CN114054006A - 一种Oligo-dT亲和层析填料 - Google Patents

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戚紫燕
王捷
刘刚
金百胜
林生跃
赵光耀
江必旺
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers

Abstract

本发明提供了一种Oligo‑dT亲和层析填料，以表面亲水的、具有多羟基亲水官能团的聚合物微球为基球，通过聚合物微球表面的羟基将dT核苷酸单体键合生成oligo‑dT配基到聚合物表面而制得。本发明相比常规Oligo‑dT亲和填料具有更高的mRNA载量以及更高的mRNA回收率，还具有比常规oligo‑dT亲和填料更好的耐碱性。本发明制备方法简单，不需要现有技术中oligo‑dT亲和填料生产所需要的oligo‑dT配基合成与纯化，可以大大降低亲和填料的生产成本，从而降低mRNA的生产纯化成本。

Description

一种Oligo-dT亲和层析填料
技术领域
本发明涉及纯化技术领域，特别是涉及一种Oligo-dT亲和层析填料。
背景技术
Oligo-dT亲和层析广泛用于将mRNA体外转录(IVT)制造工艺中的纯化，这种亲和层析方法可以有效地将mRNA与转录反应过程的其它成分(如酶和质粒DNA等等)分离。现有技术(Prior arts)生产的oligo-dT亲和层析填料一般都是通过键合Oligo-dT配基到层析填料表面而成，Olig-dT配基一般是通过多步骤的固相合成方法制备而成。这种固相合成的方法需要用到昂贵的固相合成基球及固相合成linker，Oligo-dT配基合成后从固相载体上脱离下来后进行功能化修饰，以及繁杂的色谱纯化分离工艺，因此，oligo-dT的价格非常昂贵，以至于Oligo-dT亲和填料的生产成本都非常高，严重阻碍这种亲和填料在大规模mRNA生产纯化工艺中的应用。另外，现有技术生产的Oligo-dT亲和填料所用的配基键合化学联结往往在强碱下不太稳定，以至于亲和填料在再生regeneration和CIP过程(亲和填料的CIP条件一般都是0.1-0.5M NaOH)中容易发生配基脱落，严重影响填料的寿命。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型Oligo-dT亲和层析填料，不仅具有很好的mRNA结合能力，具有更高的mRNA载量以及更高的mRNA回收率，并且具有更好的耐碱性。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种Oligo-dT亲和层析填料，以表面具有多羟基亲水官能团的聚合物微球为基球，通过聚合物微球表面的羟基将嘧啶(dT)核苷酸单体键合生成oligo-dT配基到聚合物表面而制得。
优选的，所述作为基球的聚合物微球为PS-DVB、聚甲基丙烯酸酯、聚酰胺、聚醚类、交联纤维素类高分子树脂。
优选的，所述聚合物微球表面的多羟基亲水官能团可以是在聚合物微球制备时引入，也可以是通过表面化学修饰或者表面亲水包覆而得到。
优选的，所述聚合物微球的交联度大于20％。
优选的，所述聚合物微球的交联度在45％～65％之间。
优选的，所述聚合物微球是大孔径聚合物微球，孔径大于
Figure BDA0003359385030000021
优选的，所述聚合物微球的孔径大于
Figure BDA0003359385030000022
优选的，所述聚合物微球通过表面的羟基直接与dT单体键合，通过固相合成的方法在聚合物微球表面生成oligo-dT配基，并循环键合至少一次以成长出oligo-dT链。
优选的，所述聚合物微球表面的dT核苷酸单体键合循环次数不少于10次。
优选的，聚合物微球表面的dT核苷酸单体键合循环次数不少于15次。
优选的，聚合物微球表面的dT核苷酸单体键合循环次数是15-30次，即键合15-30个核苷酸单位(dT15-dT30)。
优选的，所述dT核甘酸单体可以是5‘-位保护的磷酸二酯(phosphodiester)结构,也可以是5‘-位保护的亚磷酰胺(phosphoramidite)结构。
其中，如果dT核甘酸单体是磷酸二酯类型，每个单体键合固相合成循环有键合和5’-位脱保护两个步骤；如果dT核苷酸单体是亚磷酰胺类型，则每个单体键合循环包括键合、氧化、5’-位脱保护三个步骤。
本发明以具有高交联度的、表面亲水的大孔径聚合物微球作为固相合成的基球(support)将嘧啶核苷酸(dT)单体循环往复地键合联接到填料聚合物微球上直接制备而成，不需要oligo-dT配基的合成与分离纯化，也省去了转化效率低下的oligo-dT与填料的偶联。本发明oligo-dT亲和填料不仅具有很好的mRNA结合能力，而且相比常规oligo-dT亲和填料具有更高的mRNA载量以及更高的mRNA回收率。另外，这种oligo-dT亲和填料还具有比常规oligo-dT亲和填料更好的耐碱性。该填料不需要现有技术中oligo-dT亲和填料生产所需要的oligo-dT配基合成与纯化，制备方法简单，可以大大降低亲和填料的生产成本，从而降低mRNA的生产纯化成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1超大孔PS-DVB聚合物微球oligo-dT25亲和填料的合成
粒径50微米的超大孔(孔径
Figure BDA0003359385030000041
)PS-DVB微球用多羟基化合物亲水包覆后，用乙醇清洗干净，在60℃的烘箱中放置干燥。干燥后的微球粉末装入固相合成柱中。
用ARKTA固相合成仪程序控制dT核苷酸单体的键合反应。5‘-位保护的dT核甘酸单体DMT-dT-CE-Phosphoramidite(5’-O-(4,4’-Dimethoxytrityl)-thymidine-3’-cyanoethylPhosphoramidite)的键合反应，以无水乙腈作为溶剂，以乙巯基四氮唑为缩合剂的条件下进行12分钟。
氧化反应步骤则是用0.05M的碘溶液为反应试剂、以吡啶水溶液(90：10)为溶剂，反应时间是5分钟。
DMT脱保护的反应试剂是二氯乙酸，溶剂是二氯甲烷，反应时间是3分钟。25个循环单体键合完成后，超大孔PS-DVB聚合物微球用20％的氨水浸泡16个小时。用水洗至pH中性后得到超大孔PS-DVB聚合物微球oligo-dT25亲和填料，代号NM0501。
用该oligo-dT亲和填料NW0501对两种不同大小的mRNA的亲和结合载量和洗脱回收率进行了测试。亲和结合载量的测试方法是静态载量测试。作为对比，使用了两种传统方法合成的oligo-dT25填料，POROS Oligo-dT25和NanoGel dT25，也用同样方法进行了测试。其中NanoGel dT25的基球与本实例中所用的超大孔PS-DVB聚合物微球完全一样。
测试结果列于表1，本发明oligo-dT亲和填料NM0501和两款常规oligo-dT亲和填料对两种不同mRNA的亲和载量以及洗脱回收率的对比。
表1
Figure BDA0003359385030000051
同时，对表1中的三种oligo-dT亲和填料的耐碱性进行了对比测试。填料在0.1M的氢氧化钠中浸泡48小时后测量其对mRNA的静态载量变化。氢氧化钠浸泡后的载量下降百分比值反映了填料对0.1MNaOH的耐受性。下降百分比越小，说明填料对强碱的耐受性越好，填料的使用寿命会越长。
耐碱性测试结果列于表2，本发明oligo-dT填料NM0501与两款常规oligo-dT亲和填料在0.1M NaOH中浸泡48小时后的静态载量变化对比。
表2
Figure BDA0003359385030000052
Figure BDA0003359385030000061
可见，本发明填料有着更高的亲和载量和洗脱回收率，同时还具有比常规oligo-dT亲和填料更好的耐碱性。
本发明制备方法简单，不需要现有技术中oligo-dT亲和填料生产所需要的oligo-dT配基合成与纯化，可以大大降低亲和填料的生产成本，从而降低mRNA的生产纯化成本。本发明相比常规oligo-dT亲和填料具有更高的mRNA载量以及更高的mRNA回收率，同时还具有比常规oligo-dT亲和填料更好的耐碱性。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种Oligo-dT亲和层析填料，其特征在于，所述Oligo-dT亲和层析填料以表面具有多羟基亲水官能团的聚合物微球为基球，通过聚合物微球表面的羟基将dT核苷酸单体键合生成oligo-dT配基到聚合物表面而制得。
2.如权利要求1所述的Oligo-dT亲和层析填料，其特征在于，所述作为基球的聚合物微球为PS-DVB、聚甲基丙烯酸酯、聚酰胺、聚醚类、交联纤维素类高分子树脂。
3.如权利要求1所述的Oligo-dT亲和层析填料，其特征在于，所述聚合物微球表面的多羟基亲水官能团可以是在聚合物微球制备时引入，也可以是通过表面化学修饰或者表面亲水包覆而得到。
4.如权利要求1所述的Oligo-dT亲和层析填料，其特征在于，所述聚合物微球的交联度大于20％。
5.如权利要求1所述的Oligo-dT亲和层析填料，其特征在于，所述聚合物微球是大孔径聚合物微球，孔径大于
Figure FDA0003359385020000011
6.如权利要求1所述的Oligo-dT亲和层析填料，其特征在于，所述聚合物微球通过表面的羟基直接与dT核苷酸单体键合，通过固相合成的方法在聚合物微球表面生成oligo-dT配基，并循环键合至少一次以成长出oligo-dT链。
7.如权利要求6所述的Oligo-dT亲和层析填料，其特征在于，所述聚合物微球表面的dT核苷酸单体键合循环次数不少于10次。
8.如权利要求1所述的Oligo-dT亲和层析填料，其特征在于，所述dT核苷酸单体可以是5‘-位保护的磷酸二酯结构,也可以是5‘-位保护的亚磷酰胺结构。
9.如权利要求8所述的Oligo-dT亲和层析填料，其特征在于，如果dT核甘酸单体是磷酸二酯类型，每个dT核甘酸单体键合固相合成循环有键合和5’-位脱保护两个步骤；如果dT核苷酸单体是亚磷酰胺类型，则每个dT核甘酸单体键合循环包括键合、氧化、5’-位脱保护三个步骤。
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