CN114034806B - 基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药印迹模板成分簇划归整合方法及产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法及产品；基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计原理，根据中药指纹图谱色谱峰对保留时间呈“印迹模板”簇状、匹配频数呈凸凹状分布的特征，先统计分析匹配频数，划出中药成分簇“印迹模板”；计算各成分簇“印迹模板”之间保留时间的频数统计值，确定各成分簇归属的“印迹模板”；计算各成分簇“印迹模板”保留时间等强度参数的频数统计值作为新保留时间等强度参数，总峰面积等容量参数为新峰面积等容量参数，可将中药指纹图谱转变成以成分簇“印迹模板”为“单元”表征的新指纹图谱而保证原指纹图谱的总量统计矩特性以及样品间变异性，而色谱峰数可极大降低。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，属于中医药和分析化学结合的交叉学科，涉及到一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法。
背景技术
中药材、饮片和复方制剂(统称产品)是中医药临床治病的三大物质基础。其指纹图谱色谱峰的整合和分析方法是确保中药产品质量评价的核心关键技术，一直受到中药行业高度关注。
1.中药指纹图谱的特征和色谱峰的变化的受到中药材遗传多态、环境和制药技术影响，表现在：
(1)中药材生产过程对指纹图谱特征及色谱峰的影响：中药材多以动植物入药，来源于自然界，具生物多样性，在环境(没有选择、突变、迁移和遗传漂变)稳定的情况下其成分呈多态性，宏观上应遵循Hardy-Weinberg群体平衡定律，当中药的生长环境稳定后，经过相当长的时间，其遗传基因变异频率保持稳定，中药材的群体整体质量处于遗传统计学上的稳定之中，其基因的变异频率可通过中药有效成分群在指纹图谱的色谱峰数目和面积的变化得以反映。
(2)中药制药技术对指纹图谱特征及色谱峰的影响：中药炮制就是对生物超分子体的加工炮制，各种中药炮制方法、工艺和火候的影响最终也会反映到饮片的指纹图谱色谱峰数目和含量上，特别是以“印迹模板”成分簇表征的指纹图谱变化上。中药制剂包括提取工艺和成型工艺，提取工艺实际上是怎样有效与高效获取原方中目标有效成分群的方法与技术。目前多采用均匀设计、正交设计实验，主要从浸泡时间、提取时间、溶媒用量及浓度、体系pH值、渗漉速度等主要影响工艺条件的方面进行最优工艺条件研究。常用的提取方法有：浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续提取法等。近年的新制药技术有：超临界流体萃取法、膜分离技术、超微粉碎技术、中药絮凝分离技术、半仿生提取法、超声提取法、旋流提取法、加压逆流提取法、酶法、大孔树脂吸附法、超滤法、分子蒸馏法。中药制剂成型工艺是在中药提取工艺基础上采用溶解、分散、包合、微囊、纳米化、脂质体、制粒、制丸、压片等制剂技术将中药提取物制成一定给药形式的剂型。上述提取与制剂成型工艺的优劣最终也会反映到以“印迹模板”成分簇表征的中药指纹图谱的色谱峰数目和峰面积中。
2.中药指纹图谱分析与整合处理方法：由于中药及其制剂药效成分复杂，以多层次、多靶点按超分子“印迹模板”作用于机体生物网络中的某些特定环节而发挥其整体效应，目前多采用中药指纹图谱进行质量表征、控制和评价，先后建立了相关系数法、聚类分析、夹角余弦法、模糊尖T一分布法、欧氏距离法、超信息特征数字化及总量统计矩(相似度)法等，其共同特征是中药成分多，色谱峰多，在用中药理论、中药生产与应用研究还存在较大的困难，因此怎样对中药指纹图谱色谱峰进行整合目前没有可行的方法，造成了中药物质基础表征单元过多繁杂，不利于中药理论、生产与应用研究，因此怎样根据成分簇“印迹模板”作用特性进行整合成新的指纹图谱，建立以成分簇“印迹模板”表征物质基础单元，而又不丢失原指纹图谱分析参数特征就成了中药理论、产业和应用研究关键“卡脖子”技术，为行业瞩目。
上述问题长期没有得到很好的解决，其根本原因是欠缺对中药超分子体属性及在指纹图谱表现的特征的认识。
经过发明人近十年的中医药超分子化学研究，发现中药与人体都是自然界巨复生物超分子体，各级分子按“印迹模板”有序产生“气析”作用。超分子“印迹模板”是“在空间结构和结合位点上能完全匹配的模板物”，即印迹模板是超分子化学概念，是指某类成分作用的共同分子结构特征，可理解为超分子客体(中药成分)与人体靶点作用的有效原子基团的空间点阵，相当于钥锁的齿合作关系，这种关系可通过色谱印迹测出，用指纹图谱总量统计矩、信息熵、信息量来表征其特征和变化，不同的印迹模板特征有不同的色谱特征参数，如总量统计矩、信息熵、信息量等。对药物成分来说“印迹模板”是其分子结构的空间活性结构，也可以说是活性原子团的空间排列点阵，具有相似的“印迹模板”就有相似的中药药理作用、质量属性和相应的制药方法。若能从中药指纹图谱的色谱峰峰数和面积变化来发现解决中药超分子“印迹模板”成分簇的整合方法不失为解决问题的突破口。
发明内容
1、一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，其特征在于，包括以下步骤：
作为生物巨复超分子体的中药，其成分簇以“印迹模板”的形式体现出中药药性和药效，通过色谱方式来进行指纹图谱色谱峰的统计划分，并以指纹图谱总量统计矩、信息熵和信息量来表征中药的成分种类和含量；
其中中药成分簇的“印迹模板”数目，是以色谱学的色谱峰出现匹配频数对保留时间呈凸凹状分布来确定，通过各时间段的色谱峰出现的匹配频数按统计学划分得到；
中药成分簇的“印迹模板”归属，是对中药指纹图谱“印迹模板”成分群簇间采用段带匹配频数统计学进行成分簇归属的划分得到；
中药指纹图谱“印迹模板”成分簇是采用段带匹配频数统计学计算新的保留时间或强度参数，加合各成分簇的面积或容量参数作为新的峰面积或新容量参数，将传统的中药指纹图谱转变成以成分簇“印迹模板”表征的新型指纹图谱。
2、根据权利要求1所述的一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，其特征在于：
所述的体现为生物巨复超分子体的中药，是指在自然界的生物进化过程中，生命体通过自组织、自组装、自识别与自复制，在众多小分子模板基础上合成的生物超分子体，其客体与人体经络脏腑按“印迹模板”产生“气析”作用，呈现中药药性和药效，并受到药材遗传多态性、环境和制技术的影响，最终反映到中药产品的种类和含量的指纹图谱色谱峰的变化上。
3、根据权利要求1所述的一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，其特征在于，中药成分簇的“印迹模板”数目，是通过各时间段的色谱峰出现的匹配频率进行按统计学划分，确定成分群“印迹模板”的数目是指按生物超分子“印迹模板”修饰而成的中药，呈现同母核群生特征，同一“印迹模板”修饰的成分群，其母核相似，其化学结构相似，理化性质相近，色谱学行为相似，保留时间向最接近“印迹模板”结构特征的成分靠近，以修饰成最接近“印迹模板”结构特征的成分的几率较大，出现的频率较高，而修饰成远离“印迹模板”结构特征的成分的几率较小，出现的频率较小，最终在色谱学上表现出以最接近“印迹模板”结构特征成分为中心的簇状分布特征和以指纹图谱色谱峰对保留时间的凸凹状分布；通过对指纹图谱色谱峰匹配时共同出现的频数进行统计学分析，取频数的均数与一定置信度下的统计量乘以标准差的积之和为界值确定“印迹模板”数目。
4、根据权利要求1所述的一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，其特征在于，所述中药成分簇的“印迹模板”归属，是对中药指纹图谱“印迹模板”成分群簇间采用段带匹配频数统计学进行成分簇归属的划分，已划分好的成分簇“印迹模板”间的成分归属是采用色谱中保留时间的匹配频数统计平均值进行划分，小于平均值的划归保留时间小的成分簇“印迹模板”，大于平均值的划归保留时间大的成分簇“印迹模板”；等于平均值的则根据保留时间的小数点后的数字进行划归，为奇数的划归保留时间小的成分簇“印迹模板”；为偶数的划归保留时间大的成分簇“印迹模板”。
5、根据权利要求1所述的一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，其特征在于，中药指纹图谱“印迹模板”成分群簇采用段带匹配频数统计学计算新的保留时间或强度性参数，加合各成分簇的面积或容量性参数作为新的峰面积或新容量性参数，是对已划归好“印迹模板”的成分簇进行匹配频数的保留时间或强度性参数统计平均值计算，以此作为成分簇“印迹模板”的新保留时间或新强度性参数，而各成分色谱峰的面积或容量性参数的总和为成分簇“印迹模板”的新面积或新容量性参数，从而将传统成分色谱峰转变成以成分簇“印迹模板”表征的新型指纹图谱。
6、根据权利要求1所述的所述的一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，其特征在于，所述的进行指纹图谱色谱峰的统计，是采用指纹图谱总量统计矩法进行统计，其中参数包括：
①总量零阶矩为色谱峰面积总量，体现成分群单个与整体的含量；
②总量一阶矩为各色谱峰面积的统计平均保留时间，体现成分群的单个印迹性与总量平均印迹性；
③总量二阶矩为各色谱峰面积的统计平均保留时间的方差，体现各成分的印迹性离散度和总体成分的印迹性的离散程度。
7、根据权利要求6所述的一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，其特征在于，
所述的参数计算包括以下步骤：
总量零阶矩为曲线下的n个色谱峰面积总和AUCT为
总量一阶矩MCRTT，即n个色谱峰的平均保留时间为
总量二阶矩VCRTT，即n个色谱峰的平均保留时间方差为
其中Ai表示第i峰的峰面积，λi表示第i峰的保留时间，σi表示第i峰的保留时间标准差，共有n个色谱峰；其中AUCT用来对中药成分组进行定量分析，表征整体成分的含量变化；MCRTT、VCRTT二参数用于中药指纹图谱的定性分析，表征成分组成即构成比发生变化，则通过三个参数就能定性定量地分析一张指纹图谱的特征，反映出成分的动态变化规律。
8、根据权利要求1所述的一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，其特征在于，所述的信息熵和信息量分别为：
其中ΔSiq为信息量，Wi为第i峰的峰面积百分比，W0为总含量或单位投料量，AT为总响应面积；
其中ΔSie为信息熵。
9、根据权利要求1所述的一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，其特征在于，所述的“印迹模板”的数目确定包括以下步骤：
将同一中药的S个样品的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价***，进行校正、匹配和数据导出，获得总色谱峰数Sp，各色谱峰的保留时间、各样本峰面积、对照指纹图谱峰面积、保留时间RSD、峰面积RSD和匹配数Np，其中匹配数就是“印迹模板”成分簇对应一定保留时间共同出现色谱峰的数目，由中药色谱指纹图谱相似度评价***给出，通过先对所纳入的指纹图谱的匹配频数进行统计分析，求算平均匹配频数和标准差，设定置信系数，按下式计算出划成“印迹模板”成分匹配频数的最低界值，排序取大于该界值的匹配频数的成分峰为共有“印迹模板”数，获得成分簇“印迹模板”总数目。
式中Npc为划作“印迹模板”所需最低匹配频数的色谱峰，计算大于等于Npc的色谱峰数N即为“印迹模板”数，是匹配频数的平均值，t(α,ν)为置信度为1-α，自由度ν对应的t界值，ν为总匹配峰数目-1，SD为匹配频数的标准差；
由式(6)可以获得置信度为1-α下的匹配后色谱峰数目为1+ν时的“印迹模板”对应的总色谱峰数目N，若Npc≥S，则Npc以样本数S为准计算总色谱峰数目N。
10、根据权利要求1所述的一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，其特征在于，
所述的中药指纹图谱“印迹模板”成分群簇间采用段带匹配频数统计学进行成分簇归属的划分，包括以下步骤：
对Npc1、Npc2、Npc2……Npci……Npcn的N个按色谱峰保留时间排序的“印迹模板”的成分簇间界线按匹配频数保留时间统计法进行划分，按下式计算Npc1、Npc2的成分簇划分的保留时间界值：
其中tRpc1为Npc1、Npc2两“印迹模板”成分簇划分时的保留时间，tpc1为Npc1“印迹模板”所对应匹配色谱峰的保留时间，tpc2为Npc2“印迹模板”所对应匹配色谱峰的保留时间，Np,j为介于等于Npc1、Npc2两“印迹模板”的j成分的匹配频率，tR,j为介于等于Npc1、Npc2两“印迹模板”的j成分的保留时间；
则有Npci、Npci两“印迹模板”成分簇划分时的保留时间为
其中tRpci为Npci、Npc(i+1)两“印迹模板”成分簇划分时的保留时间，tpci为Npci“印迹模板”所对应匹配色谱峰的保留时间，tpc(i+1)为Npc(i+1)“印迹模板”所对应匹配色谱峰的保留时间，Np,j为介于等于Npci、Npc(i+1)两“印迹模板”的j成分的匹配频率，tR,j为介于等于Npci、Npc(i+1)两“印迹模板”的j成分的保留时间；
将Npci、Npc(i+1)间的各成分色谱峰的保留时间tR,j与tRpci比较，小于tRpci的划归Npci成分簇“印迹模板”，大于tRpci的划归Npc(i+1)成分簇“印迹模板”；若等于tRpci，则根据tR,j的未端数字，奇数的划归Npci成分簇“印迹模板”；偶数划归Npc(i+1)成分簇“印迹模板”。
11、根据权利要求1所述的一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，其特征在于，中药指纹图谱“印迹模板”成分簇采用段带匹配频数统计学计算新的保留时间或强度参数包括以下步骤：
对于包括保留时间、调整保留时间、相对保留时间在内的强度性质参数按匹配频数统计平均法进行计算，其中Npci“印迹模板”成分簇的新保留时间通过下式计算：
式中tRpi为Npci成分簇“印迹模板”的新保留时间，tRpc(i-1)为tRpci与第i-1位成分簇“印迹模板”的保留时间界值，tRpci为tRpci与第i+1位成分簇“印迹模板”保留时间界值，Np,j为介于tRpc(i-1)、tRpci两保留时间界值的色谱峰匹配频数，tR,j为介于tRpc(i-1)、tRpci两保留时间界值的色谱峰保留时间；
对于包括色谱峰峰面积、峰高在内的容量性质的参数则按加法进行计算，Npci“印迹模板”成分簇的新峰面积按下式计算：
式中ARpi为Npci成分簇“印迹模板”的新色谱峰峰面积，tRpc(i-1)为tRpci与第i-1位成分簇“印迹模板”的保留时间界值，tRpci为与tRpci第i+1位成分簇“印迹模板”保留时间界值，AP,j是介于tRpc(i-1)与tRpci保留时间的色谱峰面积。
12、一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合产品，其特征在于，基于如权利要求1-11任一所述的方法，所得到的以下产品：
中药产品、以及体现在“印迹模板”频数匹配特征的色谱分析学上的形式所得到的产品，包括色谱分析***、计算软件、色谱柱、试剂和用于确定“印迹模板”的对照品；
其中药产品标明了包括指纹图谱色谱峰匹配频数在内的综合信息，除按中药产品正常要求标明外，还按中药超分子“印迹模板”色谱峰匹配频数统计技术标明了客体成分色谱峰匹配频数和以匹配频数获得的统计参数，包括新指纹图谱保留时间、调整保留时间、相对保留时间、峰面积和峰高。
本发明的技术效果在于，本发明人为了攻克中药指纹图谱的表征、分析和整合“印迹模板”成分簇的难关，在前期创立了中药指纹图谱总量统计矩、信息和信息量分析方法，发现了中药成分群的“三稳”和“三不稳”规律，结合生物遗传统计原理，创立了一次稳态投料量、中药炮制火候数学模型、大均匀配投料设计和提取动学等方法，建立了中药成分稳态性和均一性制备技术，在进行这一系列研究时发现了中药指纹图谱相似度评价***在进行各批间指纹图谱匹配时的匹配频数与保留时间关系。
由于中药成分群是按生物“印迹模板”自主作用修饰的结果，呈现同母核群生的特征，反映到色谱图上色谱峰出现的匹配频数对保留时间呈凸凹状分布，也就是不均匀的簇状分析，越接近“印迹模板”的成分含量高，面积大，出现的频率越高，反映到多样品指纹图谱匹配时的频数就大，这样可根据频数的统计学原理就可以划分出“印迹模板”成分群，将同一“印迹模板”的成分群合并作为物质基础单元进行表征，尽可能地将类似的理化生物性质成分合并。由于匹配频数与色谱峰面积大小呈相关性，其整合生成新的指纹图谱保留了原指纹图谱的总量统计矩分析结果特征，也不改变样品间的变异性，然对峰数可极大地压缩，信息熵、信息量发生变化，降低了中药物质基础表征单元数，极大地降低中药理论、中药生产与应用研究中的难度。
因此，中药指纹图谱可通过成分簇“印迹模板”匹配频数分布规律得到解决，实现中药物质基础单元的有序整合，而保持原指纹图谱的固有印迹性质，从而尽可能保证物质基础和药效毒效性的共同特征，解决中药指纹图谱色谱峰压缩，物质基础单元的“卡脖子”难题。
由于本技术发明考虑了目前中药成分簇的生物超分子“印迹模板“自主作用规律，具有对生物原料质量表征和以此作物质基础单元简化的普适性和灵活性特点，可结合各种中药理论、生产与应用研究情况，故具有广阔的市场前景和巨大的经济效益。
附图说明
图1：丹膝颗粒及药材的HPLC指纹图谱；
其中：S1:14标准品(1.梓醇；2.天麻素；3.川芎嗪；4.栀子苷；5.芍药苷；6.阿魏酸；7.蜕皮激素；8.丹酚酸B；9.槲皮素；10.丹皮酚；11.淫羊藿苷；12.橙黄决明素；13.大黄酚；14.丹参酮ⅡA)、S2:丹参、S3:牛膝、S4:天麻、S5:牡丹皮、S6:赤芍、S7：川芎、S8:地黄、S9:淫羊霍、S10：桑寄生、S11：栀子、S12:决明子、S13:火麻仁、S14:丹膝颗粒制剂、S15:甲醇
图2：15批丹膝颗粒及药材的HPLC指纹图谱；
其中a.丹参；b.牛膝；c.天麻；d.牡丹皮；e.赤芍、f.川芎、g.地黄、h.淫羊霍、i.桑寄生、j.栀子、k.决明子、l.火麻仁m.丹膝颗粒制剂。
具体实施方式
以下实施例公开方法及其产品。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进技术或工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的技术和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本实施例所公开的一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，包括：
(1)中药为生物巨复超分子体，以“印迹模板”客体与人体经络脏腑主体产生印迹作用，表现出中药药性和药效。中药的“印迹模板”成分簇受到原药材遗传多态、环境性和制药剂技术的综合影响，最终反映到中药成分的种类和含量的指纹图谱色谱峰的变化上，可用指纹图谱总量统计矩、信息熵、信息量等参数表征其变化程度；
(2)中药成分按“印迹模板”簇状修饰，体现在色谱学的色谱峰出现匹配频数对保留时间呈凸凹状分布，可通过各时间段的色谱峰出现的匹配频率进行按统计学划分，确定成分簇的“印迹模板”数目。
(3)中药指纹图谱“印迹模板”成分群簇间可采用段带匹配频数统计学进行成分簇归属的划分，获得各成分簇的“印迹模板”归属；
(4)中药指纹图谱“印迹模板”成分簇可采用段带匹配频数统计学计算新的保留时间或强度参数，加合各成分簇的面积或容量参数作为新的峰面积或新容量参数，可将传统的中药指纹图谱转变成以成分簇“印迹模板”表征的新型指纹图谱；
(5)经中药成分簇“印迹模板”整合表征的新指纹图谱保证了原指纹图谱的总量统计矩特性和信息熵、信息量的变异性质；
(6)经中药成分簇“印迹模板”整合表征的新指纹图谱可极大整合降低物质基础或质量属性的表征单元数。
诸技术综合运用于指纹图谱成分簇“印迹模板”归属确定，可极大地降低物质基础表征单元，降低中药研究、生产与应用过程中的困难，解决中药指纹图谱色谱峰如何整合表征的“卡脖子”难题；
(7)基于色谱峰匹配频数法整合成的新指纹图谱用于中药研究、生产和应用还包括其产品说明书的制订，该说明书标明了匹配频数整合方法等技术信息。
(8)运用本方法进行指纹图谱“印迹模板”成分簇划分整合所产生的产品，包括体现在“印迹模板”频数匹配特征的色谱分析学上可接受的形式，如色谱分析***、计算软件、色谱柱、试剂和用于“印迹模板”确定的对照品等；
(9)其中药产品标明了指纹图谱色谱峰匹配频数等技术等的综合信息，除按中药产品正常要求标明外，还按中药超分子“印迹模板”色谱峰匹配频数统计技术标明了客体成分色谱峰匹配频数和以匹配频数获得的统计参数，如新指纹图谱保留时间、调整保留时间、相对保留时间、峰面积、峰高等。
所述(1)的中药为生物巨复超分子体是指在自然界的生物进化过程中，生命体通过自组织、自组装、自识别与自复制，在众多小分子模板基础上进行超分子主体结构的合成，组成超分子，最终构成整个生物世界，生物体为各种形式的超分子体，中药和人体为其一员，按“印迹模板”(一定的空间孔穴通道结构)“气析”作用。中药客体成分簇是这种超分子“印迹模板”客体聚集体，受生物遗传多样性和生长环境及制药技术影响，这种变化可用指纹图谱色谱峰峰数和峰面积所产生印迹性表征。
中药成分在进行色谱分析时，表现为某个分子的某一个基团“印迹模板”随机与色谱固定相进行结合-迁移-解结合-再结合-再迁移等印迹作用，最终综合印迹特征以保留时间的形式体现出来，因此成分的保留时间是衡量成分群间印迹性的综合指标，在中药质量研究中具有重要地位。然而目前中药质量评价方法却注重成分的含量测定，而保留时间仅供以标准品确定待测成分的定性分析用，这被单成分物质基础和药理作用确定性所埋没。但在中药指纹图谱评价中，其重要性就体现出来了：有效成分簇间的平均保留时间的变化就意味着构成比的变化，成分群整体印迹性的变化，其药效属性的变化，反之通过建立平均保留时间的评价指标就能控制成分群的构成比和药效属性。再还要分析成分群的总含量变化，在平均保留时间不变的情况下，总含量与疗效呈量-效关系，同时还要分析各成分保留时间的离散程度，亦方差，会影响到疗效波动性。这一系列行为可以用总量统计矩分析进行表征。
指纹图谱总量统计矩法的参数包括：①总量零阶矩为色谱峰面积总量，体现成分群单个与整体的含量；②总量一阶矩为各色谱峰面积的统计平均保留时间，体现成分群的单个印迹性与总量平均印迹性；③总量二阶矩为各色谱峰面积的统计平均保留时间的方差，体现各成分的印迹性离散度和总体成分的印迹性的离散程度；该法能将单成分含量分析、多成分含量分析、单成分印迹性、多成分印迹性、单成分印迹方差、多成分印迹方差都有机结合，是表征色谱峰特征变化，并符合成分簇“印迹模板”印迹作用原理的通用方法。其参数的计算方法为：
总量零阶矩为曲线下的n个色谱峰面积总和，为式(1)。
总量一阶矩MCRTT，亦n个色谱峰的平均保留时间，为式(2)。
总量二阶矩VCRTT，亦n个色谱峰的平均保留时间方差，为式(3)
上式中Ai表示第i峰的峰面积，λi表示第i峰的保留时间，σi表示第i峰的保留时间标准差，共有n个色谱峰。其中AUCT可用来对中药成分组进行定量分析，表征整体成分的含量变化。MCRTT、VCRTT二参数可用于中药指纹图谱的定性分析，表征成分组成(构成比)发生了变化，三个参数就能定性定量地分析一张指纹图谱的特征，反映出成分的动态变化规律。
中药指纹图谱色谱峰的特征还可用信息熵、信息量进行表征，色谱峰“出现”与“不出现”可用信息量ΔSiq表示，为式(4)。
Wi为第i峰的峰面积百分比，W0为总含量或单位投料量，AT为总响应面积。其中信息熵为式(5)。
因此可用中药指纹图谱的总量统计矩参数及信息熵、信息量来表征指纹图谱特征中药指纹图谱整合前后新指纹图谱的差异。
所述(2)中的中药成分群按“印迹模板”簇状修饰，体现在色谱学的色谱峰出现匹配频数对保留时间呈凸凹状分布，可通过各时间段的色谱峰出现的匹配频数进行按统计学划分，确定成分群“印迹模板”的数目是指将同一中药的多批次指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价***进行分析划分，具体做法是：
将同一中药的S个样品的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价***，进行校正、匹配和数据导出，获得总色谱峰数Sp，各色谱峰的保留时间、各样本峰面积、对照指纹图谱峰面积、保留时间RSD、峰面积RSD和匹配数Np，其中匹配数就是“印迹模板”成分簇对应一定保留时间共同出现色谱峰的数目，由中药色谱指纹图谱相似度评价***给出。可先对所纳入的指纹图谱的匹配频数进行统计分析，求算平均匹配频数和标准差，设定置信系数，按式(6)计算出划成“印迹模板”成分匹配频数的最低界值，排序取大于该界值的匹配频数的成分峰为共有“印迹模板”数，获得成分簇“印迹模板”总数目。
式中Npc为划作“印迹模板”所需最低匹配频数的色谱峰，计算大于等于Npc的色谱峰数N即为“印迹模板”数，是匹配频数的平均值，t(α,ν)为置信度为1-α，自由度ν(总匹配峰数目-1)对应的t界值，SD为匹配频数的标准差。
由式(6)可以获得置信度为1-α下的匹配后色谱峰数目为1+ν时的“印迹模板”对应的总色谱峰数目N，若Npc≥S，则Npc以样本数S为准计算总色谱峰数目N。
置信度为1-α常取95％，99％，对应置信系数α单侧取2.5％或双侧0.05％，以上划出的成分簇“印迹模板”数目受到样本数S和匹配后整体相似程度的影响，当样本数S和匹配后指纹图谱的相似度确定，其成分簇“印迹模板”的数目与之对应。
所述(3)中的中药指纹图谱“印迹模板”成分群簇间可采用段带匹配频数统计学进行成分簇归属的划分，获得各成分簇的“印迹模板”归属是指已划分好的成分簇“印迹模板”间的成分归属可采用保留时间的匹配频率统计平均值进行界线划分，小于界值的可划归保留时间小的成分簇“印迹模板”，大于界值的可划归保留时间大的成分簇“印迹模板”；若等于界值的按最后保留时间末尾数字性质，奇数的划归小于界值保留时间的成分簇“印迹模板”；偶数的划归大于界值保留时间的成分簇“印迹模板”。具体做法是：
对Npc1、Npc2、Npc2……Npci……Npcn的N个按色谱峰保留时间排序的“印迹模板”的成分簇间界线可按匹配频数保留时间统计法进行划分，按式(7)计算Npc1、Npc2间成分簇划分的保留时间界值。
式中tRpc1为Npc1、Npc2两“印迹模板”成分簇划分时的保留时间，tpc1为Npc1“印迹模板”所对应匹配色谱峰的保留时间，tpc2为Npc2“印迹模板”所对应匹配色谱峰的保留时间，Np,j为介于等于Npc1、Npc2两“印迹模板”的j成分的匹配频率，tR,j为介于等于Npc1、Npc2两“印迹模板”的j成分的保留时间。
同理可划分Npci、Npci两“印迹模板”成分簇划分时的保留时间，为式(8)。
式中tRpci为Npci、Npc(i+1)两“印迹模板”成分簇划分时的保留时间，tpci为Npci“印迹模板”所对应匹配色谱峰的保留时间，tpc(i+1)为Npc(i+1)“印迹模板”所对应匹配色谱峰的保留时间，Np,j为介于等于Npci、Npc(i+1)两“印迹模板”的j成分的匹配频率，tR,j为介于等于Npci、Npc(i+1)两“印迹模板”的j成分的保留时间。
将Npci、Npc(i+1)间的各成分色谱峰的保留时间tR,j与tRpci比较，小于tRpci的划归Npci成分簇“印迹模板”，大于tRpci的划归Npc(i+1)成分簇“印迹模板”；若等于tRpci，则根据tR,j的未端数字，奇数的划归Npci成分簇“印迹模板”；偶数划归Npc(i+1)成分簇“印迹模板”。
所述(4)中药指纹图谱“印迹模板”成分群簇可采用段带匹配频数统计学计算新的保留时间，加合各成分簇的面积作为新的峰面积是对已划归好“印迹模板”的成分簇进行匹配频数的保留时间统计平均值计算，以此作为成分簇“印迹模板”的新保留时间，而各成分色谱峰的面积总和为成分簇“印迹模板”的新面积，从而将传统成分色谱峰转变成以成分簇“印迹模板”表征的新型指纹图谱。
根据式(6)-式(8)将匹配后的指纹图谱进行“印迹模板”和成分簇归属的确定，再根据各参数的性质按式计算以成分簇“印迹模板”作为物质基础“单元”的色谱学参数。
对于保留时间、调整保留时间、相对保留时间等强度性质的参数可按匹配频数统计平均法进行计算，Npci“印迹模板”成分簇的新保留时间按式(9)。
式中tRpi为Npci成分簇“印迹模板”的新保留时间，tRpc(i-1)为tRpci与第i-1位成分簇“印迹模板”的保留时间界值，tRpci为tRpci与第i+1位成分簇“印迹模板”保留时间界值，Np,j为介于tRpc(i-1)、tRpci两保留时间界值的色谱峰匹配频数，tR,j为介于tRpc(i-1)、tRpci两保留时间界值的色谱峰保留时间。
对于色谱峰峰面积、峰高等容量性质的参数可按加法进行计算，Npci“印迹模板”成分簇的新峰面积按式(10)。
式中ARpi为Npci成分簇“印迹模板”的新色谱峰峰面积，tRpc(i-1)为tRpci与第i-1位成分簇“印迹模板”的保留时间界值，tRpci为tRpci与第i+1位成分簇“印迹模板”保留时间界值，AP,j是介于tRpc(i-1)与tRpci保留时间的色谱峰面积。
所述(5)中的经中药成分簇“印迹模板”整合表征的新指纹图谱保证了原指纹图谱的总量统计矩性质和信息熵、信息量的变异性质是指按匹配频数整合的新型指纹图谱，整合原理体现频数的统计性，也就是“印迹模板”修饰成成分概率的统计性，表现在成分在指纹图谱色谱峰保留时间对含量分布的概率性，与总量统计矩的原理性质一样，故原指纹图谱的总量统计矩分析性质不变，而信息熵、信息量因峰数改变会产生变化，但样品批间的变异性不变。
从式(6)—式(10)式的计算原理可以看出，成分簇“印迹模板”的确定、成分的划归和新色谱峰参数的计算都是基于匹配频数的统计学计算而获得的结果，而匹配频数的大小又决定于原色谱峰的峰面积，因此新色谱参数的频数统计计算结果与以色谱峰统计计算的面积的性一样，因此匹配频数统计法获得的新指纹图谱的总量统计矩参数，与原指纹图谱获得的总量统计矩参数一样，但信息熵、信息量因峰数变化而变化。
所述(6)经中药成分簇“印迹模板”整合表征的指纹图谱可极大整合降低物质基础表征的单元数是指按匹配频数整合，以成分簇“印迹模板”的新指纹图谱的峰数极大降低，以此作为物质基础研究的单元数极大地降低。
由式(8)-式(9)可知，色谱峰按“印迹模板”特征进行整合，根据置信度1-α的要求，小于1-α出现的概率的色谱峰都会被整合，因此很多含量低的，由“印迹模板”随机修饰的成分会被整合到母“印迹模板”之中，可以此作物质基础研究单元进行中药理论、生产和应用研究。
所述(6)中的诸技术综合运用于指纹图谱成分簇“印迹模板”归属确定，可极大地降低物质基础表征单元，降低中药研究、生产与应用过程中的困难，解决中药指纹图谱色谱峰如何整合表征的“卡脖子”难题是指采用以上中药指纹图谱的匹配频数统计法划归的成分“印迹模板”构成的新型指纹图谱，可衔接原指纹图谱测定方法，保留了原指纹图谱总量统计矩分析的性质，保留了原指纹图谱信息熵、信息量的变异性分析特征，然而成分簇却是体现生物超分子原理的“印迹模板”成簇聚集，以此作为物质基础“单元”进行分析、评价、药理、毒性、药性、药剂、炮制、鉴定等中药研究，以及中医研究可极大地降低中医药理论、产业与应用研究的难度，从擅变的成分中找到稳定的“印迹模板”物质基础，解决中医药现代化研究的物质基础表征难题。
所述(7)中基于色谱峰匹配频数法整合成的新指纹图谱用于中药研究、生产和应用还包括其产品说明书的制订，该说明书标明了匹配频数整合方法等技术信息是指在以本技术进行中药研究获得的产品说明书、包装材料与宣传材料中，除按正常标注要求外，还按中药指纹图谱色谱频数统计的中药“印迹模板”划分和整合的信息，如匹配频数、匹配频数保留时间、匹配频数总面积、匹配频数色谱峰信息等。
(8)运用本方法进行指纹图谱“印迹模板”成分簇划分整合所产生的产品，包括体现在“印迹模板”频数匹配特征的色谱分析学上可接受的形式，如色谱分析***、计算软件、色谱柱、试剂和用于“印迹模板”确定的对照品等；
(9)其中药产品标明了指纹图谱色谱峰匹配频数等技术等的综合信息是指除按中药产品正常要求标明外，还按中药超分子“印迹模板”色谱峰匹配频数统计技术标明了客体成分色谱峰匹配频数和以匹配频数获得的统计参数，如新指纹图谱保留时间、调整保留时间、相对保留时间、峰面积、峰高等。
实施例1：丹膝颗粒药材饮片及制剂的指纹图谱及色谱峰匹配频数统计整合前后的指纹图谱特征及其变异性比较研究
1.处方和制法
(1)标准处方：丹参500g，牛膝400g，天麻100g，牡丹皮334g，赤芍400g，川芎167g，生地黄400g，淫羊藿300g，桑寄生400g，栀子200g，决明子200g，火麻仁200g
(2)制法：以上十二味，丹参、牛膝、牡丹皮、川芎、火麻仁粉碎成粗粉，加10倍量的70％乙醇回流提取二次，每次1小时，滤过，滤液合并，回收乙醇并浓缩至生药质量浓度为1.05～1.15(60℃)的清膏，备用；药渣与其余生地黄等七味加水煎煮二次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.15(60℃)的清膏，与上述清膏合并，浓缩至相对密度为1.20～1.25(20℃)的浸膏生，加糊精适量，制成颗粒，干燥，制成1000g，即得。
2.丹膝颗粒单味药材(饮片)及制剂指纹图谱的建立
2.1实验材料
Acquity UPLC H-Class型超高效液相色谱仪(美国沃特世公司)，RE-2000A旋转蒸发器(巩义市中天仪器科技有限公司)，SHB-IIIA循环水式多用真空泵(北京市中兴伟业仪器有限公司)，ZDHW调温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)，XY-500A高速多功能粉碎机(浙江省永康市松青五金厂)，YHC-A6英衡精密电子秤(哈尔滨众汇衡器有限公司)，HH数显恒温水浴锅(金坛市金城国胜实验仪器厂)，MS205DU电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，SB-5200DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，H1850R型台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，EKup-II-20T超纯水机(长沙市科临电子科技有限公司)
对照品购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均大于98％，包括芍药苷(X12A8C33672)、丹参酮ⅡA(Y16M10C88487)、丹酚酸B(P20J10F93457)、天麻素(T10M9F55562)、阿魏酸(L03A9D57744)、蜕皮激素(TO2A9F57640)、丹皮酚(L15D9D77791)、橙黄决明素(P07S11F122784)、川芎嗪(KJ0622CA14)、大黄酚(T29D10F107203)、淫羊藿苷(T05D9B76755)、槲皮素(S14J10Y79596)、栀子苷(C01J10Y91727)、梓醇(Y26F11Y17148)。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的根及根茎；牛膝为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根；天麻为兰科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥块茎；牡丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮；赤芍为毛莨科植物芍药Paeonia lactlora Pall.的干燥根茎；川芎为伞形科植物川芎Iigusticumchuanxiong Hort.的干燥根；地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根；淫羊藿为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornum Maxim.的干燥叶；桑寄生为桑寄生科植物桑寄生Taxillus chinensis(DC.)Danser的干燥带叶茎枝；栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实；决明子为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.干燥成熟种子；火麻仁为桑科植物***Cannabis sativa L.的种仁。上述药材每产地各5批，购于湖南中医药大学含浦校区周边药店及由本课题组成员购买于原产地，均由本校药学院中药炮制教研室石继连教授按2020版《中国药典》(一部)有关项下进行鉴别，均符合规定，具体信息见表1，并按丹膝颗粒制法要求进行炮制成饮片。丹膝颗粒由九芝堂股份有限公司提供，按2020版《中国药典》(一部)丹膝颗粒制法有关项下进行生产，共15批，批号分别为20190305、20190120、20190105、20190122、20190401、20190606、20190503、20190817、20190705、20190909、20190907、20190920、20190921、20191212、20190704。
表1丹膝颗粒中各药材的产地信息
2.2样品的制备与测定
2.2.1样品的制备
单味药材(饮片)供试液：取单味药材(饮片)各10g，丹参、牛膝、牡丹皮、川芎、火麻仁粉碎成粗粉，加10倍量的70％乙醇回流提取二次，每次1小时，滤过，滤液合并，回收乙醇并浓缩至生药质量浓度为1g/mL(60℃)的清膏，备用；上述各药渣及其余生地黄等各七味药材加10倍量水煎煮二次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并滤液，滤过，滤液浓缩至生药质量浓度为1g/mL(60℃)的清膏，与上述各清膏合并，浓缩至生药质量浓度为0.5g/mL(60℃)的清膏，取2ml，挥干溶剂，加入50％甲醇复溶，定容至5ml，超声10min，12000r/min,4℃离心15min,取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，得全方药材供试品溶液。
丹膝颗粒制剂供试液：取丹膝颗粒样品适量，研细，取粉末约0.25g，精密称定，置锥形瓶中，加入适量50％甲醇，定容至5mL，称定质量；超声(功率300W，频率40kHz)30min，放冷；再次称定质量，用50％甲醇补足减失的质量，摇匀，12000r/min,4℃离心15min,取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
混合对照品溶液：取芍药苷、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、天麻素、阿魏酸、蜕皮激素、丹皮酚、橙黄决明素、川芎嗪、大黄酚、淫羊藿苷、栀子苷、槲皮素、梓醇适量，精密称定置于5mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成各对照品储备液。分别精密吸取上述对照品储备液适量，充分混合后加甲醇定容，制成浓度分别为0.081、0.115、0.123、0.547、0.043、0.108、0.263、0.255、0.448、0.408、0.255、0.333、0.127、0.553mg/mL的混合对照品溶液，过0.22μm微孔滤膜，即得。
2.2.2样品的测定条件
色谱条件：ACQUITY UPLC HSS色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，柱温30℃，流速0.4mL·min-1，检测波长240nm，进样量3μL，流动相A为0.1％磷酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序为0～4min，4.5％B；4～8min，4.5％～9.0％B；8～10min，9％～11％B；10～12min，11％～14％B；12～16min，14％～18％B；16～19min，18％～22％B；19～24min，22％～27％B；24～29min，27％～32％B；29～40min，32％～45％B；40～45min，45％～63％B；45～50min，63％～81％B；50～53min，81％～90％B；53～55min，90％～0％B。
3.实验结果
3.1 12味药材及丹膝颗粒剂的指纹图谱按上述色谱条件，各药材、制剂、混合对照品及50％甲醇各进样3μL，得指纹图谱，如图1。得15批各药材、制剂的指纹图谱，如图2。
3.2方法学考察
3.2.1线性试验：丹酚酸B的线性范围在0.246～1.23mg·mgL-1(R＝0.9953)；丹参酮IIA的线性范围在0.23-1.15mgL-1(R＝0.9984)；蜕皮激素的线性范围在0.216-1.08mgL-1(R＝0.9997)；芍药苷的线性范围在0.162-0.81mgL-1(R＝0.9954)；川芎嗪的线性范围在0.896-4.48mgL-1(R＝0.9990)；阿魏酸的线性范围0.086-0.43mgL-1(R＝0.9976)；栀子苷的线性范围在0.666-3.33mgL-1(R＝0.9985)；槲皮素的线性范围在0.254-1.27mgL-1(R＝0.9989)；橙黄决明素的线性范围在0.51-2.55mgL-1(R＝0.9981)；大黄酚的线性范围在0.816-4.08mgL-1(R＝0.9985)，证明成分的线性关系良好。
3.2.2精密度试验：精密取同一供试品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，根据所得指纹图谱计算总量统计矩、信息熵、信息量参数，其峰数的RSD为0.47％，总量零阶矩的RSD为0.35％，总量一阶矩的RSD为0.16％，总量二阶矩的RSD为0.46％，信息熵的RSD为0.09％，信息量的RSD为0.39％，结果表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的检测要求。
3.2.3重复性考察：取同一批样品，按上述方法制备6份供试液，按上述色谱条件测定指纹图谱，计算总量统计矩、信息熵、信息量参数，其峰数的RSD为2.92％，总量零阶矩的RSD为1.47％，总量一阶矩的RSD为1.28％，总量二阶矩的RSD为1.12％，信息熵的RSD为0.66％，信息量的RSD为1.25％，表明试验重复性良好。
3.2.4稳定性试验：取同一份供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，12，24h进样，记录色谱图，计算总量统计矩、信息熵、信息量参数，其峰数的RSD为1.49％，总量零阶矩的RSD为0.24％，总量一阶矩的RSD为0.16％，总量二阶矩的RSD为0.94％，信息熵的RSD为0.28％，信息量的RSD为0.36％，表明样品稳定性良好。
3.3指纹图谱色谱峰的“印迹模板”划分及成分簇的整合
成分簇“印迹模板”的匹配频数界值确定：先向中药色谱指纹图谱相似度评价***纳入15批HPLC指纹图谱测定样品，经校正、匹配和数据导出，获得总色谱峰数Sp，各色谱峰的保留时间、各样本峰面积、对照指纹图谱峰面积、保留时间RSD、峰面积RSD和匹配数Np。以15批丹参样品为例，其相关数据列于表2。先对表中的指纹图谱的匹配频数NP进行统计分析，求算平均匹配频数为8.087；标准差为4.140，设定置信系数为0.95，按自由度ν为3146-1＝3145，查得t(α,ν)为1.96，由式(6)计算出划成“印迹模板”成分匹配频数的最低界值为16.202，由于最大匹配频数为15，故NPC为15。将匹配频数大于或等于15的色谱峰作为“印迹模板”划分界值，从389个匹配频数峰SP中确定了Npc为57个“印迹模板”成分簇。
成分簇“印迹模板”间保留时间界值的确定：按式(7)或(8)进行两两“印迹模板”成分簇归属划界线。对于样品S1，对NPC1、NPC2进行tRpc1计算，得0.8472min，故从匹配色谱峰Sp4、Sp5之间划定界线。
由于NPc2、NPc3对应的匹配色谱峰Sp6、Sp7的匹配频数都为15，故NPC2、NPC3的tRpc2界线可直接从Sp6、Sp7中划开。
同理可算得tRpc3为2.106min，…，这样可以算得tRpc56的界线值，划定Npc56、Npc57的界线。
成分簇“印迹模板”的新色谱参数据的计算：按式(9)、(10)进行成分簇“印迹模板”成色谱参数的整合计算。对于保留时间等强度性质的参数可按匹配频数统计平均法，如式(9)进行计算，NPC1“印迹模板”成分簇的新保留时间为：
S2～S15的NPC1“印迹模板”成分簇的新保留时间均为0.6495min。
对于色谱峰峰面积等容量性质的参数可按加法进行计算，S1样品的NPC1“印迹模板”成分簇的新峰面积为：
同理S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15的NPC1“印迹模板”成分簇的新峰面积分别为557.084mAU·sec、467.443mAU·sec、501.573mAU·sec、603.345mAU·sec、529.982mAU·sec、690.026mAU·sec、579.958mAU·sec、566.344mAU·sec、489.44mAU·sec、490.87mAU·sec、463.962mAU·sec、565.747mAU·sec、497.488mAU·sec、564.567mAU·sec。
其它色谱学参数，如峰高、容量因子、对称因子、理论塔板数、理论塔板高度可结合参数的性质和色谱学的原理进行整合计算。
通过以上整合，15批丹膝颗粒由原匹配时产生的389个峰变化57个峰。新指纹图谱的保留时间与峰面积列入表3。
3.4指纹图谱总量统计矩参数及信息熵、信息量的计算：按式(1)至式(5)公式计算获得整合前后的指纹图谱总量统计矩参数及信息熵、信息量，结果列于表4。
对其进行配对t检验，其t值和t分布累积概率1-α/2见于表5，由表5可知12味药材和丹膝颗粒的HPLC指纹图谱匹配频数整合前后的总量统计矩参数的1-α(置信度)都小于0.95，而峰数目、信息熵、信息量的1-α(置信度)均大于0.99。
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表4匹配频数统计法整合15批丹膝颗粒药材及制剂HPLC指纹图谱的特征性比较(n＝15)/>
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表5匹配频数统计法整合15批丹膝颗粒药材及制剂HPLC指纹图谱前后特征参数的t值和t分布累积概率
注：t(0.05,14)＝2.145；t(0.01,14)＝2.977；1-α＝0.95(0.99)；1-α/2＝0.975(0.995)
12批药材及丹膝颗粒指纹图谱匹配频数整合前后总量统计矩参数、信息熵与信息量的RSD值列于表6。
表6中峰数目整合前后的RSD变化很大，整合前各批次峰数目不等，RSD在2％至10％变化，整合后各批次峰数目相同，RSD为0。而总量统计矩和信息熵、信息量的RSD前后相差不大。先对色谱峰的峰数进行统计分析，可对整合前后的色谱峰数目相减，再进行t检验，得t值为6.933，大于t(0.05,12)的2.179。同法对于总量统计矩参数和信息熵、信息量进行处理，其t值，累积概率1-α/2值列于表7。
表6匹配频数统计法整合15批丹膝颗粒药材及制剂HPLC指纹图谱前后特征参数的RSD(％)
3.5整合前后15批丹膝颗粒的药材及制剂的色谱峰的变异性：对匹配前后指纹图谱色谱峰的RSD进行分析，获得其平均值、方差和变异系数及最大色谱峰面积和最小色谱峰面积，结果列于表8。
表7匹配频数统计法整合15批丹膝颗粒药材及制剂HPLC指纹图谱前后特征参数RSD的t检验给果。
注：t(0.05,12)＝2.179；t(0.01,12)＝3.055；1-α＝0.95(0.99)；1-α/2＝0.975(0.995)
表8匹配频数统计法整合15批丹膝颗粒药材及制剂HPLC指纹图谱整合前后的色谱峰的RSD比较
同法对对表8进行t检测，其t值、累积概率1-α/2值列于表9。
表9匹配频数统计法整合15批丹膝颗粒药材及制剂HPLC指纹图谱前后色谱峰的RSD的t检验给果。
注：t(0.05,12)＝2.179；t(0.01,14)＝3.055；1-α＝0.95(0.99)；1-α/2＝0.975(0.995)
由表9可知只有色谱峰RSD的变异系数没的统计学意义，其它的置信度都在0.95(累积概率0.975)以上，因此匹配频数整合法能显著性地改变色谱峰的变异性，而整体上又能保证“印迹模板”成分簇总量统计矩参数、信息熵与信息量变异性的稳定，不失为中药成分簇整合的良好方法。
本实验根据中医药超分子“气析“理论，结合中药成分簇“印迹模板”在中药指纹图谱上的印迹性表征的凸凹状分布，利用匹配频数来划界确定成分簇“印迹模板”，并计算成分簇“印迹模板”的整合后色谱学参数，通过比较指纹图谱前后总量统计矩参数、信息熵与信息量的参数变化，从中发现了基于匹配频数整合成新指纹图谱能保证原总量统计矩参数稳定，可极大地改变峰的数目、信息熵和信息量，然而又不改变其变异性，也就是指纹图谱的特征和样本间的变异不会因匹配频数统计法对成分整合成“印迹模板”成分簇而损失，因些该方法是进行中药指纹图谱整合，获得物质基础单元，以适宜中医药理论、生产与应用研究需要的理想工具。
以上实例已从某些角度证明本专利技术所具有对色谱峰的压缩性和对原指纹图谱特征参数及样本间变异性的保持性，显而易见，通过本发明的不同组合和可视化软件表征，可从全方位实现整合成“印迹模板”成分簇来表征新型指纹图谱和物质基础单元，降低中医药现代化研究的难度。
Claims (6)
1.一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，其特征在于，包括以下步骤：
作为生物巨复超分子体的中药，其成分簇以“印迹模板”的形式体现出中药药性和药效，通过色谱方式来进行指纹图谱色谱峰的统计划分，并以指纹图谱总量统计矩、信息熵和信息量来表征中药的成分种类和含量；
其中中药成分簇的“印迹模板”数目，是以色谱学的色谱峰出现匹配频数对保留时间呈凸凹状分布来确定，通过各时间段的色谱峰出现的匹配频数按统计学划分得到；
中药成分簇的“印迹模板”归属，是对中药指纹图谱“印迹模板”成分群簇间采用段带匹配频数统计学进行成分簇归属的划分得到；
中药指纹图谱“印迹模板”成分簇是采用段带匹配频数统计学计算新的保留时间或强度参数，加合各成分簇的面积或容量参数作为新的峰面积或新容量参数，将传统的中药指纹图谱转变成以成分簇“印迹模板”表征的新型指纹图谱；
所述的进行指纹图谱色谱峰的统计，是采用指纹图谱总量统计矩法进行统计，其中参数包括：
①总量零阶矩为色谱峰面积总量，体现成分群单个与整体的含量；
②总量一阶矩为各色谱峰面积的统计平均保留时间，体现成分群的单个印迹性与总量平均印迹性；
③总量二阶矩为各色谱峰面积的统计平均保留时间的方差，体现各成分的印迹性离散度和总体成分的印迹性的离散程度；
所述的参数计算包括以下步骤：
总量零阶矩为曲线下的n个色谱峰面积总和AUCT为
总量一阶矩MCRTT，即n个色谱峰的平均保留时间为
总量二阶矩VCRTT，即n个色谱峰的平均保留时间方差为
其中Ai表示第i峰的峰面积，λi表示第i峰的保留时间，σi表示第i峰的保留时间标准差，共有n个色谱峰；其中AUCT用来对中药成分组进行定量分析，表征整体成分的含量变化；MCRTT、VCRTT二参数用于中药指纹图谱的定性分析，表征成分组成即构成比发生变化，则通过三个参数就能定性定量地分析一张指纹图谱的特征，反映出成分的动态变化规律；
所述的信息熵和信息量分别为：
其中ΔSiq为信息量，Wi为第i峰的峰面积百分比，W0为总含量或单位投料量，AT为总响应面积；
其中ΔSie为信息熵；
所述的“印迹模板”的数目确定包括以下步骤：
将同一中药的S个样品的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价***，进行校正、匹配和数据导出，获得总色谱峰数Sp，各色谱峰的保留时间、各样本峰面积、对照指纹图谱峰面积、保留时间RSD、峰面积RSD和匹配数Np，其中匹配数就是“印迹模板”成分簇对应一定保留时间共同出现色谱峰的数目，由中药色谱指纹图谱相似度评价***给出，通过先对所纳入的指纹图谱的匹配频数进行统计分析，求算平均匹配频数和标准差，设定置信系数，按下式计算出划成“印迹模板”成分匹配频数的最低界值，排序取大于该界值的匹配频数的成分峰为共有“印迹模板”数，获得成分簇“印迹模板”总数目。
式中Npc为划作“印迹模板”所需最低匹配频数的色谱峰，计算大于等于Npc的色谱峰数N即为“印迹模板”数，是匹配频数的平均值，t(α,ν)为置信度为1-α，自由度ν对应的t界值，ν为总匹配峰数目-1，SD为匹配频数的标准差；
由式(6)可以获得置信度为1-α下的匹配后色谱峰数目为1+ν时的“印迹模板”对应的总色谱峰数目N，若Npc≥S，则Npc以样本数S为准计算总色谱峰数目N；
所述的中药指纹图谱“印迹模板”成分群簇间采用段带匹配频数统计学进行成分簇归属的划分，包括以下步骤：
对Npc1、Npc2、Npc2……Npci……Npcn的N个按色谱峰保留时间排序的“印迹模板”的成分簇间界线按匹配频数保留时间统计法进行划分，按下式计算Npc1、Npc2的成分簇划分的保留时间界值：
其中tRpc1为Npc1、Npc2两“印迹模板”成分簇划分时的保留时间，tpc1为Npc1“印迹模板”所对应匹配色谱峰的保留时间，tpc2为Npc2“印迹模板”所对应匹配色谱峰的保留时间，Np,j为介于等于Npc1、Npc2两“印迹模板”的j成分的匹配频率，tR,j为介于等于Npc1、Npc2两“印迹模板”的j成分的保留时间；
则有Npci、Npci两“印迹模板”成分簇划分时的保留时间为
其中tRpci为Npci、Npc(i+1)两“印迹模板”成分簇划分时的保留时间，tpci为Npci“印迹模板”所对应匹配色谱峰的保留时间，tpc(i+1)为Npc(i+1)“印迹模板”所对应匹配色谱峰的保留时间，Np,j为介于等于Npci、Npc(i+1)两“印迹模板”的j成分的匹配频率，tR,j为介于等于Npci、Npc(i+1)两“印迹模板”的j成分的保留时间；
将Npci、Npc(i+1)间的各成分色谱峰的保留时间tR,j与tRpci比较，小于tRpci的划归Npci成分簇“印迹模板”，大于tRpci的划归Npc(i+1)成分簇“印迹模板”；若等于tRpci，则根据tR,j的未端数字，奇数的划归Npci成分簇“印迹模板”；偶数划归Npc(i+1)成分簇“印迹模板”；
中药指纹图谱“印迹模板”成分簇采用段带匹配频数统计学计算新的保留时间或强度参数包括以下步骤：
对于包括保留时间、调整保留时间、相对保留时间在内的强度性质参数按匹配频数统计平均法进行计算，其中Npci“印迹模板”成分簇的新保留时间通过下式计算：
式中tRpi为Npci成分簇“印迹模板”的新保留时间，tRpc(i-1)为tRpci与第i-1位成分簇“印迹模板”的保留时间界值，tRpci为tRpci与第i+1位成分簇“印迹模板”保留时间界值，Np,j为介于tRpc(i-1)、tRpci两保留时间界值的色谱峰匹配频数，tR,j为介于tRpc(i-1)、tRpci两保留时间界值的色谱峰保留时间；
对于包括色谱峰峰面积、峰高在内的容量性质的参数则按加法进行计算，Npci“印迹模板”成分簇的新峰面积按下式计算：
式中ARpi为Npci成分簇“印迹模板”的新色谱峰峰面积，tRpc(i-1)为tRpci与第i-1位成分簇“印迹模板”的保留时间界值，tRpci为与tRpci第i+1位成分簇“印迹模板”保留时间界值，AP,j是介于tRpc(i-1)与tRpci保留时间的色谱峰面积。
2.根据权利要求1所述的一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，其特征在于：
所述的体现为生物巨复超分子体的中药，是指在自然界的生物进化过程中，生命体通过自组织、自组装、自识别与自复制，在众多小分子模板基础上合成的生物超分子体，其客体与人体经络脏腑按“印迹模板”产生“气析”作用，呈现中药药性和药效，并受到药材遗传多态性、环境和制技术的影响，最终反映到中药产品的种类和含量的指纹图谱色谱峰的变化上。
3.根据权利要求1所述的一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，其特征在于，中药成分簇的“印迹模板”数目，是通过各时间段的色谱峰出现的匹配频率进行按统计学划分，确定成分群“印迹模板”的数目是指按生物超分子“印迹模板”修饰而成的中药，呈现同母核群生特征，同一“印迹模板”修饰的成分群，其母核相似，其化学结构相似，理化性质相近，色谱学行为相似，保留时间向最接近“印迹模板”结构特征的成分靠近，以修饰成最接近“印迹模板”结构特征的成分的几率较大，出现的频率较高，而修饰成远离“印迹模板”结构特征的成分的几率较小，出现的频率较小，最终在色谱学上表现出以最接近“印迹模板”结构特征成分为中心的簇状分布特征和以指纹图谱色谱峰对保留时间的凸凹状分布；通过对指纹图谱色谱峰匹配时共同出现的频数进行统计学分析，取频数的均数与一定置信度下的统计量乘以标准差的积之和为界值确定“印迹模板”数目。
4.根据权利要求1所述的一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，其特征在于，所述中药成分簇的“印迹模板”归属，是对中药指纹图谱“印迹模板”成分群簇间采用段带匹配频数统计学进行成分簇归属的划分，已划分好的成分簇“印迹模板”间的成分归属是采用色谱中保留时间的匹配频数统计平均值进行划分，小于平均值的划归保留时间小的成分簇“印迹模板”，大于平均值的划归保留时间大的成分簇“印迹模板”；等于平均值的则根据保留时间的小数点后的数字进行划归，为奇数的划归保留时间小的成分簇“印迹模板”；为偶数的划归保留时间大的成分簇“印迹模板”。
5.根据权利要求1所述的一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合方法，其特征在于，中药指纹图谱“印迹模板”成分群簇采用段带匹配频数统计学计算新的保留时间或强度性参数，加合各成分簇的面积或容量性参数作为新的峰面积或新容量性参数，是对已划归好“印迹模板”的成分簇进行匹配频数的保留时间或强度性参数统计平均值计算，以此作为成分簇“印迹模板”的新保留时间或新强度性参数，而各成分色谱峰的面积或容量性参数的总和为成分簇“印迹模板”的新面积或新容量性参数，从而将传统成分色谱峰转变成以成分簇“印迹模板”表征的新型指纹图谱。
6.一种基于指纹图谱色谱峰匹配频数统计的中药“印迹模板”成分簇划归整合产品，其特征在于，基于如权利要求1-5任一所述的方法，所得到的以下产品：
中药产品、以及体现在“印迹模板”频数匹配特征的色谱分析学上的形式所得到的产品，包括色谱分析***、计算软件、色谱柱、试剂和用于确定“印迹模板”的对照品；
其中药产品标明了包括指纹图谱色谱峰匹配频数在内的综合信息，除按中药产品正常要求标明外，还按中药超分子“印迹模板”色谱峰匹配频数统计技术标明了客体成分色谱峰匹配频数和以匹配频数获得的统计参数，包括新指纹图谱保留时间、调整保留时间、相对保留时间、峰面积和峰高。
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| CN1667411A (zh) * | 2004-03-10 | 2005-09-14 | 徐自升 | 通用中草药、中成药、中药保健品色谱指纹图谱制定方法 |
| CN104459003A (zh) * | 2014-12-16 | 2015-03-25 | 湖南汉森制药股份有限公司 | 缩泉制剂标准指纹图谱及特征图谱的构建方法及质量检测方法 |
| CN112710765A (zh) * | 2019-10-24 | 2021-04-27 | 泰州医药城国科化物生物医药科技有限公司 | 一种栀子药材的指纹图谱检测方法及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 基于指纹图谱段带总量统计矩法和信息熵的桑源药材成分比较分析研究;朱志飞 等;中国中药杂志;第46卷(第10期);2547-2555 * |
| 鱼腥草挥发油体外代谢通用客体"印迹模板"研究;周燕子;中草药;第52卷(第1期);75-81 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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