的修饰标记：化学标记和生物标记。
在另一优选例中，所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物。
在另一优选例中，所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。
在本发明的第九方面，提供了一种多特异性抗体，所述的多特异性抗体包含：如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体，或如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体。
在另一优选例中，多特异性抗体还包括靶向选自下组的靶点的第二抗原结合区：IL-4R、IL-4Rα、TNF-α、VEGF、PD-1、PD-L1、4-1BB、CD47、TIM3、CTLA4、IL-17A、CD19、CD22、CD38、IL-5、TSLP、BCMA、GLP-1、Trop2、TIGIT、或其组合。
在另一优选例中，所述的第二抗原结合区为纳米抗体。
在另一优选例中，所述多特异性抗体包括一个或多个第二抗原结合区。
在另一优选例中，所述多特异性抗体还包含抗体的Fc段。
在另一优选例中，所述多特异性抗体为靶向血清白蛋白和IL4R的双特异性抗体。
在另一优选例中，所述多特异性抗体包含一个抗血清白蛋白纳米抗体和两个抗IL4R纳米抗体。
在另一优选例中，所述多特异性抗体为三价抗体。
在另一优选例中，所述双特异性抗体具有式I所示的结构：
I-I-B 式I
其中，
“-”为肽键；
I为抗IL4R纳米抗体；
B为如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体。
在本发明的第十方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包含：
(i)如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体，或如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体；
(ii)任选的具有治疗功能的多肽分子或片段。
在另一优选例中，所述具有治疗功能的多肽分子或片段包括但不限于：靶向IL-4R、IL-4Rα、TNF-α、VEGF、PD-1、PD-L1、4-1BB、CD47、TIM3、CTLA4、IL-17A、CD19、CD22、CD38、IL-5、TSLP、BCMA、GLP-1、Trop2或TIGIT的多肽分子或片段。
在另一优选例中，所述具有治疗功能的多肽分子或片段包括但不限于：胰岛素、IL-2、干扰素、降钙素、GHRH肽、肠肽类似物、白蛋白、抗体片段、细胞因子。
在另一优选例中，所述具有治疗功能的多肽分子或片段包括单链抗体(scFv)、双链抗体、单克隆抗体、或嵌合抗体。
在另一优选例中，所述融合蛋白还包含协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列选自下组：6His标签、GGGS序列、FLAG标签。
在另一优选例中，所述的融合蛋白包括双特异性抗体、嵌合抗体。
在本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含：
(i)如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体、如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体、如本发明第七方面所述的免疫偶联物、如本发明第八方面所述的结合物、如本发明第九方面的多特异性抗体或如本发明第十方面所述的融合蛋白；
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物还包含其他生物活性物质，如***的药物。
在本发明的第十二方面，提供了一种活性成分的用途，所述的活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体、如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体、如本发明第七方面所述的免疫偶联物、如本发明第八方面所述的结合物、如本发明第九方面的多特异性抗体、如本发明第十方面所述的融合蛋白、或其组合，用于制备长效蛋白药物。
在本发明的第十三方面，提供了如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体、如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物的用途：(a)用于制备检测血清白蛋白的试剂、检测板或试剂盒；(b)用于制备结合血清白蛋白的药剂(长效蛋白药物)。
在另一优选例中，所示试剂为诊断试剂。
在另一优选例中，所述试剂用于检测样品中的血清白蛋白或其片段。
在另一优选例中，所述的药剂包括如本发明第七方面所述的免疫偶联物、如本发明第八方面所述的结合物、如本发明第九方面的多特异性抗体或如本发明第十方面所述的融合蛋白。
在本发明的第十四方面，提供了一种用于纯化血清白蛋白的免疫吸附材料，其中，所述免疫吸附材料包含如第一方面或第二方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体、如本发明第一方面或第二方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体的VHH链。
在另一优选例中，所述的免疫吸附材料还包括载体。
在另一优选例中，所述载体包括但不限于：磁珠、琼脂糖凝胶、硅胶微球、多孔材料。
在本发明的第十五方面，提供了一种体外检测样品中血清白蛋白或其片段的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体、如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在血清白蛋白或其片段。
在另一优选例中，所述的检测包括诊断性的或非诊断性的。
本发明的第十六方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养本发明第五面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽包括如本发明第一方面所述的抗血清白蛋白纳米抗体、如本发明第二发明所述的抗血清白蛋白抗体、如本发明第九方面的多特异性抗体、如本发明第十方面所述的融合蛋白。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1A显示了白蛋白纳米抗体Nb1-15在不同pH条件下与人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白的结合活性。
图1B显示了白蛋白纳米抗体Nb1-60在不同pH条件下与人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白的结合活性。
图1C显示了白蛋白纳米抗体Nb1-83在不同pH条件下与人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白的结合活性。
图1D显示了白蛋白纳米抗体Nb3-24在不同pH条件下与人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白的结合活性。
图2A显示了IL4R纳米抗体融合人源化白蛋白纳米抗体HuNb1-15后，在不同pH条件下与人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白的结合活性。
图2B显示了IL4R纳米抗体融合人源化白蛋白纳米抗体HuNb1-60后，在不同pH条件下与人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白的结合活性。
图2C显示了IL4R纳米抗体融合人源化白蛋白纳米抗体HuNb1-83后，在不同pH条件下与人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白的结合活性。
图2D显示了IL4R纳米抗体融合人源化白蛋白纳米抗体HuNb3-24后，在不同pH条件下与人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白的结合活性。
图3显示了IL4R-HSA三价抗体在小鼠体内的半衰期检测结果。
图4显示了IL4R-HSA三价抗体在大鼠体内的半衰期检测结果。
图5显示了IL4R-HSA三价抗体在食蟹猴体内的半衰期检测结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，成功获得一组抗血清白蛋白纳米抗体，实验结果表明，本发明获得的4株抗血清白蛋白纳米抗体能够有效地与血清白蛋白结合。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明利用人源的血清白蛋白胞外段抗原蛋白免疫骆驼，获得高质量的免疫纳米抗体基因文库。然后将血清白蛋白分子偶联在酶标板上，展示血清白蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了血清白蛋白特异性的纳米抗体基因。
如本文所用，术语“本发明纳米抗体”、“本发明的抗血清白蛋白纳米抗体”、“本发明抗血清白蛋白纳米抗体”、可互换使用，均指特异性识别和结合于血清白蛋白(包括人血清白蛋白)的纳米抗体。特别优选的是VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:59所示的纳米抗体。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“单域抗体(single domain antibody，sdAb，或VHH)”、“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)。
纳米抗体/单域抗体(Nanobody)作为一种新型的小分子抗体片段，由驼类天然的重链抗体重链可变区(VHH)克隆获得。Nanobody(Nb)具有优良的生物学特性，分子量12-15kDa，是完整抗体的十分之一，具有很好的组织穿透性，特异性高，水溶性好。因其特殊的结构性质，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎完美克服了传统抗体的开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷，逐渐成为新一代抗体治疗中的新兴力量，在免疫诊断和治疗中显示出广阔的应用前景。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗血清白蛋白抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合血清白蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有血清白蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；9.疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的其他生物活性物质。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
检测方法
本发明还涉及检测血清白蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中血清白蛋白蛋白的水平。
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明还提供了用于检测血清白蛋白水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别血清白蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
应用
如上所述，本发明的纳米抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到抗血清白蛋白纳米抗体用于制备长效蛋白药物，为长效性蛋白药物开发提供了研发基础。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明纳米抗体在不同pH条件下均能结合人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白。
(b)本发明纳米抗体能够显著延长蛋白药物半衰期，为长效蛋白药物开发提供了研发基础。
(c)本发明纳米抗体适合于原核表达和真核表达，具有可溶性极高，不易聚集，能耐高温、强酸、强碱等致变性条件的优点，适用于实验室及工业开发。
(d)利用本发明的纳米抗体制备蛋白药物，不会影响药物的靶向性和活性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：抗血清白蛋白纳米抗体的筛选及表达
将人血清白蛋白蛋白免疫1只新疆双峰驼，7次免疫结束后从骆驼外周血中分离total RNA，经反转录和PCR扩增出VHH基因，再将VHH基因克隆至噬菌体载体pMECS上，转化至TG1宿主细胞中构建成噬菌体展示文库。随后利用噬菌体展示技术进行文库筛选，经4轮“吸附-洗涤-富集”的筛选过程最终获得含抗体基因的噬菌体富集30倍。从以上富集的噬菌体克隆中随机挑选400颗进行PE-ELISA鉴定，将获得的阳性克隆全部进行测序鉴定，将所有序列不同的抗体均作为候选对象，利用大肠杆菌表达纯化出各种抗体用于后续鉴定。
实施例2：抗血清白蛋白纳米抗体在不同PH条件下与白蛋白的结合
将小鼠、大鼠、食蟹猴血清及人血清白蛋白用pH8.2 NaHCO3稀释至10ug/mL包被至酶标版，4℃过夜放置；PBST洗涤酶标板，每孔加入300uL的1％脱脂牛奶室温封闭2小时；PBST洗涤酶标板，加入100uL梯度稀释好的待测抗体(每个抗体分别用pH5.0和pH7.4 PBS溶液稀释，从300ug/mL起始3倍梯度稀释)，37℃孵育1小时；PBST洗涤酶标板，加入100uL稀释好的Goat pAb to Nanobody(HRP)(用PBS按1:1000的比例稀释)，37℃孵育1小时；PBST洗涤酶标板，加100uL TMB显色液，室温避光反应5分钟，然后加入50uL 2M硫酸终止显色，酶标仪450nm波长下读取吸收值。结果如图1A-图1D所示：四株抗血清白蛋白纳米抗体可同时结合人、小鼠、大鼠、食蟹猴血清白蛋白，且在不同pH条件下(pH5.0和pH7.4)均能结合各种属血清白蛋白。数值统计如表2。
表2抗血清白蛋白纳米抗体与不同种属白蛋白的结合
Figure BDA0002634182330000171
实施例3：抗血清白蛋白纳米抗体的人源化
将以上4株纳米抗体的氨基酸序列置于结构数据库中进行同源结构的搜索，抗体序列见表3。
表3抗血清白蛋白纳米抗体序列编号
抗体编号 Nb1-15 Nb1-60 Nb1-83 Nb3-24
CDR1 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.10 SEQ ID NO.19 SEQ ID NO.28
CDR2 SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.11 SEQ ID NO.20 SEQ ID NO.29
CDR3 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.12 SEQ ID NO.21 SEQ ID NO.30
FR1 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.13 SEQ ID NO.22 SEQ ID NO.31
FR2 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.14 SEQ ID NO.23 SEQ ID NO.32
FR3 SEQ ID NO.6 SEQ ID NO.15 SEQ ID NO.24 SEQ ID NO.33
FR4 SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.16 SEQ ID NO.25 SEQ ID NO.34
全长氨基酸序列 SEQ ID NO.8 SEQ ID NO.17 SEQ ID NO.26 SEQ ID NO.35
全长碱基序列 SEQ ID NO.9 SEQ ID NO.18 SEQ ID NO.27 SEQ ID NO.36
取其中序列等源性较高的结构，对这些结构进行比对，并依据晶体结构分辨率大小和构建的进化树，最终选取包括3dwt在内的蛋白，进行目标纳米抗体序列的多模板同源模建，再依据打分函数的高低排序，选取molpdf最低的结构；然后对模建的最优结构，利用ProtSA服务器计算残基的溶剂可接触性，对模建的最优结构和DP-47进行序列比对，替换相应的暴露于溶剂的残基。最终确定出一种人源化抗血清白蛋白纳米抗体，人源化后抗体序列对应如下表4：
表4人源化抗血清白蛋白纳米抗体序列编号
抗体编号 HuNb1-15 HuNb1-60 HuNb1-83 HuNb3-24
CDR1 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.10 SEQ ID NO.19 SEQ ID NO.28
CDR2 SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.11 SEQ ID NO.20 SEQ ID NO.29
CDR3 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.12 SEQ ID NO.21 SEQ ID NO.30
FR1 SEQ ID NO.37 SEQ ID NO.43 SEQ ID NO.49 SEQ ID NO.55
FR2 SEQ ID NO.38 SEQ ID NO.44 SEQ ID NO.50 SEQ ID NO.56
FR3 SEQ ID NO.39 SEQ ID NO.45 SEQ ID NO.51 SEQ ID NO.57
FR4 SEQ ID NO.40 SEQ ID NO.46 SEQ ID NO.52 SEQ ID NO.58
全长氨基酸序列 SEQ ID NO.41 SEQ ID NO.47 SEQ ID NO.53 SEQ ID NO.59
全长碱基序列 SEQ ID NO.42 SEQ ID NO.48 SEQ ID NO.54 SEQ ID NO.60
实施例4：HSA-IL4R三价纳米抗体的构建及表达
选择IL4R纳米抗体作为代表与人源化白蛋白纳米抗体构建长效蛋白药物，以验证人源化白蛋白纳米抗体延长蛋白质体内半衰期的功能。将以上候选的4株人源化白蛋白纳米抗体分别于IL4R纳米抗体(序列源自专利CN2019110547879)串联形成三价纳米抗体，其结构序列如下表5：
表5多价抗体结构及序列
抗体编号 结构 氨基酸序列 碱基序列
MY8154 IL4R Nb103-Nb103-HSA HuNb1-15 SEQ ID NO.61 SEQ ID NO.62
MY8267 IL4R Nb103-Nb103-HSA HuNb1-60 SEQ ID NO.63 SEQ ID NO.64
MY8162 IL4R Nb103-Nb103-HSA HuNb1-83 SEQ ID NO.65 SEQ ID NO.66
MY8268 IL4R Nb103-Nb103-HSA HuNb3-24 SEQ ID NO.67 SEQ ID NO.68
MY8171 IL4R Nb103-Nb103 SEQ ID NO.69 SEQ ID NO.70
将以上多价抗体利用毕赤酵母进行表达。简要地，表达方法如下：(1)将SEQ IDNO.62、SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70所示的纳米抗体序列碱基构建至pPICZaA载体；(2)用Sac I限制性内切酶线性化后电转化至X-33感受态细胞中；(3)将电转的样品分别涂布在含有不同浓度博来霉素抗性的YPD平板培养基上，置于30℃培养箱中培养3天，具体实施方案可参见Invitrogen公司提供的pPICZaA载体说明书；(4)待平板培养基上长出单克隆后，挑取单克隆置于BMGY培养基中，当BMGY培养液OD值达到20左右，收集菌体后更换至BMMY培养基中，28℃250rpm培养；(5)之后每24h补加终体积为1％的甲醇；连续诱导5天，结束培养；(6)将取到的上清液用阳离子层析纯化目的抗体。
将以上表达纯化的抗体置于不同pH条件下检测其与各种属白蛋白的结合。检测方法与实施例2相同，结果如图2A-图2D所示：与人IL4R纳米抗体融合后的人源化三价抗体仍然可与不同种属血清白蛋白结合，且不依赖于pH变化而改变其结合活性。数值统计如表6。
表6人源化三价抗体与不同种属血清白蛋白的结合
Figure BDA0002634182330000191
Figure BDA0002634182330000201
实施例5：抗血清白蛋白纳米抗体在小鼠体内的半衰期
分别将100ug酵母细胞表达的多价抗体静脉注射至小鼠体内，给药后以5min、3h、8h、24h、48h、96h、144h分别取眼眶血，离心后分离血浆。其中对照抗体MY8171给药后的采血时间点为5min、15min、30min、1.5h和3h。然后利用ELISA检测进行PK分析。将1ug/mL hIL4R蛋白以100uL/孔包被酶标版过夜；PBST洗板5次，加入300uL 0.3％Casein室温封闭2小时；PBST洗板5次，将稀释的血清样品加入相应孔中37℃孵育1小时；PBST洗板5次，以100uL/孔加入Goat1 pAb to Nanobody-HRP(1：1000稀释)37℃孵育1小时；PBST洗板5次，加入TMB显色液室温静置显色5分钟，加入2M硫酸终止反应，酶标仪450nm波长下读取吸收值。将检测结果依据标准曲线进行换算，获得时间-药物浓度关系图，结果如图3所示：不含有白蛋白纳米抗体的二价抗体MY8171在小鼠体内的半衰期只有约1.86小时，而带有抗血清白蛋白纳米抗体的三价抗体其在小鼠体内的半衰期均有显著的延长(如表7所示)，最高可延长约22倍。
表7不同抗血清白蛋白纳米抗体在小鼠体内的半衰期
抗体编号 MY8171 MY8154 MY8267 MY8162 MY8268
<![CDATA[T<sub>1/2</sub>(hours)]]> 1.86 16.50 30.35 8.98 40.99
实施例6：抗血清白蛋白纳米抗体在大鼠体内的半衰期
分别将400ug酵母细胞表达的多价抗体静脉注射至大鼠体内，给药后以5min、3h、8h、24h、48h、96h、144h分别取眼眶血，离心后分离血浆。其中对照抗体MY8171给药后的采血时间点为5min、15min、30min、1.5h和3h。然后利用ELISA检测进行PK分析。检测方法同实施例5。将检测结果依据标准曲线进行换算，获得时间-药物浓度关系图，结果如图4所示：不含有白蛋白纳米抗体的二价抗体MY8171在大鼠体内的半衰期只有约0.82小时，而带有抗血清白蛋白纳米抗体的三价抗体其在小鼠体内的半衰期均有显著的延长(如表8所示)，最高可延长约63倍。
表8不同抗血清白蛋白纳米抗体在大鼠体内的半衰期
抗体编号 MY8171 MY8154 MY8267 MY8268
<![CDATA[T<sub>1/2</sub>(hours)]]> 0.82 41.63 51.96 51.42
实施例7：抗血清白蛋白纳米抗体在食蟹猴体内的半衰期
将MY8267和MY8268两个抗体以2mg/kg剂量分别静脉注射食蟹猴左前肢，给药后按5min、20min、1h、2h、4h、8h、16h、1day、2days、4days、6days、8days、11days、14days、17days、20days、23days、26days、29days、32days、35days分别从右前肢取血，离心后分离血浆。然后利用ELISA检测进行PK分析。检测方法同实施例5。将检测结果依据标准曲线进行换算，获得时间-药物浓度关系图，结果如图5所示：带有抗血清白蛋白纳米抗体的三价抗体在食蟹猴体内的半衰期均可达到约9-15天(表9)。
表9不同抗血清白蛋白纳米抗体在食蟹猴体内的半衰期
抗体编号 MY8267 MY8268
<![CDATA[T<sub>1/2</sub>(days)]]> 9.53 14.21
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海洛启生物医药技术有限公司
<120> 非pH依赖性长效型抗血清白蛋白纳米抗体及其应用
<130> P2020-1480
<160> 70
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 1
Gly Tyr Thr Tyr Thr Thr Ala Cys Met Ala
1               5                   10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 2
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<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 3
Ala Ala Ala Asn Tyr Gly Trp Gly Cys Ser Arg Trp Ser Asp Tyr Asn
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Tyr
<210> 4
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<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser
            20                  25
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<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 5
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<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 6
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1               5                   10                  15
Ala Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
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Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
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<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 8
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1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Thr Ala
            20                  25                  30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val
        35                  40                  45
Ala Arg Phe Tyr Thr His Ser Gly Asn Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Ala Asn Tyr Gly Trp Gly Cys Ser Arg Trp Ser Asp Tyr Asn
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Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 9
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ccgggtaaag aacgtgaacg tgttgcgcgt ttctacaccc actctggtaa cgcgtactac 180
gcggactctg ttaaaggtcg tttcaccatc tctcaggaca acgcgaaaaa aaccgtttac 240
ctgcagatga actctctgaa accggaagac accgcgatgt actactgcgc ggcggcgaac 300
tacggttggg gttgctctcg ttggtctgac tacaactacc gtggtcaggg tacccaggtt 360
accgtttctt ct 372
<210> 10
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<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
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Gly Phe Arg Phe Ser Ser Tyr Trp Met Tyr
1               5                   10
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<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
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<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
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Tyr Arg Ser
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<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
            20                  25
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<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
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<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 15
Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1               5                   10                  15
Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp
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Thr Ala Val Tyr Phe Cys
        35
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<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
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<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Asn Ser Ser Gly Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Asp Ser Gly Asp Gly Lys Arg Tyr Trp Ser Gly Glu Tyr Phe
            100                 105                 110
Tyr Arg Ser Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
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ccagggaagg ggctcgagtg ggtctcagct attaatagta gtggtggtta cacacgctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa cacgctgttt 240
ctgcaaatga acagcctgaa aactgaggac actgccgtgt atttctgcgc cacagattcg 300
ggtgacggaa aacggtattg gagtggtgaa tacttctacc gctctagggg ccaggggacc 360
caggtcaccg tctcctca 378
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<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 19
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1               5                   10
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<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
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<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 22
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr
            20                  25
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<400> 23
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala
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<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 24
Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ala
1               5                   10                  15
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<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Thr Arg Tyr Ser Ala Pro
            20                  25                  30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ala Gly Asp Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
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<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
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ccaggaaagg agcgcgaggg ggtcgcagcg attgcaggtg acggtaccac aagctacgca 180
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Ile Asn Ser Gly Gly Thr Tyr Thr
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<212> PRT
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Trp Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Ser Gly Asp Gly Lys Arg Tyr Cys Ser Gly Gly Tyr Cys
            100                 105                 110
Tyr Arg Ser Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 36
<211> 378
<212> DNA
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 36
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgggtt caccttcagt aggtactgga tgttctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctcgaatg gatctcagat attaatagtg gtggaactta cacacgctat 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccgtc tccagagaca atgccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgaa aactgaggac actgccgtgt attactgcgc cacaaattcg 300
ggtgacggaa aacggtattg cagtggtggt tactgctacc gctctagggg ccaggggacc 360
caggtcaccg tctcctca 378
<210> 37
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser
            20                  25
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val Ala Arg
1               5                   10                  15
<210> 39
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1               5                   10                  15
Ala Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        35
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210> 41
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Thr Ala
            20                  25                  30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
        35                  40                  45
Ala Arg Phe Tyr Thr His Ser Gly Asn Ala Phe Tyr Thr His Ser Gly
    50                  55                  60
Asn Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln
65                  70                  75                  80
Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro
                85                  90                  95
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Asn Tyr Gly Trp Gly
            100                 105                 110
Cys Ser Arg Trp Ser Asp Tyr Asn Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
    130
<210> 42
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gaggttcaat tgcaagaatc tggtggtggt ttggttcaac caggtggttc tttgagattg 60
tcttgtgctg tttctggtta cacttacact actgcttgta tggcttggtt cagacaagct 120
ccaggtaagg gtttggaaag agttgctaga ttctacactc actctggtaa cgctttctac 180
actcactctg gtaacgctta ctacgctgac tctgttaagg gtagattcac tatttctcaa 240
gacaacgcta agaagactgt ttacttgcaa atgaactctt tgaagccaga agacactgct 300
gtttactact gtgctgctgc taactacggt tggggttgtt ctagatggtc tgactacaac 360
tacagaggtc aaggtacttt ggttactgtt tcttct 396
<210> 43
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
            20                  25
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala
1               5                   10                  15
<210> 45
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1               5                   10                  15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        35
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210> 47
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Asn Ser Ser Gly Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Asp Ser Gly Asp Gly Lys Arg Tyr Trp Ser Gly Glu Tyr Phe
            100                 105                 110
Tyr Arg Ser Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 48
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gaggttcaat tgcaagaatc tggtggtggt ttggttcaac caggtggttc tttgagattg 60
tcttgtgctg cttctggttt tagattttct tcttactgga tgtactgggt tagacaagct 120
ccaggtaaag gattggaatg ggtttctgct attaactctt ctggtggtta cactagatac 180
gctgattctg ttaagggtag attcactata tccagagata acgctaagaa cactttgtac 240
ttgcagatga actctttgag agctgaagat actgctgttt actactgtgc taccgattct 300
ggagatggaa agagatactg gtccggtgag tatttctaca gatccagagg tcaaggtacc 360
ttggttaccg tttcttct 378
<210> 49
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr
            20                  25
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala
1               5                   10                  15
<210> 51
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1               5                   10                  15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
        35
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210> 53
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Thr Arg Tyr Ser Ala Pro
            20                  25                  30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ala Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Ala Asp Pro Phe Thr Trp Cys Ser Arg Arg Arg Pro Tyr Gln Tyr Ala
            100                 105                 110
His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 54
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gaggttcaat tgcaagaatc tggtggtggt ttggttcaac caggtggttc tttgagattg 60
tcttgtgctg ctactggtac tagatactct gctccatgta tgggttggtt tagacaagct 120
ccaggaaagg gtttggaagg tgttgctgct attgctggtg acggtactac ttactacgct 180
gattctgtta agggtagatt cactatttcc agagataact ctaagaacac tttgtacttg 240
caaatgaact ctttgaaaac tgaagatact gctatgtact actgtgctgc tgatccattc 300
acttggtgtt ccagaagaag gccataccaa tacgctcatt ggggtcaagg tactttggtt 360
actgtttctt ct 372
<210> 55
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
            20                  25
<210> 56
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser Asp
1               5                   10                  15
<210> 57
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1               5                   10                  15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        35
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210> 59
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Ser Asp Ile Asn Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Ser Gly Asp Gly Lys Arg Tyr Cys Ser Gly Gly Tyr Cys
            100                 105                 110
Tyr Arg Ser Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210> 60
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gaggttcaat tgcaagaatc tggtggtggt ttggttcaac caggtggttc tttgagattg 60
tcttgtgctg cttctggttt tactttttcc agatactgga tgttttgggt tagacaagct 120
ccaggtaaag gtttggaatg gatttctgat attaattctg gtggtactta cactagatac 180
gctgattctg ttaagggtag attcactatt tcaagagata acgctaagaa cactttgtac 240
ttgcaaatga actctttgag agctgaagat actgctgttt actactgtgc tactaactcc 300
ggtgacggta aaagatactg ttctggtgga tactgttaca gatctcgtgg tcaaggtact 360
ttggttactg tttcctct 378
<210> 61
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr
            20                  25                  30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ala Val
        35                  40                  45
Ala Ser Ile Arg Pro Arg Ser Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ser Asp Asn Asp Gly Asn Cys Gln Asp Tyr Trp Gly Lys Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
    130                 135                 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ala Val
                165                 170                 175
Ala Ser Ile Arg Pro Arg Ser Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
            180                 185                 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
        195                 200                 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ala Ala Ser Asp Asn Asp Gly Asn Cys Gln Asp Tyr Trp Gly Lys Gly
225                 230                 235                 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
                245                 250                 255
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
            260                 265                 270
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
    290                 295                 300
Ala Arg Phe Tyr Thr His Ser Gly Asn Ala Phe Tyr Thr His Ser Gly
305                 310                 315                 320
Asn Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln
                325                 330                 335
Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro
            340                 345                 350
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Asn Tyr Gly Trp Gly
        355                 360                 365
Cys Ser Arg Trp Ser Asp Tyr Asn Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val
    370                 375                 380
Thr Val Ser Ser
385
<210> 62
<211> 1164
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gaagttcaat tgcaagaatc cggtggtggt ttggttcaac caggtggttc tttgagattg 60
tcttgtgctg cttccggttc cacttcttac agatactgta tggcttggtt tagacaagcc 120
cctggtaaag gattggaagc tgttgcctct attagaccta gatccggaag agcttactat 180
gctgattctg ttaagggtag attcaccatt tctcgtgata actccaagaa cactttgtac 240
ttgcaaatga actctttgag agccgaagat actgctatgt actactgtgc tgcttctgat 300
aatgatggta actgtcaaga ttattgggga aagggaacac ttgttactgt ttcttctggt 360
ggaggtggtt ctggtggtgg ttctgaagtt caattgcaag agtctggtgg tggattggtt 420
caacctggtg gttccttgag gttgtcttgt gctgcttctg gttctacttc ttacagatat 480
tgtatggcct ggtttagaca agctccaggt aaaggacttg aagctgttgc ttctattaga 540
ccaagatctg gtagagctta ctacgctgat tcagttaaag gtagattcac tatttccaga 600
gataactcta agaacacttt gtacctgcaa atgaattctc tgagagctga agatactgcc 660
atgtactatt gtgcagcttc tgataacgat ggtaattgtc aagattactg gggaaagggt 720
actttggtta ctgtttcctc cggtggtggt ggatctggag gtggttctga ggttcaattg 780
caagaatctg gtggtggttt ggttcaacca ggtggttctt tgagattgtc ttgtgctgtt 840
tctggttaca cttacactac tgcttgtatg gcttggttca gacaagctcc aggtaagggt 900
ttggaaagag ttgctagatt ctacactcac tctggtaacg ctttctacac tcactctggt 960
aacgcttact acgctgactc tgttaagggt agattcacta tttctcaaga caacgctaag 1020
aagactgttt acttgcaaat gaactctttg aagccagaag acactgctgt ttactactgt 1080
gctgctgcta actacggttg gggttgttct agatggtctg actacaacta cagaggtcaa 1140
ggtactttgg ttactgtttc ttcc 1164
<210> 63
<211> 382
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr
            20                  25                  30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ala Val
        35                  40                  45
Ala Ser Ile Arg Pro Arg Ser Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Ser Asp Asn Asp Gly Asn Cys Gln Asp Tyr Trp Gly Lys Gly
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Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr
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Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ala Val
                165                 170                 175
Ala Ser Ile Arg Pro Arg Ser Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ala Ala Ser Asp Asn Asp Gly Asn Cys Gln Asp Tyr Trp Gly Lys Gly
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Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Ser Ser Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<400> 65
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr
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Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ala Val
        35                  40                  45
Ala Ser Ile Arg Pro Arg Ser Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Ser Asp Asn Asp Gly Asn Cys Gln Asp Tyr Trp Gly Lys Gly
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Ala Ala Ile Ala Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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<400> 67
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ala Ser Ile Arg Pro Arg Ser Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Ala Ala Ser Asp Asn Asp Gly Asn Cys Gln Asp Tyr Trp Gly Lys Gly
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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caacctggtg gttccttgag gttgtcttgt gctgcttctg gttctacttc ttacagatat 480
tgtatggcct ggtttagaca agctccaggt aaaggacttg aagctgttgc ttctattaga 540
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actttggtta ctgtttcctc c 741

Claims (19)

1.一种抗血清白蛋白纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体能够特异性结合血清白蛋白，且所述纳米抗体的VHH链具有如下的互补决定区CDR：
(1)SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2、和SEQ ID NO:3所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的VHH链还包括框架区FR，所述的框架区FR选自下组：
(1)SEQ ID NO:4所示的FR1、SEQ ID NO:5所示的FR2、SEQ ID NO:6所示的FR3、和SEQID NO:7所示的FR4；和
(2)SEQ ID NO:37所示的FR1、SEQ ID NO:38所示的FR2、SEQ ID NO:39所示的FR3、和SEQ ID NO:40所示的FR4。
3.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的VHH链的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:41。
4.一种抗血清白蛋白抗体，所述的抗体包括如权利要求1所述的纳米抗体的VHH链。
5.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：权利要求1所述的纳米抗体或权利要求4所述的抗体。
6.如权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:42。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求5所述的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求7所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸。
9.一种产生抗血清白蛋白纳米抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞，从而获得含抗血清白蛋白纳米抗体的培养物；
(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的抗血清白蛋白纳米抗体；和
(c)任选地，纯化和/或修饰步骤(b)所获得的抗血清白蛋白纳米抗体。
10.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白具有：
(i)权利要求1所述纳米抗体；
(ii)任选的具有治疗功能的多肽分子或片段。
11.一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1所述的抗血清白蛋白纳米抗体，或如权利要求4所述的抗血清白蛋白抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、细胞因子、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
12.如权利要求11所述的免疫偶联物，其特征在于，所述偶联部分为放射性核素或酶。
13.一种结合物，所述结合物含有：
(a)如权利要求1所述的抗血清白蛋白纳米抗体，或如权利要求4所述的抗血清白蛋白抗体；和可操作性连接的
(b)选自下组的修饰标记：化学标记和生物标记。
14.一种多特异性抗体，所述的多特异性抗体包含：如权利要求1所述的抗血清白蛋白纳米抗体，或如权利要求4所述的抗血清白蛋白抗体。
15.一种药物组合物，所述的药物组合物包含：
(i)如权利要求1所述的抗血清白蛋白纳米抗体、如权利要求4所述的抗血清白蛋白抗体、如权利要求11所述的免疫偶联物、如权利要求13所述的结合物、如权利要求14所述的多特异性抗体或如权利要求10所述的融合蛋白；
(ii)药学上可接受的载体。
16.如权利要求1所述的抗血清白蛋白纳米抗体、如权利要求4所述的抗血清白蛋白抗体、或如权利要求11所述的免疫偶联物的用途：(a)用于制备检测血清白蛋白的试剂、检测板或试剂盒；(b)用于制备结合血清白蛋白的药剂。
17.一种用于纯化血清白蛋白的免疫吸附材料，其中，所述免疫吸附材料包含如权利要求1所述的抗血清白蛋白纳米抗体、或如权利要求4所述的抗血清白蛋白抗体、或如权利要求1所述的抗血清白蛋白纳米抗体的VHH链。
18.一种体外非诊断性检测样品中血清白蛋白或其片段的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如权利要求1所述的抗血清白蛋白纳米抗体、如权利要求4所述的抗血清白蛋白抗体、或如权利要求11所述的免疫偶联物接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在血清白蛋白或其片段。
19.一种重组多肽的制备方法，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养如权利要求8所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽包括如权利要求1所述的抗血清白蛋白纳米抗体、如权利要求4所述的抗血清白蛋白抗体、如权利要求14所述的多特异性抗体、如权利要求10所述的融合蛋白。
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