CN104805026A - 一株产β-半乳糖苷酶菌株及其制备高纯度低聚半乳糖的方法 - Google Patents

一株产β-半乳糖苷酶菌株及其制备高纯度低聚半乳糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产β-半乳糖苷酶菌株及其制备高纯度低聚半乳糖的方法。该产β-半乳糖苷酶菌株为毕赤酵母(pichia pastoris)SMD1168H-pGAZaA-lac，保藏编号为CGMCC No.8349。本发明还公开了其制备高纯度低聚半乳糖的方法，包括：利用毕赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac制备β-半乳糖苷酶；β-半乳糖苷酶催化乳糖合成低聚半乳糖；通过马克斯克鲁维酵母纯化低聚半乳糖混合液；精制得到高纯度的低聚半乳糖。通过上述方法得到的低聚半乳糖的纯度≥90％，收率≥30％。

Description

一株产β-半乳糖苷酶菌株及其制备高纯度低聚半乳糖的方法
技术领域
本发明涉及一种低聚半乳糖的制备方法，具体是利用重组亮白曲霉β-半乳糖苷酶基因的毕赤酵母菌株产β-半乳糖苷酶来催化合成低聚半乳糖的生产方法，属于微生物技术领域。
背景技术
低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)具有低甜度、低热量、低致龋齿性、热酸稳定及食品安全性等特殊的性质，是人体肠道中双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌等有益菌极好的营养源和有效的增殖因子。它可以改善人体肠道的消化吸收功能，常作为一种新型的功能性食品添加剂，被称为食疗效果最好的“双歧因子”。2008年9月，根据《中华人民共和国食品卫生法》和《新资源食品管理办法》的规定，批准GOS为新资源食品。如今已被广泛应用于食品、保健品、乳制品、医药、饮料、饲料等各个行业，其生产应用具有巨大的市场前景。
工业上一般采用米曲霉、脆壁克鲁维酵母等生产低聚半乳糖。GOS初始生成的浓度多为30％左右，为了得到高纯度的GOS，需要对GOS进行分离纯化。其方法包括色谱柱法、纳滤膜法、酶法和微生物发酵法。其中微生物发酵法操作简单，成本较低，其原理是利用微生物需代谢单糖或乳糖来得到生长的能量，从而将杂糖成分去除来达到纯化的目的。现有技术中，专利文献报道了不同菌种产的β-半乳糖苷酶催化合成GOS，江波等人利用费式志贺菌产的β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖，产率达到44.5％；西班牙的Rodriguez-Colinas B等人利用来自乳酸克鲁维酵母的β-半乳糖苷酶来催化合成低聚半乳糖，酵母细胞用乙醇处理后冻干，得到低聚半乳糖的最大产率为44％。对于GOS混合液中的单糖组分，有专利利用酵母等发酵消耗其中的葡萄糖，但是对半乳糖和乳糖没有进行很好的分离。同时，我国从20世纪90年代开始对GOS进行工业化研究，但高纯度的GOS还没有实现工业化生产。
发明内容
为克服现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种产β-半乳糖苷酶基因的毕赤酵母菌株。本发明同时提供了一种应用上述菌株产的β-半乳糖苷酶催化高浓度乳糖水解和转苷，合成GOS的生产方法。
本发明所述的产β-半乳糖苷酶的菌株为毕赤酵母(pichia pastoris)SMD1168H-pGAZaA-lac，该菌株是将自亮白曲霉菌体中克隆到的β-半乳糖苷酶基因通过基因工程手段转化入毕赤酵母SMD1168H中，得到的高产β-半乳糖苷酶的毕赤酵母菌株。该菌株 于2013年10月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏编号为CGMCC No.8349。
本发明利用上述菌株制备高纯度低聚半乳糖的方法，其特征是，(一)利用毕赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac制备β-半乳糖苷酶；(二)β-半乳糖苷酶催化乳糖合成低聚半乳糖；(三)通过马克斯克鲁维酵母纯化低聚半乳糖混合液；(四)精制得到高纯度的低聚半乳糖。
进一步的，所述(一)利用毕赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac制备β-半乳糖苷酶，具体包括以下步骤：
(1)将毕赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac接种于种子培养基中，于28-30℃条件下培养12-24h，得到种子液；
(2)将步骤(1)的种子液按质量比5-10％的接种量转接到发酵培养基中，在28-30℃，压力0.1-0.2MPa，溶氧0.1％-20％条件下，培养48-96h，得发酵液；
(3)将步骤(2)的发酵液离心，上清液即为β-半乳糖苷酶粗酶液；
(4)将步骤(3)的粗酶液超滤浓缩、冷冻干燥得到β-半乳糖苷酶的粉末。
其中，所述步骤(1)中的种子培养基成分如下：酵母粉1-10g/L，蛋白胨1-20g/L，葡萄糖5-20g/L；所述步骤(2)中的发酵培养基成分如下：KH2PO4 5-20g/L，CaCl2 0.5-0.93g/L，MgSO4 1-15g/L，甘油5-20g/L，葡萄糖5-20g/L。
进一步的，所述(二)β-半乳糖苷酶催化乳糖合成低聚半乳糖，具体包括以下步骤：
(1)将冻干后的β-半乳糖苷酶粉末加入到浓度为200-450g/L的乳糖溶液中，得混合液；所述β-半乳糖苷酶的加入量为每克乳糖10-80U；
(2)将步骤(1)制得的混合液在30-45℃的条件下反应20-48h，得低聚半乳糖粗液。
进一步的，所述(三)通过马克斯克鲁维酵母纯化低聚半乳糖混合液具体为：指将培养好的马克斯克鲁维酵母湿菌体以质量比5-10％的接种量接入到灭酶活的低聚半乳糖粗液中，28-30℃培养12-24h，去除菌体后，上清液为高纯度的低聚半乳糖溶液。
其中，所述马克斯克鲁维酵母菌体培养方法具体为：将马克斯克鲁维酵母接种于种子培养基中，28-30℃培养12-20h后，然后以10-15％的接种量转接于乳糖培养基中，28-30℃培养48-96h，无菌条件下收集菌体。所述种子培养基采用酵母菌常用的培养基，如YPD液体培养基；所述乳糖培养基成分为，酵母粉1-10g/L，蛋白胨1-20g/L，乳糖5-20g/L。
进一步的，所述(四)精制低聚半乳糖混合液后得到高纯度的低聚半乳糖，具体为：将高纯度低聚半乳糖溶液旋蒸浓缩，脱色，醇沉，烘干，粉碎后得到高纯度低聚半乳糖粉末。
其中，所述的脱色是指用0.5-2％活性炭室温下对低聚半乳糖溶液进行脱色；所述的醇沉是指将脱色后的低聚半乳糖溶液，用3-5倍体积的工业酒精在高速搅拌下进行沉淀，并对得 到的沉淀用1-2倍工业酒精进行二次脱水；所述的烘干是指将醇沉后的沉淀于45-65℃下烘干。
本发明的有益效果：
1、利用毕赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac产β-半乳糖苷酶来催化合成GOS，收率达到30％以上。通过K.marxianus纯化GOS混合液，工业酒精沉淀浓缩后GOS溶液，得到了纯度为90％以上的GOS粉末，填补了我国高纯度GOS的生产空白，促进了GOS在食品中的应用，为社会带来巨大的经济效益。
2、由于GOS本身具有高粘度，通常的喷雾干燥法需要加入辅料如麦芽糊精等才能制得固态的GOS。相比而言，本发明公开的醇沉法工艺简单，GOS纯度与收率较高，提供了一条优化的生产工艺。
具体实施方式
为了更好的阐述本发明所提出的制备高纯度低聚半乳糖的方法，下面通过实施案例对其作进一步说明。
实施例1 毕赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac的构建与保藏
从亮白曲霉菌体中提取基因组，进而获得β-半乳糖苷酶基因，电泳进行验证；通过PCR扩增目的基因片段，进行双酶切后与质粒载体pGAPZaA相连，并转化大肠杆菌，转化成功后挑取单克隆，提取质粒后进行验证。培养转化成功的大肠杆菌，提取质粒，并进行线性化，然后将含有目的基因的线性化质粒电转化到毕赤酵母SMD1168H中，通过在培养基中添加X-gal，利用显色原理对有β-半乳糖苷酶活性的菌株进行筛选，选取颜色深的菌进行二次筛选；表达颜色深的重组毕赤酵母菌，对其发酵上清液测定β-半乳糖苷酶酶活，选取活性高的菌株，最终得到高产β-半乳糖苷酶的毕赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac。
该菌株于2013年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏编号为CGMCC No.8349。
实施例2
(1)10L发酵罐扩大培养毕赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac制备β-半乳糖苷酶：将保存于-80℃的毕赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac甘油管接入种子培养基中，30℃条件下培养16h后，得到种子液；然后以质量比10％的接种量接入到10L发酵罐中，调节pH至7.0，30℃，压力0.15Mpa，溶氧5-10％条件下培养72h，得到发酵液；发酵液10000r/min离心10min，收集上清即为β-半乳糖苷酶粗酶液。β-半乳糖苷酶粗酶液在4℃条件下通过10kDa的超滤膜浓缩10倍，将浓缩液冷冻干燥，得到75000U/g的β-半乳糖苷酶粉末。
其中，上述种子培养基成分如下：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖15g/L；发酵培养 基成分如下：KH2PO4 6g/L，CaCl2 0.7g/L，MgSO4 2g/L，甘油10g/L，葡萄糖15g/L。
(2)1L浓度为200g/L乳糖溶液中加入10U/g乳糖的β-半乳糖苷酶粉末，30℃的条件下，反应20h，得GOS粗液。经TLC及HPLC检测，其成分为少量的葡萄糖、半乳糖、大量未反应的乳糖及生成的GOS，其GOS含量为30％。
(3)K.marxianus甘油管接种于种子培养基中，30℃培养16h后以质量比12％的接种量转接于乳糖培养基中，30℃培养72h，无菌条件下收集菌体；所述乳糖培养基成分为，酵母粉8g/L，蛋白胨10g/L，乳糖10g/L。
(4)将制备的GOS混合液稀释2倍后，灭菌，pH调至7.0。将收集的K.marxianus湿菌体以质量比5％的添加量加入到灭菌的GOS混合液中，30℃培养12h，离心去除菌体。通过TLC及HPLC检测为不包含单糖和乳糖的高纯度的GOS溶液，纯度为90％。将得到的GOS溶液旋蒸浓缩后，加入0.5％的活性炭室温下脱色4h，抽滤去除活性炭，得到无色透明的GOS溶液。将其在高速搅拌下用3倍体积无水乙醇沉淀，并利用1倍体积无水乙醇二次脱水后，烘干，粉碎得到高纯度的GOS粉末，纯度为90％，收率为30％。
实施例3
(1)10L发酵罐扩大培养毕赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac制备β-半乳糖苷酶，发酵上清液浓缩后冷冻干燥制得β-半乳糖苷酶固体粉末，方法同实施例2中步骤⑴所述。
(2)以4L浓度为350g/L乳糖溶液为底物，加入40U/g乳糖的β-半乳糖苷酶粉末催化生成GOS，反应温度为37℃，反应时间为36h，得到GOS粗液；经TLC及HPLC检测，其成分为少量的葡萄糖、半乳糖、大量未反应的乳糖及生成的GOS，其GOS含量为32％。
(3)10L发酵罐扩大培养K.marxianus，培养方法同实施例2中步骤(3)所述；
(4)将处理好的GOS混合液打入酵母发酵罐中纯化，K.marxianus湿菌体接种量为7％，30℃培养18h。陶瓷膜过滤除菌后上清浓缩10倍，加入1％的活性炭室温下脱色2h，抽滤去除活性炭，得到无色透明的GOS溶液。高速搅拌下利用3倍工业酒精醇沉，2倍工业酒精二次脱水后，烘干，粉碎得到高纯度的GOS粉末，纯度为93％，收率为33％。
实施例4
(1)10L发酵罐扩大培养毕赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac制备β-半乳糖苷酶，发酵上清液浓缩后冷冻干燥制得β-半乳糖苷酶固体粉末，方法同实施例2中步骤⑴所述。
(2)以8L浓度为450g/L乳糖溶液为底物，加入80U/g乳糖的β-半乳糖苷酶粉末催化生成GOS，反应温度为45℃，反应时间为48h，得到GOS粗液；经TLC及HPLC检测，其成分为少量的葡萄糖、半乳糖、大量未反应的乳糖及生成的GOS，其GOS含量为33％；
(3)10L发酵罐扩大培养K.marxianus，培养方法同实施例2中步骤(3)所述；
(4)将处理好的待纯化的GOS混合液打入酵母发酵罐中纯化，K.marxianus湿菌体接种量为10％，30℃培养24h。陶瓷膜过滤除菌后上清浓缩10倍，加入2％的活性炭室温下脱色4h，抽滤去除活性炭，得到无色透明的GOS溶液。高速搅拌下利用5倍工业酒精醇沉，2倍工业酒精二次脱水后，烘干，粉碎得到高纯度的GOS粉末，纯度为95％，收率为33％。
以上是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明专利保护范围之内。

Claims (10)

1.一种产β-半乳糖苷酶菌株，其为毕赤酵母(pichia pastoris)SMD1168H-pGAZaA-lac，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.8349。
2.一种利用权利要求1所述的菌株制备高纯度低聚半乳糖的方法，其特征是，(一)利用毕赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac制备β-半乳糖苷酶；(二)β-半乳糖苷酶催化乳糖合成低聚半乳糖；(三)通过马克斯克鲁维酵母纯化低聚半乳糖混合液；(四)精制得到高纯度的低聚半乳糖。
3.如权利要求2所述的制备高纯度低聚半乳糖的方法，其特征是，所述步骤(一)具体包括以下步骤：
(1)将毕赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac接种于种子培养基中，于28-30℃条件下培养12-24h，得到种子液；
(2)将步骤(1)的种子液按质量比5-10％的接种量转接到发酵培养基中，在28-30℃，压力0.1-0.2MPa，溶氧0.1-20％条件下，培养48-96h，得发酵液；
(3)将步骤(2)的发酵液离心，上清液即为β-半乳糖苷酶粗酶液；
(4)将步骤(3)的粗酶液超滤浓缩、冷冻干燥得到β-半乳糖苷酶的粉末。
4.如权利要求3所述的制备高纯度低聚半乳糖的方法，其特征是，所述步骤(1)中的种子培养基成分如下：酵母粉1-10g/L，蛋白胨1-20g/L，葡萄糖5-20g/L；所述步骤(2)中的发酵培养基成分如下：KH2PO45-20g/L，CaCl20.5-0.93g/L，MgSO41-15g/L，甘油5-20g/L，葡萄糖5-20g/L。
5.如权利要求2所述的制备高纯度低聚半乳糖的方法，其特征是，所述步骤(二)具体包括以下步骤：
(1)将β-半乳糖苷酶加入到浓度为200-450g/L的乳糖溶液中，得混合液；所述β-半乳糖苷酶的加入量为每克乳糖10-80U；
(2)将步骤(1)制得的混合液在30-45℃的条件下反应20-48h，得低聚半乳糖粗液。
6.如权利要求5所述的制备高纯度低聚半乳糖的方法，其特征是，所述步骤(三)具体为：将培养好的马克斯克鲁维酵母湿菌体以质量比5-10％的接种量接入到灭酶活的低聚半乳糖粗液中，28-30℃培养12-24h，去除菌体后，上清液为高纯度的低聚半乳糖溶液。
7.如权利要求6所述的所述制备高纯度低聚半乳糖的方法，其特征是，所述马克斯克鲁维酵母湿菌体培养方法具体为：将马克斯克鲁维酵母接种于种子培养基中，28-30℃培养12-20h后，然后以10-15％的接种量转接于乳糖培养基中，28-30℃培养48-96h，无菌条件下收集菌体；所述乳糖培养基成分为，酵母粉1-10g/L，蛋白胨1-20g/L，乳糖5-20g/L。
8.如权利要求5-7中任意一项所述的制备高纯度低聚半乳糖的方法，其特征是，所述步骤(四)具体为：将高纯度低聚半乳糖溶液旋蒸浓缩，脱色，醇沉，烘干，粉碎后得到高纯度低聚半乳糖粉末。
9.如权利要求8所述的制备高纯度低聚半乳糖的方法，其特征是，所述的醇沉是指将脱色后的低聚半乳糖溶液，用3-5倍体积的工业酒精在高速搅拌下进行沉淀，并对得到的沉淀用1-2倍工业酒精进行二次脱水。
10.如权利要求8所述的制备高纯度低聚半乳糖的方法，其特征是，所述的脱色是指用0.5-2％活性炭室温下对低聚半乳糖溶液进行脱色；所述的烘干是指将醇沉后的沉淀于45-65℃下烘干。
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