CN105268415A - 一种固相萃取填料及其在测定食品中磺胺残留的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固相萃取填料及其在测定食品中磺胺残留的应用。首先将多孔硅胶与盐酸溶液反应，处理后得到活化硅胶；然后与氨丙基三乙氧基硅烷、无水甲苯反应，处理后得到氨丙基三乙氧基硅烷键合硅胶；接着与二茂铁、无水苯和乙酸汞甲醇溶液反应，然后加入氯化锂乙醇溶液再次进行反应，处理后得到单取代氯化汞基二茂铁；接着与4,6-二氯嘧啶、碘化钠和四（三苯基磷）钯反应，处理后得到4-氯-6-嘧啶基二茂铁；所得产物与氨丙基硅胶、无水碳酸钾和二异丙基乙基胺反应，处理后得到本发明产品。本发明产品是一种新型官能团化二茂铁键合硅胶固相萃取填料，利用该填料对基质进行样品前处理，同时结合高效液相色谱法检测食品中磺胺类药物残留。

Description

一种固相萃取填料及其在测定食品中磺胺残留的应用

一、技术领域：

本发明属于化学检测技术领域，具体涉及一种新型固相萃取填料（4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶）及其在测定食品中磺胺残留的应用。

二、背景技术：

随着分离科学的发展，高效液相色谱以其高灵敏度、高选择性、高柱效、重复性好和操作简便等特点，在石油、化工、环保、食品、医药、法检、临床和天然产物分析中，扮演着非常重要的角色，成为分离复杂样品的一项重要技术。除检测手段外，另一个影响分析检测结果准确性和可靠性的重要因素就是样品前处理，尤其是对于含量低、组成复杂的样品基质，如：食品中脂肪的含量高、干扰物质多；环境水体中成分复杂、残留浓度低、环境复杂多变；样品处理的好坏等都直接影响检测的结果。在使用高效液相色谱法时，往往采用正己烷脱脂对样品进行纯化，但因为净化步骤过于简单，使得其在分析动物源性食品（特别是内脏等复杂基质）时的净化效果不甚理想。

固相萃取是一个液固两相间的物理萃取过程。固相萃取过程中，由于固相吸附剂对目标物的作用力比目标物在溶剂中的溶解能力大，当样品溶液通过固相萃取柱时，目标物在固相吸附剂表面富集，而其它成分顺着溶液流了下去，这样只吸附目标物而不吸附其它成分，使目标物的纯度更高、浓度更大，很容易进行分析。

近些年来，食品安全往往能引起人们格外的关注。动物源性食物中的药残问题更是人们关注的热点。目前，磺胺类药物样品的前处理一般多用固相萃取法，现有技术中采用的固相萃取填料对样品进行前处理，其效果不甚理想。

三、发明内容：

本发明要解决的技术问题是：根据食品中磺胺残留现有检测技术中样品前处理存在的不足之处，本发明提供一种固相萃取填料（4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶）及其在测定食品中磺胺残留的应用。即本发明研究了一种新型的官能团化二茂铁键合硅胶固相萃取填料，利用该固相萃取填料对基质进行样品前处理，同时结合高效液相色谱法检测食品中磺胺类药物残留。本发明联用技术，在动物源性食品中磺胺类药物残留的检测中的应用，大大提高了磺胺类药残的检测灵敏度，简化了实验操作程序，为磺胺类药物残留的检测起到显著作用。

为了解决上述问题，本发明采取的技术方案为：

本发明提供一种新型固相萃取填料，所述固相萃取填料是通过以下方法制备而成：

1）硅胶的活化：称取多孔硅胶浸入盐酸溶液中进行浸泡，浸泡时间为22～26h，浸泡后进行搅拌加热，加热至90～100℃条件下回流反应20～24h，反应除去金属离子，所得反应液进行过滤，过滤后反复洗涤至中性，所得产物进行干燥脱水，干燥后得到活化硅胶，储于干燥器中备用；

2）氨丙基三乙氧基硅烷键合硅胶的制备：称取氨丙基三乙氧基硅烷于反应器中，并加入无水甲苯进行搅拌，在搅拌下加入步骤1）所得活化硅胶，在氮气保护下加热至110～120℃下回流反应20～24h，反应结束后所得产物进行抽滤，然后依次采用甲苯、丙酮和二次蒸馏水进行洗涤，洗涤后所得产物进行真空干燥，得到氨丙基三乙氧基硅烷键合硅胶；

所述氨丙基三乙氧基硅烷与无水甲苯二者加入的体积比为1：9～10，所述活化硅胶与氨丙基三乙氧基硅烷二者加入量的比例为1g：1.3～1.6mL；

3）单取代氯化汞基二茂铁的制备：首先称取二茂铁和无水苯置于反应器中，所述二茂铁与无水苯二者加入量的比例为1g：4～5mL，然后逐滴加入乙酸汞甲醇溶液，所述乙酸汞甲醇溶液与二茂铁之间加入量的比例为6～7mL：1g，加入后在氮气保护下、升温至65～80℃反应10～12h，反应后得到反应液；

将无水氯化锂溶于乙醇水溶液中，充分溶解后得到氯化锂乙醇溶液，将氯化锂乙醇溶液逐滴加入所得反应液中，氯化锂乙醇溶液与反应液之间加入量的体积比例为1：6.5～7，在室温条件下搅拌2～3h，然后加热至65～80℃下回流反应1～1.5h，反应后进行冷却、过滤；所得固体置于索氏提取器中，先用石油醚提取未反应的二茂铁，然后用二氯甲烷提取产物单取代氯化汞基二茂铁，蒸出溶剂得到黄色固体，即为单取代氯化汞基二茂铁；

4）4-氯-6-嘧啶基二茂铁的制备：首先按照摩尔比为1：1.1～1.2：2：0.05的比例称取所得单取代氯化汞基二茂铁、4,6-二氯嘧啶、碘化钠和四（三苯基磷）钯，将称取的四种原料加入到无水四氢呋喃和无水丙酮的混合液中；所述单取代氯化汞基二茂铁、4,6-二氯嘧啶、碘化钠和四（三苯基磷）钯四种原料与混合液二者之间加入量的比例为1 mol：1.1～1.2 mol：2 mol：0.05mol：30～35mL，加入后油浴加热至70～80℃，在氮气保护下反应6～7h；

反应结束后用水冷却，有机层被分开，水层用二氯甲烷萃取，然后合并有机层，所得有机层采用无水硫酸镁干燥、过滤，过滤后旋蒸除去溶剂；然后过硅胶层析柱收集第二部分产物，即得4-氯-6-嘧啶基二茂铁；

5) 4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶固相萃取填料的合成：称取氨丙基硅胶、4-氯-6-嘧啶基二茂铁、无水碳酸钾和二异丙基乙基胺，四种原料之间的加入量比例为2～2.5g:1g:1.5g:12～13mL，然后加入到四氢呋喃中，四种原料与四氢呋喃之间加入量的比例2～2.5g:1.0g:1.5g:12～13mL:100mL，在氮气条件下加热至65～70℃回流反应48～50小时；反应结束后对所得反应物进行过滤，所得产物依次用二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、水和丙酮各洗三次，所得产品进行真空干燥，干燥后得到产品固相萃取填料。

根据上述的新型固相萃取填料，步骤1）中所述多孔硅胶是由中国科学院兰州化学物理研究所提供，多孔硅胶的粒径为40～63μm，孔径为60 Å，比表面积为500 m²/g。

根据上述的新型固相萃取填料，步骤1）中所述多孔硅胶与盐酸溶液二者加入量的比例为1g：25～30mL；所述盐酸溶液是由HCl与H₂O 按照体积比为1:3配制而成。

根据上述的新型固相萃取填料，步骤1）中所述反应液进行过滤时采用G5砂芯漏斗；所述洗涤时采用二次蒸馏水；所述干燥脱水是在160℃下干燥10h脱去表面水。

根据上述的新型固相萃取填料，步骤2）中抽滤时采用G5砂芯漏斗；所述真空干燥是在真空度为0.1MPa、80℃下干燥24h。

根据上述的新型固相萃取填料，步骤3）中所述乙酸汞甲醇溶液是由乙酸汞与无水甲醇按照1g：5～6mL的比例配制而成。

根据上述的新型固相萃取填料，步骤3）中所述无水氯化锂溶于乙醇水溶液，其无水氯化锂与乙醇水溶液二者加入量的比例为1g：6～8mL；所述乙醇水溶液是由乙醇与水按照1：1的体积比配制而成。

根据上述的新型固相萃取填料，步骤4）中所述无水四氢呋喃和无水丙酮的混合液，二者混合时无水四氢呋喃和无水丙酮的混合体积比为1.5～1.6：1；所述过硅胶层析柱时，采用的洗脱剂为二氯甲烷和石油醚按照体积比2：1混合所得的混合液。

根据上述的新型固相萃取填料，步骤5）中所述对所得反应物进行过滤时采用G5砂芯漏斗；所述真空干燥是在真空度为0.1MPa、65℃下干燥12h。

本发明新型固相萃取填料4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶的化学反应式如下：

本发明制备得到的固相萃取填料4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶固定相的结构式为：

另外，本发明提供一种新型固相萃取填料在测定食品中磺胺残留的应用。

本发明的积极有益效果：

利用本发明技术方案制备的固相萃取填料4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶具有以下优点：

1、利用本发明所制备的固相萃取填料装成的固相萃取小柱具有强大的吸附功能、较强的特异性、回收率高和较低的制备成本等优点。

2、使用本发明固相萃取填料装成的固相萃取小柱对化学样品进行前处理，能够实现高效的分离结果，而且洗脱试剂为纯水，符合环保的理念，符合国家环保的要求。

3、本发明固相萃取填料制备方法简单，应用广泛，重现性好，具有很好的应用前景。

4、本发明实现了对磺胺组分的同时富集，一根柱子即可完成净化目的，摆脱了不同作用模式多根柱子连用的所造成的耗时长、目标组分损失大的缺陷，也实现了同时洗脱、同时检测的目标。

四、附图说明：

图1 为实施例1中中间产物活化硅胶的红外光谱图。

图2 为实施例1中中间产物氨丙基三乙氧基硅烷键合硅胶的红外光谱图。

图3 为实施例1中所得产品4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶的红外光谱图。

图4 应用实例中高效液相色谱法分析流程示意图；

图5 应用实例中高效液相色谱条件下三种磺胺分离色谱图；

图5中：显示磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺间二甲氧基嘧啶(SDM)在较短时间内实现了基线分离，分离度良好，峰形对称，为磺胺的检测提供方便。

图6 应用实例中固相萃取材料用量优化示意图；

图7 应用实例中洗脱剂种类优化示意图；

图8 应用实例中洗脱剂体积用量优化示意图；

图9 应用实例中上样速度优化示意图；

图10 应用实例中猪肉空白过固相萃取小柱净化与不净化对照图；

图10中：A为没有经过净化的猪肉空白；B 经过净化的猪肉空白。

图11 本发明固相萃取小柱与现有固相萃取小柱净化效果对照图；

图11中，A：本发明固相萃取小柱净化富集效果图；B：NH2柱净化富集效果图；C：MCX柱净化富集图。

图12 应用实例猪肉中磺胺类药物残留检测的分析图谱；

图12中：通过加标实验，确定了猪肉中所含的磺胺类药物残留为磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺间二甲氧基嘧啶(SDM)；通过本发明固相萃取柱净化后的杂质峰，其峰高变低，更有利于目标组分的定量分析于检测。

图12中：A为加标10ppm，B为加标5ppm，C为加标0.5ppm，D为实际猪肉样品；1为磺胺二甲嘧啶；2为磺胺甲恶唑；3为磺胺间二甲氧基嘧啶。

五、具体实施方式：

以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1：

本发明固相萃取填料4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶，是通过以下方法制备而成，详细步骤如下：

1）硅胶的活化：称取20g多孔硅胶（多孔硅胶的粒径为40～63μm，孔径60Å，比表面积500m²/g，由中国科学院兰州化学物理研究所提供生产）浸入500mL盐酸溶液中（盐酸溶液是按照HCl：H₂O 的体积比1:3配制而成）中浸泡24h，然后磁力搅拌下进行加热，加热至95℃条件下回流反应24h，除去金属离子；所得反应液采用G5砂芯漏斗过滤，过滤后所得产物用二次蒸馏水反复洗至中性，然后对所得产物在160℃下干燥10h脱去表面水，即得活化硅胶（其红外光谱图详见附图1），储于干燥器中备用；

2）氨丙基三乙氧基硅烷键合硅胶的制备：取12mL氨丙基三乙氧基硅烷于250mL三口瓶中，加入新蒸的无水甲苯115mL，搅拌下加入9g活化硅胶；在氮气保护下加热至115℃回流反应24h；反应结束后，用G5砂芯漏斗抽滤，所得产物依次用甲苯、丙酮和二次蒸馏水各洗涤三次，洗涤后所得产物进行真空干燥（真空度为0.1MPa、干燥温度为80℃，干燥时间为24h），得到氨丙基三乙氧基硅烷键合硅胶（其红外光谱图详见附图2）；

3）单取代氯化汞基二茂铁的制备：称取3.12g Hg(CH₃COO)₂溶解在17mL无水甲醇中，然后在搅拌条件下逐滴加入到2.5g二茂铁和10mL的无水苯中，在氮气保护下升温至70℃反应10h；然后将0.6g的无水氯化锂溶于4mL乙醇水溶液中（乙醇水溶液是由乙醇和水按照1:1的体积比配制而成），所得氯化锂乙醇溶液逐滴加入上述反应体系中，产生橙色悬浮物时在室温下搅拌2h，然后加热至80℃回流反应1h；反应进行冷却，冷却后所得反应物抽滤，收集析出的固体，将该固体转移至索氏提取器，先用石油醚提取未反应的二茂铁，然后用二氯甲烷提取单取代的氯化汞基二茂铁，蒸出溶剂得黄色固体，即为单取代氯化汞基二茂铁；

4）4-氯-6-嘧啶基二茂铁的制备：称取1mmol单取代氯化汞基二茂铁、1.1mmol 4,6-二氯嘧啶、2mmol碘化钠和0.05mmol四（三苯基磷）钯加入到18mL无水四氢呋喃和12mL无水丙酮中，置于油浴中加热到80℃，在氮气保护下反应6h；反应结束后用水冷却，有机层被分开了，水层用二氯甲烷萃取，然后合并有机层，所得有几层用无水硫酸镁干燥、过滤，旋蒸除去溶剂；所得产物过硅胶层析柱分离（采用的洗脱剂为二氯甲烷和石油醚按照体积比2：1配制的混合液），收集第二部分产物即为4-氯-6-嘧啶基二茂铁；

5) 4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶固相萃取填料的合成：称取2.0g氨丙基硅胶、1.0g 4-氯-6-嘧啶基二茂铁、1.5g无水碳酸钾和12mL二异丙基乙基胺（缚酸剂）加入到100mL四氢呋喃中，在氮气条件下加热至65℃回流反应48小时，反应结束后用G5砂芯漏斗过滤，所得产物依次用二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、水、丙酮各洗三次，洗涤后所得产品在真空度0.1MPa、65℃下干燥12h，得到产品4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶固相萃取填料（红外光谱图分析详见附图3）。

由附图2、3所示的氨丙基三乙氧基硅烷键合硅胶和4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶固相萃取的元素分析，详见表1。

从表1和附图1、附图2和附图3结果可以得出：4-氯-6-嘧啶基二茂铁已被成功键合到硅胶表面，根据碳含量计算出键合量为0.30mmol g^-1。

实施例2：

本发明固相萃取填料4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶，是通过以下方法制备而成，详细步骤如下：

1）硅胶的活化：称取20g多孔硅胶（多孔硅胶的粒径为40～63μm，孔径60Å，比表面积500m²/g，由中国科学院兰州化学物理研究所提供生产）浸入500mL盐酸溶液中（盐酸溶液是按照HCl：H₂O 的体积比1:3配制而成）中浸泡22h，然后磁力搅拌下进行加热，加热至100℃条件下回流反应20h，除去金属离子；所得反应液采用G5砂芯漏斗过滤，过滤后所得产物用二次蒸馏水反复洗至中性，然后对所得产物在160℃下干燥10h脱去表面水，即得活化硅胶，储于干燥器中备用；

2）氨丙基三乙氧基硅烷键合硅胶的制备：取10mL氨丙基三乙氧基硅烷于250mL三口瓶中，加入新蒸的无水甲苯95mL，搅拌下加入6g活化硅胶；在氮气保护下加热至120℃回流反应20h；反应结束后，用G5砂芯漏斗抽滤，所得产物依次用甲苯、丙酮和二次蒸馏水各洗涤三次，洗涤后所得产物进行真空干燥（真空度为0.1MPa、干燥温度为80℃，干燥时间为24h），得到氨丙基三乙氧基硅烷键合硅胶；

3）单取代氯化汞基二茂铁的制备：称取3.12g Hg(CH₃COO)₂溶解在15.6mL无水甲醇中，然后在搅拌条件下逐滴加入到2.5g二茂铁和12.5mL的无水苯中，在氮气保护下升温至68℃反应11h；然后将0.6g的无水氯化锂溶于4.5mL乙醇水溶液中（乙醇水溶液是由乙醇和水按照1:1的体积比配制而成），所得氯化锂乙醇溶液逐滴加入上述反应体系中，产生橙色悬浮物时在室温下搅拌2.5h，然后加热至75℃回流反应1.2h；反应进行冷却，冷却后所得反应物抽滤，收集析出的固体，将该固体转移至索氏提取器，先用石油醚提取未反应的二茂铁，然后用二氯甲烷提取单取代的氯化汞基二茂铁，蒸出溶剂得黄色固体，即为单取代氯化汞基二茂铁；

4）4-氯-6-嘧啶基二茂铁的制备：称取1mmol单取代氯化汞基二茂铁、1.15mmol 4,6-二氯嘧啶、2mmol碘化钠和0.05mmol四（三苯基磷）钯加入到18mL无水四氢呋喃和14mL无水丙酮中，置于油浴中加热到75℃，在氮气保护下反应6.5h；反应结束后用水冷却，有机层被分开了，水层用二氯甲烷萃取，然后合并有机层，所得有几层用无水硫酸镁干燥、过滤，旋蒸除去溶剂；所得产物过硅胶层析柱分离（采用的洗脱剂为二氯甲烷和石油醚按照体积比2：1配制的混合液），收集第二部分产物即为4-氯-6-嘧啶基二茂铁；

5) 4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶固相萃取填料的合成：称取2.20g氨丙基硅胶、1.0g 4-氯-6-嘧啶基二茂铁、1.5g无水碳酸钾和12.5mL二异丙基乙基胺（缚酸剂）加入到100mL四氢呋喃中，在氮气条件下加热至70℃回流反应49小时，反应结束后用G5砂芯漏斗过滤，所得产物依次用二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、水、丙酮各洗三次，洗涤后所得产品在真空度0.1MPa、65℃下干燥12h，得到产品4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶固相萃取填料。

实施例3：

本发明固相萃取填料4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶，是通过以下方法制备而成，详细步骤如下：

1）硅胶的活化：称取20g多孔硅胶（多孔硅胶的粒径为40～63μm，孔径60Å，比表面积500m²/g，由中国科学院兰州化学物理研究所提供生产）浸入500mL盐酸溶液中（盐酸溶液是按照HCl：H₂O 的体积比1:3配制而成）中浸泡26h，然后磁力搅拌下进行加热，加热至90℃条件下回流反应22h，除去金属离子；所得反应液采用G5砂芯漏斗过滤，过滤后所得产物用二次蒸馏水反复洗至中性，然后对所得产物在160℃下干燥10h脱去表面水，即得活化硅胶，储于干燥器中备用；

2）氨丙基三乙氧基硅烷键合硅胶的制备：取10mL氨丙基三乙氧基硅烷于250mL三口瓶中，加入新蒸的无水甲苯90mL，搅拌下加入7g活化硅胶；在氮气保护下加热至110℃回流反应22h；反应结束后，用G5砂芯漏斗抽滤，所得产物依次用甲苯、丙酮和二次蒸馏水各洗涤三次，洗涤后所得产物进行真空干燥（真空度为0.1MPa、干燥温度为80℃，干燥时间为24h），得到氨丙基三乙氧基硅烷键合硅胶；

3）单取代氯化汞基二茂铁的制备：称取3.12g Hg(CH₃COO)₂溶解在16mL无水甲醇中，然后在搅拌条件下逐滴加入到2.5g二茂铁和11mL的无水苯中，在氮气保护下升温至65℃反应12h；然后将0.6g的无水氯化锂溶于4.8mL乙醇水溶液中（乙醇水溶液是由乙醇和水按照1:1的体积比配制而成），所得氯化锂乙醇溶液逐滴加入上述反应体系中，产生橙色悬浮物时在室温下搅拌3h，然后加热至65℃回流反应1.5h；反应进行冷却，冷却后所得反应物抽滤，收集析出的固体，将该固体转移至索氏提取器，先用石油醚提取未反应的二茂铁，然后用二氯甲烷提取单取代的氯化汞基二茂铁，蒸出溶剂得黄色固体，即为单取代氯化汞基二茂铁；

4）4-氯-6-嘧啶基二茂铁的制备：称取1mmol单取代氯化汞基二茂铁、1.2mmol 4,6-二氯嘧啶、2mmol碘化钠和0.05mmol四（三苯基磷）钯加入到18mL无水四氢呋喃和13mL无水丙酮中，置于油浴中加热到70℃，在氮气保护下反应7.0h；反应结束后用水冷却，有机层被分开了，水层用二氯甲烷萃取，然后合并有机层，所得有几层用无水硫酸镁干燥、过滤，旋蒸除去溶剂；所得产物过硅胶层析柱分离（采用的洗脱剂为二氯甲烷和石油醚按照体积比2：1配制的混合液），收集第二部分产物即为4-氯-6-嘧啶基二茂铁；

5) 4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶固相萃取填料的合成：称取2.50g氨丙基硅胶、1.0g 4-氯-6-嘧啶基二茂铁、1.5g无水碳酸钾和13mL二异丙基乙基胺（缚酸剂）加入到100mL四氢呋喃中，在氮气条件下加热至65℃回流反应50小时，反应结束后用G5砂芯漏斗过滤，所得产物依次用二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、水、丙酮各洗三次，洗涤后所得产品在真空度0.1MPa、65℃下干燥12h，得到产品4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶固相萃取填料。

本发明固相萃取填料在测定食品中磺胺残留的应用实例：

本发明固相萃取填料在检测猪肉中磺胺含量的应用：

1）、固相萃取小柱的装填：

将市售的聚丙烯空柱管（规格为100mg/3cc，迪马科技有限公司生产）先用水和甲醇清洗；在柱管底部填入聚丙烯筛板，准确称取100mg（精确到0.001 g）本发明制备的固相萃取填料4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶；适度振实、振平后，在填料上端填入聚丙烯筛板，适度压实，得到装填好的固相萃取小柱，备用；

2）固相萃取过程和液相条件：

将装填好的固相萃取小柱悬直置于试管架上，用4mL乙腈活化、4mL水平衡，然后用移液管加入1mL处理过的样品；上样后，用3mL乙腈淋洗、6mL超纯水洗脱；将洗脱液收集至离心管中，用注射器吸取1mL溶液，过0.22 mm滤膜，所得滤液供HPLC分析，分析流程示意图详见附图4。

高效液相色谱条件：C18柱液相色谱柱（VP ODS，5μm，4.6mm×150mm），流动相为甲醇-0.1%冰乙酸水溶液（30:70，v/v），检测波长为270 nm，流速1mL/min，柱温为30℃；该液相条件下，三种磺胺的分离色谱图详见附图5。

3）固相萃取条件的优化：

影响固相萃取回收率的重要因素包括：固相萃取材料用量、洗脱剂种类、洗脱剂体积和上样速度等。实验以三种药物的回收率作为依据，分别对上述几种影响因素进行了优化，得到最佳的固相萃取处理条件。具体优化过程如下：

固相萃取材料用量的选择：

吸附剂用量会影响固相萃取效果，因此本发明讨论了不同吸附剂用量下三种磺胺类药物的回收率。实验取4个聚丙烯空柱管，分别用质量为50mg、100mg、150mg、200mg的本发明固相萃取填料制成固相萃取小柱，经4mL甲醇活化、4mL水平衡后上样1mL，然后用3mL乙腈淋洗、4mL超纯水洗脱，收集洗脱液；洗脱液经HPLC分析发现，当固相萃取填料量为100mg时，三种磺胺类药物的回收率最高（回收率情况分析详见附图6）。因此，最佳固相萃取材料用量为100mg。

洗脱剂种类的选择：

洗脱剂种类是影响样品前处理效果的重要因素之一。根据三种磺胺类药物的理化性质，实验采用三种磺胺类药物标准液对洗脱剂种类进行了优化。具体操作如下：取制备好的固相萃取小柱5个，经4mL甲醇活化、4mL 水平衡后上样1mL，然后用3mL乙腈淋洗，最后分别用4mL乙酸乙酯、4mL正丙醇、4mL丙酮、4mL水和4mL乙醇洗脱。然后进液相色谱仪检测，研究结果发现，除了水与丙酮外，其它试剂几乎没有回收出磺胺类药物，且使用水作为洗脱剂时三种磺胺类药物的回收率最高。因此，选用水作为洗脱剂（洗脱剂优化示意图详见附图7）。

洗脱剂体积的选择：

洗脱剂体积，是影响固相萃取回收率的又一因素。实验采用三种磺胺类药物标准溶液，对洗脱剂体积进行了优化，具体操作如下：取制备好的固相萃取小柱5个，经4mL甲醇活化、4mL水平衡后上样1mL，用3mL乙腈淋洗后，分别用2mL、3mL、5mL、6mL和8mL水进行洗脱，收集洗脱液。将洗脱液进液相色谱仪检测。研究结果发现，在1-6mL范围内，随着洗脱剂体积的增加，三种磺胺类药物的回收率逐渐升高，6mL之后回收率无明显增加，故选择6mL作为洗脱剂体积（洗脱剂体积优化示意图详见附图8）。

上样流速的选择：

上样流速对固相萃取回收率也存在着明显的影响。流速过大时，会造成回收率降低；而流速过低时，会造成分析效率降低，耗费较大劳动力。为了得到最佳的回收率和最低的人力财力投入，本发明对固相萃取上样流速也进行了优化。分别采用90s/mL、60s/mL、30s/mL、20s/mL的流速进行上样，结果分析如附图9所示。在20s/mL～30s/mL的范围内三种磺胺类药物的回收率都增加，而60s/mL～90 s/mL的范围内三种磺胺类药物的回收率明显下降。综合考虑药残回收率和操作时间的双重影响，最终选定30s/mL作为最佳上样流速。

综上所述，固相萃取条件为：本发明产品官能团化二茂铁键合硅胶固相萃取吸附剂用量为100mg，洗脱剂为6mL水，上样流速为30 s/mL。

在最佳条件下将处理好的空白猪肉样品分别过固相萃取小柱净化与不过柱子做对照；如附图10所示，经过固相萃取小柱的猪肉样品杂质峰明显减弱，有助于目标组分的分析于定量。

将本发明上述制备好的固相萃取小柱与商品化的固相萃取小柱做对照，将6份加标5ppm的猪肉实际样品分别经过C18、HLB、NH2、MAX、MCX以及本发明固相萃取柱进行净化处理，所得液相图谱分析详见附图11。由附图11可以看出本发明固相萃取柱的回收率最高，虽然处理没NH2柱干净，但并不影响后面目标组分的测定，而且本发明固相萃取柱要比NH2柱对SM2的回收率要高。因C18、HLB和MAX柱没有富集到目标组分，没在图上显示。

）猪肉中磺胺的检测：

方法的标准曲线：

将储备溶液（分别将0.1g SM2、0.1g SMZ、0.1g SDM标品溶于100mL甲醇中定容，所得溶液备用，磺胺标品来自河南省畜牧局）逐级稀释并绘制标准曲线，将配制的标准工作溶液由低到高浓度进入液相色谱仪。以各标准物质的峰面积（Y）对相应的浓度(X，ug/mL)进行线性回归分析，得到三种磺胺类物质的工作曲线回归方程和相关系数r（详见表2）。将各物质最低浓度的标准工作溶液重复进样5次，计算标准偏差，以3倍信噪比为方法的检出限，10倍信噪比为定量限。结果如表2所示，在0.01μg/mL～10μg/mL的线性动态范围内混合物组分的线性相关系数较好，表明该方法线性关系良好。

猪肉中磺胺类药物残留的的检测：

猪肉样品经过样品前处理，获得基质中三种磺胺类药物残留的提取液；经过固相萃取处理（按照常规方法操作），对提取液、加标提取液进行净化以及富集，获得洗脱液；最后将洗脱液进行高效液相色谱法操作后，即可得到猪肉中磺胺类药物残留检测的分析图谱（详见附图12）。

猪肉中磺胺类药物残留的的检测的加标回收率及检出限和定量线，详见表3。

表3 猪肉中磺胺类药物残留的的检测的加标回收率

从表3可以看出，利用本发明固相萃取柱进行处理，其回收率较好，相对标准偏差较小，成本低，有很好的应用前景。

本发明实施例2、3制得的固相萃取填料在测定食品中磺胺残留的应用实例与实施例1完全一致。

Claims (10)

1. 一种新型固相萃取填料，其特征在于，所述固相萃取填料是通过以下方法制备而成：

1）硅胶的活化：称取多孔硅胶浸入盐酸溶液中进行浸泡，浸泡时间为22～26h，浸泡后进行搅拌加热，加热至90～100℃条件下回流反应20～24h，反应除去金属离子，所得反应液进行过滤，过滤后反复洗涤至中性，所得产物进行干燥脱水，干燥后得到活化硅胶，储于干燥器中备用；

2）氨丙基三乙氧基硅烷键合硅胶的制备：称取氨丙基三乙氧基硅烷于反应器中，并加入无水甲苯进行搅拌，在搅拌下加入步骤1）所得活化硅胶，在氮气保护下加热至110～120℃下回流反应20～24h，反应结束后所得产物进行抽滤，然后依次采用甲苯、丙酮和二次蒸馏水进行洗涤，洗涤后所得产物进行真空干燥，得到氨丙基三乙氧基硅烷键合硅胶；

所述氨丙基三乙氧基硅烷与无水甲苯二者加入的体积比为1：9～10，所述活化硅胶与氨丙基三乙氧基硅烷二者加入量的比例为1g：1.3～1.6mL；

3）单取代氯化汞基二茂铁的制备：首先称取二茂铁和无水苯置于反应器中，所述二茂铁与无水苯二者加入量的比例为1g：4～5mL，然后逐滴加入乙酸汞甲醇溶液，所述乙酸汞甲醇溶液与二茂铁之间加入量的比例为6～7mL：1g，加入后在氮气保护下、升温至65～80℃反应10～12h，反应后得到反应液；

将无水氯化锂溶于乙醇水溶液中，充分溶解后得到氯化锂乙醇溶液，将氯化锂乙醇溶液逐滴加入所得反应液中，氯化锂乙醇溶液与反应液之间加入量的体积比例为1：6.5～7，在室温条件下搅拌2～3h，然后加热至65～80℃下回流反应1～1.5h，反应后进行冷却、过滤；所得固体置于索氏提取器中，先用石油醚提取未反应的二茂铁，然后用二氯甲烷提取产物单取代氯化汞基二茂铁，蒸出溶剂得到黄色固体，即为单取代氯化汞基二茂铁；

4）4-氯-6-嘧啶基二茂铁的制备：首先按照摩尔比为1：1.1～1.2：2：0.05的比例称取所得单取代氯化汞基二茂铁、4,6-二氯嘧啶、碘化钠和四（三苯基磷）钯，将称取的四种原料加入到无水四氢呋喃和无水丙酮的混合液中；所述单取代氯化汞基二茂铁、4,6-二氯嘧啶、碘化钠和四（三苯基磷）钯四种原料与混合液二者之间加入量的比例为1 mol：1.1～1.2 mol：2 mol：0.05mol：30～35mL，加入后油浴加热至70～80℃，在氮气保护下反应6～7h；

反应结束后用水冷却，有机层被分开，水层用二氯甲烷萃取，然后合并有机层，所得有机层采用无水硫酸镁干燥、过滤，过滤后旋蒸除去溶剂；然后过硅胶层析柱收集第二部分产物，即得4-氯-6-嘧啶基二茂铁；

5) 4-氯-6-嘧啶基二茂铁键合硅胶固相萃取填料的合成：称取氨丙基硅胶、4-氯-6-嘧啶基二茂铁、无水碳酸钾和二异丙基乙基胺，四种原料之间的加入量比例为2～2.5g:1g:1.5g:12～13mL，然后加入到四氢呋喃中，四种原料与四氢呋喃之间加入量的比例2～2.5g:1.0g:1.5g:12～13mL:100mL，在氮气条件下加热至65～70℃回流反应48～50小时；反应结束后对所得反应物进行过滤，所得产物依次用二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、水和丙酮各洗三次，所得产品进行真空干燥，干燥后得到产品固相萃取填料。

2.根据权利要求1所述的新型固相萃取填料，其特征在于：步骤1）中所述多孔硅胶是由中国科学院兰州化学物理研究所提供，多孔硅胶的粒径为40～63μm，孔径为60 Å，比表面积为500 m²/g。

3.根据权利要求1所述的新型固相萃取填料，其特征在于：步骤1）中所述多孔硅胶与盐酸溶液二者加入量的比例为1g：25～30mL；所述盐酸溶液是由HCl与H₂O 按照体积比为1:3配制而成。

4.根据权利要求1所述的新型固相萃取填料，其特征在于：步骤1）中所述反应液进行过滤时采用G5砂芯漏斗；所述洗涤时采用二次蒸馏水；所述干燥脱水是在160℃下干燥10h脱去表面水。

5.根据权利要求1所述的新型固相萃取填料，其特征在于：步骤2）中抽滤时采用G5砂芯漏斗；所述真空干燥是在真空度为0.1MPa、80℃下干燥24h。

6.根据权利要求1所述的新型固相萃取填料，其特征在于：步骤3）中所述乙酸汞甲醇溶液是由乙酸汞与无水甲醇按照1g：5～6mL的比例配制而成。

7.根据权利要求1所述的新型固相萃取填料，其特征在于：步骤3）中所述无水氯化锂溶于乙醇水溶液，其无水氯化锂与乙醇水溶液二者加入量的比例为1g：6～8mL；所述乙醇水溶液是由乙醇与水按照1：1的体积比配制而成。

8.根据权利要求1所述的新型固相萃取填料，其特征在于：步骤4）中所述无水四氢呋喃和无水丙酮的混合液，二者混合时无水四氢呋喃和无水丙酮的混合体积比为1.5～1.6：1；所述过硅胶层析柱时，采用的洗脱剂为二氯甲烷和石油醚按照体积比2：1混合所得的混合液。

9.根据权利要求1所述的新型固相萃取填料，其特征在于：步骤5）中所述对所得反应物进行过滤时采用G5砂芯漏斗；所述真空干燥是在真空度为0.1MPa、65℃下干燥12h。

10.一种权利要求1所述的固相萃取填料在测定食品中磺胺残留的应用。