CN105713963A - 从***固定石蜡包埋的组织样品中检测基因表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种从***固定石蜡包埋的组织样品中快速检测基因表达的方法,所述方法包括将***固定石蜡包埋的组织样品用脱蜡液处理以获得脱蜡的组织样品,将所述脱蜡的组织样品裂解以获得组织样品裂解液,和直接检测所述裂解液中的基因表达。
Description
发明领域
本发明涉及检测基因表达的方法,特别涉及从***固定石蜡包埋的组织样品中快速检测基因表达的方法。
背景技术
人类基因组DNA全序列数据的公布标志着生命科学发展已逐步进入基因组学时代。随着分子生物学的充分发展,以核酸为主要研究对象的分子生物学技术越来越广泛地被人类用于疾病诊断的领域,为疾病的预防、预测、诊断和治疗提供信息和决策依据。
***固定石蜡包埋组织(formalinfixedandparaffinembeddedtissues,简称FFPE)作为医疗机构最常用的保存病理组织的方法,是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。由于新鲜标本难以得到,为进行实体肿瘤分子生物学研究,对已有病例进行回顾性研究时,只能从石蜡包埋组织中进行基因提取,因此石蜡包埋组织就成为来源最丰富的珍贵资源。目前检测FFPE样品中的基因表达需要从FFPE样品中分离出高质量的RNA。但是,由于FFPE样品中RNA已经部分降解了,并且往往与组蛋白紧密交联,因此想要提取其中的核酸信息相当有难度。目前常用的从FFPE样品中提取总RNA的方法耗时长,并且繁杂的纯化步骤造成RNA样品的大量损失,当样品含量有限时,则可能影响下游检测的进行。因此,需要开发一种简单,快速,准确的方法从FFPE样品中检测基因的表达情况。
发明概述
本申请的一个方面特别涉及从***固定石蜡包埋的组织样品中快速检测基因表达的方法,包括:(a)将***固定石蜡包埋的组织样品用脱蜡液处理以获得脱蜡的组织样品;(b)将所述脱蜡的组织样品裂解以获得组织样品裂解液;和(c)直接检测所述裂解液中的基因表达。
在某些实施方式中,步骤(c)包括直接检测所述裂解液中的所述基因的mRNA。
在某些实施方式中,步骤(c)包括:提供由报告探针和捕获探针组成的探针对,其中所述报告探针包含(1)与所述基因的mRNA杂交的第一核酸序列;(2)连接在所述第一核酸序列上的荧光标记条形码;其中所述捕获探针包含(1)与所述基因的mRNA杂交的第二核酸序列;(2)连接在所述第二核酸序列上的生物素;将所述探针对与所述基因的mRNA杂交形成复合物;将所述复合物以延伸的状态固定在具有亲和素的基板上;检测荧光标记条形码的信号计数。
在某些实施方式中,在步骤(c)中使用nCounter分析***检测所述裂解液的基因表达。
在某些实施方式中,所述***固定石蜡包埋的组织样品为微量组织样品。在某些实施例中,所述***固定石蜡包埋的组织样品为细针穿刺活检样品。在某些实施例中,所述***固定石蜡包埋的样品的体积大于0.75×10-2mm3。在某些实施例中,所述***固定石蜡包埋的样品的体积大于1.5×10-2mm3。在某些实施例中,所述***固定石蜡包埋的样品的体积大于3×10-2mm3。在某些实施例中,所述***固定石蜡包埋的样品的体积大于6×10-2mm3。在某些实施例中,所述***固定石蜡包埋的样品的体积大于12×10-2mm3。
在某些实施方式中,所述脱蜡液包含二甲苯。
在某些实施方式中,在步骤(b)中使用蛋白酶k将所述脱蜡的组织样品裂解。
在某些实施方式中,将所述裂解液在步骤(c)之前用脱氧核酸酶处理。
在某些实施方式中,所述***固定石蜡包埋的组织样品是人组织样品。在某些实施方式中,所述人组织样品是来源于病人的病理组织样品。在某些实施方式中,所述病理组织样品是肿瘤组织样品。在某些实施方式中,所述肿瘤组织来源于选自下组的肿瘤:小细胞或非小细胞性肺癌、胃癌、肠癌、食道癌、结肠直肠癌、***癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、泌尿道癌、肾癌、膀胱癌、恶性黑素瘤、肝癌、子宫癌、胰腺癌、骨髓瘤癌、子宫内膜癌、头颈癌、小儿肿瘤、肉瘤。
在某些实施方式中,所述基因为ALK。
附图的简要说明
图1.从异种移植FFPE组织样品中快速检测基因表达情况。针对同一组织样品的同一基因(ALK),用裂解液直接检测得到的计数信号约为用纯化的总RNA检测得到的信号的2倍。
图2.用裂解液检测基因表达情况。在肺癌腺癌临床样品上大量重复裂解液制备实验,并与500ng纯化的总RNA实验结果进行比对,结果显示两者一致性非常高(R2=0.946)。
图3.用裂解液检测微量组织样品中的基因表达情况。从相同面积、相同样品的FFPE组织中制备裂解液和纯化的总RNA(使用RNeasyFFPEKit(Qiagen))。当组织样品体积约为6×10-2mm3时,使用纯化的总RNA得到的信号接近背景信号的阈值(60),无法得出准确的测量信息。当组织样品体积小于3×10-2mm3,使用纯化的总RNA得到的信号低于背景信号的阈值。而用裂解液可以准确检测体积为1.5×10-2mm3的FFPE组织样品。
发明详述
本申请公开了一种从***固定石蜡包埋的组织样品中快速检测基因表达的方法,包括以下步骤:
(a)将***固定石蜡包埋的组织样品用脱蜡液处理以获得脱蜡的组织样品;
(b)将所述脱蜡的组织样品裂解以获得组织样品裂解液;和
(c)直接检测所述裂解液中的基因表达。
在本申请中,检测基因表达是指探测由基因的DNA序列产生的对应的基因产物的量,例如mRNA的量。在某些实施方式中,检测基因表达包括检测基因的DNA序列转录得到的mRNA的量。由于RNA转录后的剪切过程可能有所不同,同一个基因可能对应一种或多种不同的mRNA转录子。在某些实施方式中,检测基因表达是检测基因对应的某一种或几种具有特定序列的mRNA转录子的量。
在本申请中,“***固定石蜡包埋”是指用适当的化学试剂固定,脱水并被石蜡侵染的生物样品。在固定过程中,生物样品中的细胞组份迅速凝固和交联,从而得以长期保存。用于固定的化学试剂包括但不限于***(甲醛)、乙醇、醋酸、升汞、锇酸(四氧化锇)、重铬酸钾及苦味酸或其组合。脱水过程可以包括依次用不同浓度的乙醇(如30%、50%、70%、80%、90%到100%)进行逐级脱水。其他的脱水剂包括但不限于正丁醇、叔丁醇、丙酮。石蜡侵染和包埋的过程为本领域公知。
在本申请中,用于检测的组织样品可以包括动物组织样品和植物组织样品。在某些实施方式中,组织样品是人组织样品,优选的是来源于病人的病理组织样品。根据某些实施例,组织样品是肿瘤组织样品。根据某些实施例,肿瘤组织来源于选自下组的肿瘤:小细胞或非小细胞性肺癌、胃癌、肠癌、食道癌、结肠直肠癌、***癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、泌尿道癌、肾癌、膀胱癌、恶性黑素瘤、肝癌、子宫癌、胰腺癌、骨髓瘤癌、子宫内膜癌、头颈癌、小儿肿瘤、肉瘤。
在本申请中,基因表达的检测是指通过探测由特定DNA序列编码的RNA的数量检测该DNA序列在组织样品中产生有生物活性的产物,包括mRNA和蛋白分子的量。在某些实施方式中,基因表达的检测是指测定特定基因的mRNA片段。
在本申请中,脱蜡液是指能将***固定石蜡包埋的组织样品中的石蜡去除同时并不损伤组织样品的化学试剂或溶液。在某些实施方式中,脱蜡液包含二甲苯。在某些实施方式中,脱蜡液可以是市场上购买的试剂,例如凯杰公司(Qiagen)的DeparaffinizationSolution。
在本申请中,用脱蜡液“处理”FFPE组织样品是指用脱蜡液使FFPE组织样品脱蜡的步骤和过程,包括将脱蜡液和FFPE组织样品混合。根据某些实施方式,“处理”还可以包括将脱蜡液和脱蜡后的组织样品分离。根据某些实施例,用脱蜡液处理FFPE组织样品包括将脱蜡液和FFPE组织样品在试管中混合,离心分离脱蜡液和脱蜡的组织样品,移除脱蜡液,在试管中加入乙醇清洗组织样品以除去残留的脱蜡液,通过离心和蒸发除去乙醇,从而得到脱蜡的组织样品。
在本申请中,“脱蜡的组织样品”是指***固定石蜡包埋的组织样品在经过脱蜡液处理后去除了大于60%、70%、80%、90%到100%的石蜡后得到的组织样品。
在本申请中,“裂解”是指组织样品中的细胞膜结构的完整性被破坏,使细胞内部组份,如蛋白、DNA和RNA等游离出来的过程。根据某些实施方式,通过用蛋白酶K处理组织样品使得组织样品裂解。
“裂解液”是指组织样品被裂解后得到的游离细胞组份的原始混合物。裂解液可以被进一步处理以分离、纯化或扩增其中的某种组分。在某些实施方式中,本申请所述的方法中使用的组织样品裂解液没有经过任何以分离、纯化或扩增其中某种组分为目的而进行的处理,或者没有经过对其中的RNA进行的分离、纯化或扩增的处理。在某些实施方式中,可选地,裂解液用脱氧核酸酶处理以除去裂解液中的DNA。在本申请中,用脱氧核酸酶处理不影响对基因表达的直接检测。
在本申请中,“直接”是指在检测基因表达时,裂解液中的组份没有经过分离,纯化或扩增。例如,裂解液中的RNA没有被分离、纯化或扩增,例如没有使用二氧化硅柱纯化,也没有用例如PCR等方法将RNA逆转录成cDNA和/或扩增。用现有技术检测石蜡包埋样品中的基因表达,一般都需要从样品中分离纯化RNA,并把纯化的RNA逆转录成cDNA并用PCR扩增。这样的方法手续繁琐,耗时长,而且不够精确。尤其是在样品量较少的情况下,由于分离纯化RNA的过程中不可避免的样品损失,导致现有技术无法准确检测样品中的基因表达。通过直接检测裂解液中的基因表达,本方法可以减少对裂解液的处理步骤从而减少RNA的损失,还可以避免因PCR等扩增方法处理带来的误差,从而在更短的时间里准确测定组织样品的基因表达情况。
在某些实施方式中,直接检测裂解液中的基因表达可以通过使用数字多基因表达分析(Digitalmultiplexedgeneexpressionanalysis)的方法进行分析。数字多基因表达分析是指一种利用分子条形码和单分子成像来检测及统计每一个反应体系中特定转录本的数量的方法,其原理可参见Geiss等,Directmultiplexedmeasurementofgeneexpressionwithcolor-codedprobepairs,NatureBiotechnology,26:317-325;美国专利申请US20100015607A1。该方法包括提供由报告探针和捕获探针组成的探针对,其中所述报告探针包含(1)与所述基因的mRNA杂交的第一核酸序列;(2)连接在所述第一核酸序列5’端的荧光标记条形码;其中所述捕获探针包含(1)与所述基因的mRNA杂交的第二核酸序列;(2)连接在所述第二核酸序列3’端的生物素;将所述探针对与所述基因的mRNA杂交形成复合物;将所述复合物以延伸的状态固定在具有亲和素的基板上;检测荧光标记条形码的信号计数。
在某些实施例中,直接检测裂解液中的基因表达可以通过使用nCounter分析***来完成。简单来说,nCounter分析***采用两条长度约为50bp的探针与mRNA进行杂交。报告探针(reporterprobe)携带信号;捕获探针(captureprobe)用于杂交后的复合物固定,以供数据采集。杂交后,样品被转移到样品制备工作站,在那里过量的探针被洗掉,而探针和目的mRNA的复合物则被固定到nCounter的样品夹上。将样品夹放置到数据分析仪上进行数据采集。样品夹上不同的颜色编码数将被计算出来,并代表每一种目的分子的数量。在特定实施例中,nCounter分析***由美国NanoString公司生产,包括全自动的样品处理工作站、数字化成像分析仪、CodeSet(分子条形码)和相关试剂。使用该***进行检测无需使用酶,无需反转录,也不需要做PCR扩增。(参见Kulkarni,DigitalmultiplexedgeneexpressionanalysisusingtheNanoStringnCountersystem.)
本申请公开的方法将FFPE组织样品的裂解液直接通过数字多基因表达分析方法检测基因表达。与需要RNA纯化的方法相比,本申请的方法避免了对裂解液进行多次处理,大大减少了RNA损失,从而节省了时间和所需要的样品,同时降低了成本,节省了试剂和耗材用量。特别地,本申请公开的方法由于只需要极少量的组织样品,因而适用于面积微小的组织样品,例如细针穿刺活检样品(fine-needlebiopsy)。同时,由于本申请公开的方法操作简单,因此容易实现自动化操作。本申请通过实施例表明用本申请公开的方法制备的裂解液中RNA质量完好,没有明显降解现象。而且本申请的方法与使用纯化的RNA的检测结果相比,两者在定性结果上的一致性非常高,但本申请的方法测得的RNA的量远远高于使用纯化的RNA的检测方法测得的量,这表明本申请的方法避免了样品中RNA的大量损失
根据某些实施方式,***固定石蜡包埋的组织样品是由细针穿刺活检样品(fine-needlebiopsies)制备的。“细针穿刺活检”是指一种检测皮下硬块或肿块的技术。该技术通过将细小的空心针***肿块进行细胞取样,结合染色和分子诊断,可以避免手术取样检测。目前,细针穿刺活检技术被广泛用于癌症和免疫疾病的诊断。
本申请公开的方法特别适用于从微量的FFPE组织样品中检测基因表达。根据某些实施方式,***固定石蜡包埋的样品的体积大于0.75×10-2mm3、1.0×10-2mm3、1.5×10-2mm3、2×10-2mm3、2.5×10-2mm3、3×10-2mm3、3.5×10-2mm3、4×10-2mm3、4.5×10-2mm3、5×10-2mm3、6×10-2mm3、7×10-2mm3、8×10-2mm3、9×10-2mm3、10×10-2mm3、11×10-2mm3、12×10-2mm3、13×10-2mm3、14×10-2mm3、15×10-2mm3。根据某些实施方式,***固定石蜡包埋的样品的体积为1.5~6×10-2mm3。根据某些实施方式,***固定石蜡包埋的样品的体积为1.5~3×10-2mm3。
实施例
实施例1.从异种移植FFPE组织样品中快速检测基因表达情况
材料:
腺癌FFPE组织样品来自韩国。肿瘤异种移植FFPE组织样本来自药明康德。
方法:
1,用手术刀切割4-5μm厚的组织切片,放入1.5ml离心管中。
2,在所述离心管中加入1ml二甲苯,涡旋混合10秒,在20,000×g下离心4分钟。
3,小心地移去上清液,保留沉淀物。
4,在沉淀物中加入1毫升96-100%乙醇,涡旋混合,在20,000×g下离心2分钟。
5,小心地除去上清液,在干扰沉淀的情况下尽量除去残留的乙醇。
6,在室温下空气干燥,确保所有的乙醇蒸发。
7,用适量的蛋白酶K缓冲液重悬浮干燥的沉淀,加入5μL蛋白酶K(20毫克/毫升)。
8,在56℃下反应15分钟,然后在80℃下放置15分钟。
9,在20,000×g下离心10-15分钟。
10,将上清移到一个新的1.5ml离心管获得裂解液。
11,用nCounter分析***检测裂解液中的基因表达。
作为比较,用凯杰公司(Qiagen)生产的FFPERNA纯化试剂盒(RNeasyFFPEKit)从同一组织样本中制备总RNA,并用nCounter分析***检测总RNA的基因表达
结果:
如图1所示,针对同一组织样品的同一基因(ALK),用裂解液直接检测得到的计数信号约为用纯化的总RNA检测得到的信号的2倍。
实施例2.用裂解液检测基因表达情况
材料:腺癌FFPE组织样品来自韩国。
方法:
在肺癌腺癌临床样品上大量重复用裂解液检测基因表达实验。
1,用手术刀切割5μm厚的组织切片,放入1.5ml离心管中。
2,在所述离心管中加入1ml二甲苯,涡旋混合10秒,在20,000×g下离心4分钟。
3,小心地移去上清液,保留沉淀物。
4,在沉淀物中加入1毫升96-100%乙醇,涡旋混合,在20,000×g下离心2分钟。
5,小心地除去上清液,在干扰沉淀的情况下尽量除去残留的乙醇。
6,在室温下空气干燥,确保所有的乙醇蒸发。
7,用适量的蛋白酶K缓冲液重悬浮干燥的沉淀,加入5μL蛋白酶K(20毫克/毫升)。
8,在56℃下反应15分钟,然后在80℃下放置15分钟。
9,在20,000×g下离心10-15分钟。
10,将上清移到一个新的1.5ml离心管获得裂解液。
11,在裂解液中添加相当于总液体量1/10的DNA酶的缓冲液和DNA酶。在室温下孵育15分钟,然后在70℃下放置15分钟,并在冰上冷却。
12,用nCounter分析***检测裂解液中的基因表达。
作为比较,用凯杰公司(Qiagen)生产的FFPERNA纯化试剂盒(RNeasyFFPEKit)从同一组织样本中制备总RNA,并用nCounter分析***检测500ng纯化的总RNA的基因表达。
结果:
如图2所示,用裂解液检测基因表达和用纯化的总RNA检测的结果一致性非常高(R2=0.946)。
实施例3.用裂解液检测微量组织样品中的基因表达情况
对于更微小和珍贵的FFPE组织(例如fine-needlebiopsy相似大小的组织),比较从等量样品中制备的裂解液和纯化的总RNA中目标基因(ALK、ROS1和RET)mRNA表达量。从相同面积、相同样品的FFPE组织中制备裂解液和纯化的总RNA(使用RNeasyFFPEKit(Qiagen)),分别进行基因表达的测定。结果如图3所示,普通的总RNA提取试剂盒在纯化步骤中损失了约75%-88%的RNA。当组织样品体积约为6×10-2mm3时,使用纯化的总RNA得到的信号接近背景信号的阈值(60),无法得出准确的测量信息。当组织样品体积小于3×10-2mm3,使用纯化的总RNA得到的信号低于背景信号的阈值。而用裂解液可以准确检测体积在1.5~6×10-2mm3的FFPE组织样品。
Claims (15)
1.一种从***固定石蜡包埋的组织样品中快速检测基因表达的方法,包括以下步骤:
(a)将***固定石蜡包埋的组织样品用脱蜡液处理以获得脱蜡的组织样品;
(b)将所述脱蜡的组织样品裂解以获得组织样品裂解液;和
(c)直接检测所述裂解液中的基因表达。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(c)包括直接检测所述裂解液中的所述基因的mRNA。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(c)包括
提供由报告探针和捕获探针组成的探针对,
其中所述报告探针包含(1)与所述基因的mRNA杂交的第一核酸序列;(2)连接在所述第一核酸序列上的荧光标记条形码;
其中所述捕获探针包含(1)与所述基因的mRNA杂交的第二核酸序列;(2)连接在所述第二核酸序列上的生物素;
将所述探针对与所述基因的mRNA杂交形成复合物;
将所述复合物以延伸的状态固定在具有亲和素的基板上;
检测荧光标记条形码的信号计数。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,在步骤(c)中使用nCounter分析***检测所述裂解液的基因表达。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述***固定石蜡包埋的组织样品为细针穿刺活检样品。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述***固定石蜡包埋的样品的体积大于0.75×10-2mm3。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述***固定石蜡包埋的样品的体积大于1.5×10-2mm3。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述脱蜡液包含二甲苯。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(b)中使用蛋白酶k将所述脱蜡的组织样品裂解。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,将所述裂解液在步骤(c)之前用脱氧核酸酶处理。
11.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述***固定石蜡包埋的组织样品是人组织样品。
12.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述人组织样品是来源于病人的病理组织样品。
13.如权利要求12所述的方法,其特征在于,所述病理组织样品是肿瘤组织样品。
14.如权利要求13所述的方法,其特征在于,所述肿瘤组织来源于选自下组的肿瘤:小细胞或非小细胞性肺癌、胃癌、肠癌、食道癌、结肠直肠癌、***癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、泌尿道癌、肾癌、膀胱癌、恶性黑素瘤、肝癌、子宫癌、胰腺癌、骨髓瘤癌、子宫内膜癌、头颈癌、小儿肿瘤、肉瘤。
15.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述基因选自下组:ALK,ROS1和RET。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160629 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |