CN114058666A - 一种发酵生产肌苷专用蛋白胨及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵生产肌苷专用蛋白胨及其制备方法和应用，属于蛋白胨制备领域。本发明公开一种发酵生产肌苷专用蛋白胨的制备方法，包括以下步骤：(1)向鱼骨汤中加入多种酶获得鱼骨蛋白胨浓缩液；(2)向牛骨汤中加入多种酶获得鱼骨蛋白胨浓缩液；(3)向豆粕滤液中加入多种酶获得豆粕蛋白胨浓缩液；(4)将上述三种浓缩液按比例混合，干燥成粉末，即得所述发酵生产肌苷专用蛋白胨。通过该方法制得的蛋白胨分子量分布合理，在促进菌种大量繁殖生长的同时有效控制菌种发酵代谢速度，延长肌苷合成时间，提高肌苷产量，为大规模发酵生产肌苷奠定重要基础。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白胨制备领域，特别是涉及一种发酵生产肌苷专用蛋白胨及其制备方法和应用。
背景技术
肌苷(inosine)又称次黄嘌呤核苷，其分子式为C10H12N4O5，相对分子质量为268.23。肌苷在食品和医药等领域有着非常广泛的应用价值，在食品领域，肌苷是食品中美味的呈味物，其含量常常作为衡量食品“新鲜度”的特征指标之一；它是各种调味食品例如味精、酱油等的营养助鲜剂，同时也是食品工业中有效增鲜剂肌苷酸、呈味核苷酸二钠的主要原料之一；在医药领域中，肌苷是一种细胞复活剂，具有刺激细胞、增强细胞代谢等功能。通常在医学上被用于预防和治疗心脏和肝脏等器官的细胞损伤，有助于肝功能恢复正常，并能预防及解除由血防药物引起的对心脏或肝脏的副作用，是治疗冠心病、肝炎、白血球减少症等的良效药物。
目前，肌苷的生产方法基本上可以分为三大类：化学分解法、酶解法以及微生物发酵法。化学合成法生产肌苷对设备条件要求高，工艺复杂，投入生产受限制；酶解法生产成本高影响肌苷的大规模生产；微生物发酵法是目前生产肌苷的主要采用方法。
蛋白胨是微生物培养基的主要原料，其是一种复杂的混合物，由各种氨基酸、多肽、胨、
组成，不同的生物体需要特定的氨基酸和多肽，因此存在着各种蛋白胨，而不同的蛋白胨对肌苷发酵水平影响不同，目前为止，尚未有特异针对发酵生产肌苷的专用蛋白胨。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵生产肌苷专用蛋白胨及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过该制备方法得到的蛋白胨分子量分布合理，在促进菌种大量繁殖生长的同时有效控制菌种发酵代谢速度，提高肌苷产量。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种发酵生产肌苷专用蛋白胨的制备方法，包括以下步骤：
(1)取鱼骨，加水蒸煮，向去掉油层的骨汤中加入糜蛋白酶、氨肽酶和中性蛋白酶进行酶解，酶解结束得到鱼骨酶解液，再经浓缩获得鱼骨蛋白胨浓缩液；
(2)取牛骨，加水蒸煮，向去掉油层的骨汤中加入风味蛋白酶、氨肽酶和木瓜蛋白酶进行酶解，酶解结束得到牛骨酶解液，再经浓缩获得牛骨蛋白胨浓缩液；
(3)取豆粕，加水蒸煮，过滤后向滤液中加入胰蛋白酶、氨肽酶和中性蛋白酶进行酶解，酶解结束得到豆粕酶解液，再经浓缩获得豆粕蛋白胨浓缩液；
(4)将所述鱼骨蛋白胨浓缩液、所述牛骨蛋白胨浓缩液和所述豆粕蛋白胨浓缩液按质量比4-5:7:2-3混合，再干燥成粉末，即得所述发酵生产肌苷专用蛋白胨。
进一步的，在步骤(1)中，所述糜蛋白酶、氨肽酶和中性蛋白酶的加入量分别为鱼骨重量的1‰、2‰和1‰。
进一步的，在步骤(1)中，所述酶解条件为pH 7-7.5,温度为45-50℃,时间为140min。
进一步的，在步骤(2)中，所述风味蛋白酶、氨肽酶和木瓜蛋白酶的加入量分别为牛骨重量的1‰、2‰和1‰。
进一步的，在步骤(2)中，所述酶解条件为pH 6.5-7,温度为45-50℃,时间为140min。
进一步的，在步骤(3)中，所述胰蛋白酶、氨肽酶和中性蛋白酶的加入量分别为豆粕重量的1‰、2‰和1‰。
进一步的，在步骤(3)中，所述酶解条件为pH 7-7.5,温度为50-55℃，时间为140min。
进一步的，步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中所述酶解过程采用间歇式搅拌，具体为搅10min停5min，搅10min停5min，搅15min停10min，搅15min停10min，搅15min停15min，搅15min停15min。
本发明还提供通过以上制备方法制备得到的发酵生产肌苷专用蛋白胨。
本发明还提供所述的发酵生产肌苷专用蛋白胨在发酵生产肌苷中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供一种发酵生产肌苷专用蛋白胨的制备方法，该方法采用复合酶技术分别酶解不同物料，同时通过间歇式搅拌方式，在加大酶解反应速率的同时，避免过度搅拌影响酶稳定性，采用本发明的制备方法最终得到发酵生产肌苷专用蛋白胨。该蛋白胨分子量分布合理，其中小分子量多肽占比达60％，比例适中，能够有效促进节杆菌前期的生长繁殖，保证其生物量积累，为肌苷的大量合成奠定基础；同时该蛋白胨中还具有一定比例大分子量多肽，可以有效控制菌种后期的代谢发酵速度，延长肌苷合成时间，提高肌苷产量,本发明能促进肌苷产量高达33g/L,为大规模发酵生产肌苷奠定重要基础。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
一种发酵生产肌苷专用蛋白胨的制备方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜鱼骨，加水高温高压蒸煮(新鲜鱼骨与水质量比为1:6)，在3个标准大气压下，保温1小时。骨汤压至储料罐(罐内自身压力)，经过油水分离器，将去掉油层的骨汤放至酶解罐，调pH值至7，温度50℃，加入鱼骨总重1‰的糜蛋白酶，2‰的氨肽酶，1‰的中性蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅15min停10min，搅15min停10min，搅15min停15min，搅15min停15min。酶解结束，加500mL醋酸，再用盐酸调pH至5.1，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不能开搅拌。结束后过滤(400目滤布),得到的滤液经真空浓缩，浓缩至固含量50％，即得鱼骨蛋白胨浓缩液。
(2)取鲜牛骨，加水高温高压蒸煮(新鲜牛骨与水质量比为1:6)，在3个标准大气压下，保温1小时。骨汤压至储料罐(罐内自身压力)，经过油水分离器，将去掉油层的骨汤放至酶解罐，调pH值至6.8，温度50℃。加入牛骨总重1‰的风味蛋白酶，2‰的氨肽酶，1‰的木瓜蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅15min停10min，搅15min停10min，搅15min停15min，搅15min停15min。酶解结束，加500mL醋酸，再用盐酸调pH至5.1，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不能开搅拌。结束后过滤(400目滤布),得到的滤液经真空浓缩，浓缩至固含量50％，即得牛骨蛋白胨浓缩液。
3.取低温豆粕，加水蒸煮(低温豆粕与水质量比为1:8)，升温至95℃，保温1小时。再用板框过滤滤出清液，泵至酶解罐。滤液调pH值至7，温度50℃。之后加入豆粕总重1‰的胰蛋白酶，2‰的氨肽酶，1‰的中性蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅15min停10min，搅15min停10min，搅15min停15min，搅15min停15min。酶解结束后，再用氢氧化钠调pH至8，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不能开搅拌。结束后过滤(400目滤布)，得到的滤液经真空浓缩，浓缩至固含量50％，即得豆粕蛋白胨浓缩液。
(4)将鱼骨蛋白胨浓缩液、牛骨蛋白胨浓缩液和豆粕蛋白胨浓缩液以质量比4:7:2混合，再经过离心式喷雾干燥机干燥成粉，即得蛋白胨。
实施例2
(1)取新鲜鱼骨，加水高温高压蒸煮(新鲜鱼骨与水质量比为1:6)，在3个标准大气压下，保温1小时。骨汤压至储料罐(罐内自身压力)，经过油水分离器，将去掉油层的骨汤放至酶解罐，调pH值至7.2，温度50℃，加入鱼骨总重1‰的糜蛋白酶，2‰的氨肽酶，1‰的中性蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅15min停10min，搅15min停10min，搅15min停15min，搅15min停15min。酶解结束，加500mL醋酸，再用盐酸调pH至5.2，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不能开搅拌。结束后过滤(400目滤布),得到的滤液经真空浓缩，浓缩至固含量50％，即得鱼骨蛋白胨浓缩液。
(2)取鲜牛骨，加水高温高压蒸煮(新鲜牛骨与水质量比为1:6)，在3个标准大气压下，保温1小时。骨汤压至储料罐(罐内自身压力)，经过油水分离器，将去掉油层的骨汤放至酶解罐，调pH值至6.7，温度50℃。加入牛骨总重1‰的风味蛋白酶，2‰的氨肽酶，1‰的木瓜蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅10min停10min，搅15min停10min，搅15min停10min，搅15min停15min，搅15min停15min。酶解结束，加500mL醋酸，再用盐酸调pH至5.2，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不能开搅拌。结束后过滤(400目滤布),得到的滤液经真空浓缩，浓缩至固含量50％，即得牛骨蛋白胨浓缩液。
3.取低温豆粕，加水蒸煮(低温豆粕与水质量比为1:8)，升温至95℃，保温1小时。再用板框过滤滤出清液，泵至酶解罐。滤液调pH值至7.1，温度50℃。之后加入豆粕总重1‰的胰蛋白酶，2‰的氨肽酶，1‰的中性蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅15min停10min，搅15min停10min，搅15min停15min，搅15min停15min。酶解结束后，再用氢氧化钠调pH至8，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不能开搅拌。结束后过滤(400目滤布)，得到的滤液经真空浓缩，浓缩至固含量50％，即得豆粕蛋白胨浓缩液。
(4)将鱼骨蛋白胨浓缩液、牛骨蛋白胨浓缩液和豆粕蛋白胨浓缩液以质量比4:7:3混合，再经过离心式喷雾干燥机干燥成粉，即得蛋白胨。
实施例3
(1)取新鲜鱼骨，加水高温高压蒸煮(新鲜鱼骨与水质量比为1:6)，在3个标准大气压下，保温1小时。骨汤压至储料罐(罐内自身压力)，经过油水分离器，将去掉油层的骨汤放至酶解罐，调pH值至7.4，温度45℃，加入鱼骨总重1‰的糜蛋白酶，2‰的氨肽酶，1‰的中性蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅15min停10min，搅15min停10min，搅15min停15min，搅15min停15min。酶解结束，加500mL醋酸，再用盐酸调pH至5.3，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不能开搅拌。结束后过滤(400目滤布),得到的滤液经真空浓缩，浓缩至固含量50％，即得鱼骨蛋白胨浓缩液。
(2)取鲜牛骨，加水高温高压蒸煮(新鲜牛骨与水质量比为1:6)，在3个标准大气压下，保温1小时。骨汤压至储料罐(罐内自身压力)，经过油水分离器，将去掉油层的骨汤放至酶解罐，调pH值至7，温度47℃。加入牛骨总重1‰的风味蛋白酶，2‰的氨肽酶，1‰的木瓜蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅15min停10min，搅15min停10min，搅15min停15min，搅15min停15min。酶解结束，加500mL醋酸，再用盐酸调pH至5.3，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不能开搅拌。结束后过滤(400目滤布),得到的滤液经真空浓缩，浓缩至固含量50％，即得牛骨蛋白胨浓缩液。
3.取低温豆粕，加水蒸煮(低温豆粕与水质量比为1:8)，升温至95℃，保温1小时。再用板框过滤滤出清液，泵至酶解罐。滤液调pH值至7.3，温度55℃。之后加入豆粕总重1‰的胰蛋白酶，2‰的氨肽酶，1‰的中性蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅15min停10min，搅15min停10min，搅15min停15min，搅15min停15min。酶解结束后，再用氢氧化钠调pH至8，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不能开搅拌。结束后过滤(400目滤布)，得到的滤液经真空浓缩，浓缩至固含量50％，即得豆粕蛋白胨浓缩液。
(4)将鱼骨蛋白胨浓缩液、牛骨蛋白胨浓缩液和豆粕蛋白胨浓缩液以质量比5:7:2混合，再经过离心式喷雾干燥机干燥成粉，即得蛋白胨。
实施例4
(1)取新鲜鱼骨，加水高温高压蒸煮(新鲜鱼骨与水质量比为1:6)，在3个标准大气压下，保温1小时。骨汤压至储料罐(罐内自身压力)，经过油水分离器，将去掉油层的骨汤放至酶解罐，调pH值至7.5，温度43℃，加入鱼骨总重1‰的糜蛋白酶，2‰的氨肽酶，1‰的中性蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅15min停10min，搅15min停10min，搅15min停15min，搅15min停15min。酶解结束，加500mL醋酸，再用盐酸调pH至5.3，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不能开搅拌。结束后过滤(400目滤布),得到的滤液经真空浓缩，浓缩至固含量50％，即得鱼骨蛋白胨浓缩液。
(2)取鲜牛骨，加水高温高压蒸煮(新鲜牛骨与水质量比为1:6)，在3个标准大气压下，保温1小时。骨汤压至储料罐(罐内自身压力)，经过油水分离器，将去掉油层的骨汤放至酶解罐，调pH值至6.5，温度45℃。加入牛骨总重1‰的风味蛋白酶，2‰的氨肽酶，1‰的木瓜蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅15min停10min，搅15min停10min，搅15min停15min，搅15min停15min。酶解结束，加500mL醋酸，再用盐酸调pH至5.3，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不能开搅拌。结束后过滤(400目滤布),得到的滤液经真空浓缩，浓缩至固含量50％，即得牛骨蛋白胨浓缩液。
3.取低温豆粕，加水蒸煮(低温豆粕与水质量比为1:8)，升温至95℃，保温1小时。再用板框过滤滤出清液，泵至酶解罐。滤液调pH值至7，温度52℃。之后加入豆粕总重1‰的胰蛋白酶，2‰的氨肽酶，1‰的中性蛋白酶，缓慢搅拌，搅10min停5min，搅10min停5min，搅15min停10min，搅15min停10min，搅15min停15min，搅15min停15min。酶解结束后，再用氢氧化钠调pH至8，升温至90℃后慢慢降温，2-3小时降至50℃左右即可，降温过程中不能开搅拌。结束后过滤(400目滤布)，得到的滤液经真空浓缩，浓缩至固含量50％，即得豆粕蛋白胨浓缩液。
(4)将鱼骨蛋白胨浓缩液、牛骨蛋白胨浓缩液和豆粕蛋白胨浓缩液以质量比5:7:3混合，再经过离心式喷雾干燥机干燥成粉，即得蛋白胨。
对比例1
与实施例1的区别在于，步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中均使用1‰的糜蛋白酶，2‰的氨肽酶，1‰的中性蛋白酶。
对比例2
与实施例1的区别在于，步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中均使用1‰的风味蛋白酶，2‰的氨肽酶，1‰的木瓜蛋白酶。
对比例3
与实施例1的区别在于，步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中均使用1‰的胰蛋白酶，2‰的氨肽酶，1‰的中性蛋白酶。
对比例4
与实施例1的区别在于，步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)酶解过程中搅拌方式为：搅10min停1min，搅15min停1min，搅15min停3min，搅20min停5min，搅20min停10min，搅30min停10min。
使用SDS-PAGE方法测量实施例1-4以及对比例1-4的蛋白胨粉末成品的分子量分布，结果如表1所示：
表1实施例1-4及对比例1-4的蛋白胨分子量分布结果(％)
效果例1
1.节杆菌ACCC12070，由山东理工大学工程生物技术实验室提供。
2.培养基
斜面和种子活化培养基：牛肉膏培养基；
发酵培养基：葡萄糖2％，实施例1-4及对比例1-4的蛋白胨1％，磷酸氢二钠0.2％，硫酸镁0.1％，硫酸锰0.01％，pH7.0。
3.试验过程：
(1)菌种活化：将保存的菌种接种于斜面培养基上，37℃恒温培养18h。
(2)种子培养：从活化18h的斜面上取一环菌种转接到装有25mL种子培养基的250mL三角瓶中，220r/min，34℃培养18h。
(3)种子发酵培养：取培养18h的新鲜种子液，以5％接种量接入装有25mL发酵培养基的250mL三角瓶中，220r/min，34℃培养72h。
(4)肌苷产量的测定
利用高效液相色谱法(HPLC)进行测定。
色谱条件：
色谱仪：Agilent公司1200型高效液相色谱仪
色谱柱：SymmetryC18反相柱(4.6×150mm，3.5μm)
流动相：A：超纯水(含0.5％磷酸)；B：甲醇
检测波长：248nm；流速：0.6mL/min；进样量：20μL；柱温：30℃。
(5)实验结果
分别采用实施例1-4和对比例1-4制备的蛋白胨配制发酵培养基，依次进行发酵培养实验，发酵结束后，检测各组肌苷产量，结果如表2所示：
表2各组发酵液肌苷产量
| 组别 | 肌苷产量(g/L) |
| 实施例1 | 32 |
| 实施例2 | 30 |
| 实施例3 | 33 |
| 实施例4 | 32 |
| 对比例1 | 26 |
| 对比例2 | 25 |
| 对比例3 | 23 |
| 对比例4 | 24 |
结合表1-2的实验结果，可知通过本发明的制备方法得到的蛋白胨中小分子量多肽占比较高，实施例1-4中0-5kDa的多肽占比约62％，低分子量多肽易于吸收，能够促进节杆菌前期的大量增殖，保证其足够的生物量，同时实施例1-4中大分子量5-50kDa的多肽占比达30％左右，保证一定比例的大分子量多肽，在节杆菌大量繁殖后期，可以有效控制菌种的代谢发酵速度，延长肌苷合成时间，提高肌苷产量；而对比例1-3小分子量多肽占比约70％，比例过高，大分子量多肽比例降低，过度提高菌种的生长繁殖速度，反而不利于肌苷的合成；对比例4小分子量多肽占比仅40％，大分子量多肽比例达55％，占比过多，很可能是在其蛋白胨制备工艺中增加搅拌时间，缩短停歇时间，导致搅拌强度增强，搅拌的剪切力加大，进而致使酶活性不稳定，酶解效果降低，最终得到的蛋白胨小分子量多肽占比太少，不利于菌种的前期繁殖生长，影响肌苷的合成。由此可见，本发明制得的蛋白胨分子量分布合理，在促进菌种大量繁殖生长的同时有效控制菌种发酵代谢速度，提高肌苷产量。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种发酵生产肌苷专用蛋白胨的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取鱼骨，加水蒸煮，向去掉油层的骨汤中加入糜蛋白酶、氨肽酶和中性蛋白酶进行酶解，酶解结束得到鱼骨酶解液，再经浓缩获得鱼骨蛋白胨浓缩液；
(2)取牛骨，加水蒸煮，向去掉油层的骨汤中加入风味蛋白酶、氨肽酶和木瓜蛋白酶进行酶解，酶解结束得到牛骨酶解液，再经浓缩获得牛骨蛋白胨浓缩液；
(3)取豆粕，加水蒸煮，过滤后向滤液中加入胰蛋白酶、氨肽酶、中性蛋白酶，酶解结束得到豆粕酶解液，再经浓缩获得豆粕蛋白胨浓缩液；
(4)将所述鱼骨蛋白胨浓缩液、所述牛骨蛋白胨浓缩液和所述豆粕蛋白胨浓缩液按质量比4-5:7:2-3混合，再干燥成粉末，即得所述发酵生产肌苷专用蛋白胨。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述糜蛋白酶、氨肽酶和中性蛋白酶的加入量分别为鱼骨重量的1‰、2‰和1‰。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述酶解条件为pH 7-7.5,温度为45-50℃,时间为140min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述风味蛋白酶、氨肽酶和木瓜蛋白酶的加入量分别为牛骨重量的1‰、2‰和1‰。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述酶解条件为pH6.5-7,温度为45-50℃,时间为140min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述胰蛋白酶、氨肽酶和中性蛋白酶的加入量分别为豆粕重量的1‰、2‰和1‰。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述酶解条件为pH 7-7.5,温度为50-55℃，时间为140min。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中所述酶解过程采用间歇式搅拌，具体为搅10min停5min，搅10min停5min，搅15min停10min，搅15min停10min，搅15min停15min，搅15min停15min。
9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的发酵生产肌苷专用蛋白胨。
10.权利要求9所述的发酵生产肌苷专用蛋白胨在发酵生产肌苷中的应用。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001018229A1 (en) * | 1999-09-09 | 2001-03-15 | Farmland Industries, Inc. | Processes for making protein hydrolysates from animal peptone and for preserving mucosa |
| CN103276038A (zh) * | 2013-05-13 | 2013-09-04 | 贵州新华生化科技发展有限公司 | 一种试剂级蛋白胨的生产方法 |
| CN104830937A (zh) * | 2015-05-14 | 2015-08-12 | 吉林大学 | 一种利用鸡屠宰副产物制备蛋白胨的方法 |
| CN106173193A (zh) * | 2015-05-08 | 2016-12-07 | 上海邦成生物工程有限公司 | 一种固态发酵豆粕的方法 |
| CN108753892A (zh) * | 2018-06-21 | 2018-11-06 | 吴忠市王国旗生物科技有限公司 | 一种蛋白胨的制备工艺 |
| KR20190025101A (ko) * | 2017-08-28 | 2019-03-11 | (주)한국바이오케미칼 | 항영양인자 제어 미생물 마이크로박테리움 하이드로더멀 kbcbs1021 균주 및 이를 이용한 어분 대체용 발효 대두박 제조 방법 |
| CN110063406A (zh) * | 2019-03-19 | 2019-07-30 | 广东温氏大华农生物科技有限公司 | 解淀粉芽孢杆菌及其发酵种子液、应用与豆粕发酵方法 |
-
2021
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001018229A1 (en) * | 1999-09-09 | 2001-03-15 | Farmland Industries, Inc. | Processes for making protein hydrolysates from animal peptone and for preserving mucosa |
| CN103276038A (zh) * | 2013-05-13 | 2013-09-04 | 贵州新华生化科技发展有限公司 | 一种试剂级蛋白胨的生产方法 |
| CN106173193A (zh) * | 2015-05-08 | 2016-12-07 | 上海邦成生物工程有限公司 | 一种固态发酵豆粕的方法 |
| CN104830937A (zh) * | 2015-05-14 | 2015-08-12 | 吉林大学 | 一种利用鸡屠宰副产物制备蛋白胨的方法 |
| KR20190025101A (ko) * | 2017-08-28 | 2019-03-11 | (주)한국바이오케미칼 | 항영양인자 제어 미생물 마이크로박테리움 하이드로더멀 kbcbs1021 균주 및 이를 이용한 어분 대체용 발효 대두박 제조 방법 |
| CN108753892A (zh) * | 2018-06-21 | 2018-11-06 | 吴忠市王国旗生物科技有限公司 | 一种蛋白胨的制备工艺 |
| CN110063406A (zh) * | 2019-03-19 | 2019-07-30 | 广东温氏大华农生物科技有限公司 | 解淀粉芽孢杆菌及其发酵种子液、应用与豆粕发酵方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GUO 等: "Effect of Different Organic Nitrogen Sources on Inosine Biosynthesis", JOURNAL OF EAST CHINA UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, vol. 32, no. 11, pages 1289 - 1292 * |
| 高新星: "枯草芽孢杆菌氨肽酶分泌表达、分子改造及生理功能研究", 中国博士学位论文全文数据 库基础科学辑, no. 02, pages 006 - 66 * |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220218 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |