CN106018576B - 一种妇科再造丸uplc指纹图谱的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种妇科再造丸UPLC指纹图谱的建立方法。该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣,具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点;用该方法还能较为全面地反映妇科再造丸中所含化学成分的种类与数量,进而对其质量进行整体描述和评价,可将妇科再造丸质量与其药效真正结合起来,有助于阐明其作用机理为本妇科再造丸的技术提升与深度开发提供了依据。且用该方法检测到的妇科再造丸指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中,基线较平稳,分离度、峰形和柱效好。
Description
技术领域
本发明涉及一种妇科再造丸UPLC指纹图谱的建立方法,属于药品技术的领域。
背景技术
妇科再造丸妇科再造丸是著名的治疗妇科病的药物,由42味地道药材组成,具有养血调经,补益肝肾,暖宫止痛的功效,用于月经先后不定期,带经日久,淋漓出血,痛经,带下等症。
妇科再造丸由传统中药古方发展而来,受当时科研水平限制,其质量标准起点不够高,对药理药效等基础研究较为有限。为进一步探索其作用机理与药用基础,确保产品安全有效、质量可控,迫切需要运用现代医药科研手段对本产品进行质量标准的提升与药理药效实验研究。
中药指纹图谱是一种综合的,可量化的鉴定手段,它是建立在中药化学成分***研究的基础上,主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系,因此评价其质量应采用与之相适应的,能提供丰富鉴别信息的检测方法,建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量,进而对药品质量进行整体描述和评价。在此基础上,如果进一步开展谱效学研究,可使中药质量与其药效真正结合起来,有助于阐明中药作用机理。目前,尚无妇科再造丸超高液指纹图谱研究工作的报道。
发明内容
本发明目的在于,提供一种妇科再造丸UPLC指纹图谱的建立方法。该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣,具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点;用该方法还能较为全面地反映妇科再造丸中所含化学成分的种类与数量,进而对其质量进行整体描述和评价,可将妇科再造丸质量与其药效真正结合起来,有助于阐明其作用机理为本妇科再造丸的技术提升与深度开发提供了依据。且用该方法检测到的妇科再造丸指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中,基线较平稳,分离度、峰形和柱效好。
为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案实现:一种妇科再造丸UPLC指纹图谱的建立方法,所述妇科再造丸由按重量份计算的酒当归60-70份、醋炙香附60-70份、白芍40-50份、熟地黄15-30份、阿胶5-20份、茯苓60-70份、党参15-30份、黄芪15-30份、山药25-40份、白术10-20份、酒蒸女贞子40-50份、醋炙龟甲25-40份、山茱萸15-30份、续断15-30份、盐杜仲15-30份、肉苁蓉5-20份、覆盆子10-20份、鹿角霜2-10份、川芎40-50份、丹参15-30份、牛膝10-20份、益母草15-30份、延胡索10-20份、油酥三七2-10份、醋炙艾叶40-50份、小茴香15-30份、藁本15-30份、海螵蛸25-40份、醋炙地榆25-40份、益智5-20份、泽泻15-30份、醋炙荷叶10-20份、秦艽15-30份、地骨皮15-30份、白薇40-50份、椿皮25-40份、琥珀2-10份、酒黄芩25-40份、酸枣仁5-20份、制远志10-20份、陈皮25-40份和甘草15-30份按下述方法进行制备而成:以上四十二味,黄芪、盐杜仲、熟地黄、续断、秦艽、肉苁蓉、牛膝、地骨皮加水煎煮2次,每次2h合并煎煮液,滤过,滤液浓缩;领取阿胶适量水烊化与上述浓缩液合并,浓缩至相对密度为1.10(80℃)的浸膏,其余三十二味粉碎成细粉,过筛,混匀,用上述浸膏泛丸,制成浓缩丸,60-80℃干燥,包糖衣,打光,即得。
所述UPLC指纹图谱的建立方法,包括以下步骤:
(1)对照品溶液的制备:精密称取橙皮苷、黄芩苷适量,放入25mL棕色容量瓶中,加入甲醇溶解,并稀释至刻度,摇匀,制成橙皮苷0.30-0.45mg·mL-1、黄芩苷0.10-0.35mg·mL-1的对照品溶液,即得;
(2)供试品溶液的制备:取妇科再造丸,粉碎成粉末后,称取0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入55-65%甲醇40-60mL,称定质量,超声提取0.5-1.5h,放冷,再称定质量,用40-60%甲醇补足减失的质量,摇匀,过虑,即得。
(3)色谱条件:色谱柱:ACQUITYUPLC Hss T31.8μm2.1×100mm Column;流动相:0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱;柱温:50℃;流速:0.3mL·min-1;检测波长:280nm;进样量2μL;
(4)指纹图谱的制作:按上述方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下进样,记录谱图得到妇科再造丸的UPLC指纹图谱;
(5)指纹谱图的确认:按照上述提供的方法,对多批次妇科再造丸建立了UPLC指纹图谱,通过分析比较确定了15个共有峰,这些共有峰构成了妇科再造丸的指纹特征,作为妇科再造丸的指纹图谱。
前述的妇科再造丸UPLC指纹图谱的建立方法中,所述对照品溶液这样制备:精密称取橙皮苷、黄芩苷适量,放入25mL棕色容量瓶中,加入甲醇溶解,并稀释至刻度,摇匀,制成橙皮苷0.3452mg·mL-1、黄芩苷0.2204mg·mL-1的对照品溶液,即得。
前述的妇科再造丸UPLC指纹图谱的建立方法中,所述供试品溶液这样制备:取妇科再造丸,粉碎成粉末后,称取0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50mL,称定质量,超声提取1h,放冷,再称定质量,用50%甲醇补足减失的质量,摇匀,过虑,即得。
前述的妇科再造丸UPLC指纹图谱的建立方法中,所述梯度洗脱条件为:0~22min,2~20%B;22~30min,20~28%B;30~36min,28~50%B。
前述的妇科再造丸UPLC指纹图谱的建立方法中,所述15个共有峰,以10号峰黄芪苷为参照峰,其余峰相对保留时间分别为0.098-0.099,0.114-0.18,0.0151,0.246,0.364,0.474,0.817,0.887,0.905,1.081,1.196,1.330,1.464,1.607。
前述的妇科再造丸UPLC指纹图谱的建立方法中,所述流速为0.3mL·min-1;所述检测波长为280nm。
发明人进行了大量的实验,以下是部分实验研究
实验例
1实验材料
ACQUITY型UPLC(Empower3色谱数据工作站,美国Waters公司),AE240型电子分析天平(METTLER公司),TGL-16C型台式离心机(上海安亭科学仪器厂制造),WBZ-2型微波真空干燥机(功率2kw,贵阳新奇微波工业有限责任公司),远红外鼓风快速干燥箱(型号YHG-500-BS-II,加热功率2kw,上海费德试验设备有限公司),超声波清洗器(型号SK8210HP,上海科导超声仪器有限公司)。
妇科再造丸(批次1,批次2,批次3,批次4,批次5,批次6,批次7,批次8,批次9,批次10,20111247,20140172,均由贵阳德昌祥有限公司提供),妇科再造丸湿丸(贵阳德昌祥有限公司提供);橙皮苷(批号C-006-140728),黄芩苷(批号H-016-140729)均购于成都瑞芬思生物科技有限公司,纯度≥98%,甲醇(TEDIA,色谱纯),乙腈(TEDIA,色谱纯),甲酸(CNW,色谱纯);屈臣氏蒸馏水。其他试剂均为分析纯。
2方法
2.1色谱条件
色谱柱:ACQUITY UPLC Hss T31.8μm 2.1×100mm Column;流动相:0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱;柱温:50℃;流速:0.3mL·min-1;检测波长:280nm;进样量2μL。梯度洗脱条件:0~22min,2~20%B;22~30min,20~28%B;30~36min,28~50%B。
2.2对照品溶液的制备
精密称取橙皮苷、黄芩苷适量,放入25mL棕色容量瓶中,加入甲醇溶解,并稀释至刻度,摇匀,制成橙皮苷0.3452mg·mL-1、黄芩苷0.2204mg·mL-1对照品溶液。
2.3供试品溶液的制备
取妇科再造丸粉末0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50mL,称定质量,超声提取1h,放冷,再称定质量,用50%甲醇补足减失的质量,摇匀,过虑,即得。
2.4妇科再造丸UPLC特征图谱测定
2.4.1方法学考察
2.4.1.1精密度试验
取妇科再造丸,上述方法制成供试品溶液,按2.1项下的色谱条件连续进样6次,分别记录图谱的保留时间和峰面积,以黄芩苷作为参照峰,计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积及相似度,结果见表1、表2、表3和图1。结果精密度试验各图谱的相似度结果均大于0.989,相对保留时间的RSD均小于0.18%,相对峰面积的RSD均小于2.25%,说明仪器精密度良好,符合特征图谱要求。
表1精密度试验的相似度比较结果
表2精密度试验相对保留时间
表3精密度试验相对峰面积
2.4.1.2重复性试验
取同一妇科再造丸(批号20140172),按上述方法制成供试品溶液,按照2.3项方法平行制备6份,分别注入UPLC测定,以黄芩苷作为参照峰,计算各色谱峰的相对峰面积与相对保留时间。结果见表3、表4、表5和图2,从,表中可知,6份样品色谱图的相似度达0.997以上,相对峰面积RSD均小于2.91%,相对保留时间的RSD均小于1.69%,表明试验重复性良好,符合特征图谱要求。
表3重复性试验相似度结果
表4重复性试验相对保留时间
表5相对峰面积结果
2.4.1.3稳定性试验
取同一份妇科再造丸供试品溶液,分别在0,2,4,8,12,24h进样,计算各共有峰的相对峰面积与相对保留时间,结果见表6、表7、表8和图3。结果共有峰的相对峰面积RSD均小于1.69%,相对保留时间的RSD均小于2.93%,相似度大于0.996,说明样品在24h内稳定。
表6稳定性试验相似度比较结果
表7稳定性试验相对保留时间
表8稳定性试验相对峰面积
2.4.2妇科再造丸UPLC特征图谱的建立
12个批次妇科再造丸样品,编号为S1~S12。分别按照2.3项下方法制备供试品溶液,2.1项下分别进样并记录色谱图。对12批妇科再造丸样品的图谱数据进行处理分析,得到15个共有峰。特征图谱中共有峰编号见图4。将12批样品的特征图谱信号数据分布导入“中药指纹图谱相似度评价软件2004A版”,进行多点校正后生成共有模式。12批样品对照图谱及共有模式见图5。S1~S12批样品的特征图谱相似度结果分别为0.999,0.999,0.999,0.999,0.999,1.000,0.999,0.999,0.999,0.990,0.937,0.978,1.000。
以上试验表明,该测定方法稳定可靠,指纹图谱相对稳定,可以用于控制妇科再造丸的质
与现有技术相比,本发明方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣,具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点;用该方法还能较为全面地反映妇科再造丸中所含化学成分的种类与数量,进而对其质量进行整体描述和评价,可将妇科再造丸质量与其药效真正结合起来,有助于阐明其作用机理,为本妇科再造丸的技术提升与深度开发提供了依据。且用该方法检测到的妇科再造丸指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中,基线较平稳,分离度、峰形和柱效好。
附图说明
图1是精密度试验UPLC特征图谱;
图2是重复性试验UPLC特征图谱;
图3是稳定性试验UPLC特征图谱;
图4是本发明妇科再造丸共有峰的标定图;(9号峰为橙皮苷,10号峰为黄芩苷);
图5是12批妇科再造丸UPLC特征图谱。
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
实施例1:
一种妇科再造丸UPLC指纹图谱的建立方法,
妇科再造丸处方:酒当归65.14g、醋香附65.14g、白芍43.43g、熟地黄21.71g、阿胶10.86g、茯苓65.14g、党参21.71g、黄芪21.71g、山药32.57g、白术16.28g、酒女贞子43.43g、龟甲(醋炙)32.57g、山茱萸21.71g、续断21.71g、盐杜仲21.71g、肉苁蓉10.86g、覆盆子16.28g、鹿角霜5.43g、川芎43.43g、丹参21.71g、牛膝16.28g、益母草21.71g、延胡索16.28g、三七(油酥)5.43g、艾叶(醋炙)43.43g、小茴香21.71g、藁本21.71g、海螵蛸32.57g、地榆(醋炙)32.57g、益智10.86g、泽泻21.71g、荷叶(醋炙)16.28g、秦艽21.71g、地骨皮21.71g、白薇43.43g、椿皮32.57g、琥珀5.43g、酒黄芩32.57g、酸枣仁10.86g、制远志16.28g、陈皮32.57g和甘草21.71g。
妇科再造丸制作工艺:以上四十二味,黄芪、盐杜仲、熟地黄、续断、秦艽、肉苁蓉、牛膝、地骨皮加水煎煮2次,每次2h合并煎煮液,滤过,滤液浓缩;领取阿胶适量水烊化与上述浓缩液合并,浓缩至相对密度为1.10(80℃)的浸膏,其余三十二味粉碎成细粉,过筛,混匀,用上述浸膏泛丸,制成浓缩丸,60-80℃干燥,包糖衣,打光,即得。
所述UPLC指纹图谱的建立方法,包括以下步骤:
(1)对照品溶液的制备精密称取橙皮苷、黄芩苷适量,放入25mL棕色容量瓶中,加入甲醇溶解,并稀释至刻度,摇匀,制成橙皮苷0.3452mg·mL-1、黄芩苷0.2204mg·mL-1的对照品溶液,即得。
(2)供试品溶液的制备:取妇科再造丸,粉碎成粉末后,称取0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50mL,称定质量,超声提取1h,放冷,再称定质量,用50%甲醇补足减失的质量,摇匀,过虑,即得。
(3)色谱条件:色谱柱:ACQUITYUPLC Hss T31.8μm2.1×100mm Column;流动相:0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱;柱温:50℃;流速:0.3mL·min-1;检测波长:280nm;进样量2μL;所述梯度洗脱条件为:0~22min,2~20%B;22~30min,20~28%B;30~36min,28~50%B;
(4)指纹图谱的制作:按上述方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下进样,记录谱图得到妇科再造丸的UPLC指纹图谱,
(5)指纹谱图的确认:按照上述提供的方法,对多批次妇科再造丸建立了UPLC指纹图谱,通过分析比较确定了15个共有峰,这些共有峰构成了妇科再造丸的指纹特征,作为妇科再造丸的指纹图谱,结果见图4。
Claims (5)
1.一种妇科再造丸UPLC指纹图谱的建立方法,其特征在于:所述妇科再造丸由按重量份计算的酒当归60-70份、醋炙香附60-70份、白芍40-50份、熟地黄15-30份、阿胶5-20份、茯苓60-70份、党参15-30份、黄芪15-30份、山药25-40份、白术10-20份、酒蒸女贞子40-50份、醋炙龟甲25-40份、山茱萸15-30份、续断15-30份、盐杜仲15-30份、肉苁蓉5-20份、覆盆子10-20份、鹿角霜2-10份、川芎40-50份、丹参15-30份、牛膝10-20份、益母草15-30份、延胡索10-20份、油酥三七2-10份、醋炙艾叶40-50份、小茴香15-30份、藁本15-30份、海螵蛸25-40份、醋炙地榆25-40份、益智5-20份、泽泻15-30份、醋炙荷叶10-20份、秦艽15-30份、地骨皮15-30份、白薇40-50份、椿皮25-40份、琥珀2-10份、 酒黄芩25-40份、酸枣仁5-20份、制远志10-20份、陈皮25-40份和甘草15-30份按下述方法进行制备而成:以上四十二味,黄芪、盐杜仲、熟地黄、续断、秦艽、肉苁蓉、牛膝、地骨皮加水煎煮2次,每次2h合并煎煮液,滤过,滤液浓缩;取阿胶适量水烊化与上述浓缩液合并,浓缩至80℃时相对密度为1.10的浸膏,其余味粉碎成细粉,过筛,混匀,用上述浸膏泛丸,制成浓缩丸,60-80℃干燥,包糖衣,打光,即得;
所述UPLC指纹图谱的建立方法,包括以下步骤:
(1)对照品溶液的制备:精密称取橙皮苷、黄芩苷适量,放入25mL棕色容量瓶中,加入甲醇溶解,并稀释至刻度,摇匀,制成橙皮苷0.30-0.45mg·mL-1、黄芩苷0.10-0.35mg·mL-1的对照品溶液,即得;
(2)供试品溶液的制备:取妇科再造丸,粉碎成粉末后,称取0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入55-65%甲醇40-60mL,称定质量,超声提取0.5-1.5h,放冷,再称定质量,用40-60%甲醇补足减失的质量,摇匀,过虑,即得;
(3)色谱条件:色谱柱:ACQUITY UPLC Hss T3 1.8µm 2.1×100mm Column;流动相:A相为0.1%甲酸水溶液;B相为乙腈,梯度洗脱;柱温:50℃;流速:0.2-0.4mL·min-1;检测波长:250-310nm;进样量2μL;所述梯度洗脱条件为:0~22min,2~20%B;22~30min,20~28% B;30~36min,28~50% B;
(4)指纹图谱的制作:按上述方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下进样,记录谱图得到妇科再造丸的UPLC指纹图谱;
(5)指纹谱图的确认:按照上述提供的方法,对多批次妇科再造丸建立了UPLC指纹图谱,通过分析比较确定了15个共有峰,这些共有峰构成了妇科再造丸的指纹特征,作为妇科再造丸的指纹图谱。
2.如权利要求1所述的妇科再造丸UPLC指纹图谱的建立方法,其特征在于:所述对照品溶液这样制备:精密称取橙皮苷、黄芩苷适量,放入25mL棕色容量瓶中,加入甲醇溶解,并稀释至刻度,摇匀,制成橙皮苷0.3452 mg·mL-1、黄芩苷 0.2204 mg·mL-1的对照品溶液,即得。
3.如权利要求1所述的妇科再造丸UPLC指纹图谱的建立方法,其特征在于:所述供试品溶液这样制备:取妇科再造丸,粉碎成粉末后,称取0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50mL,称定质量,超声提取1h,放冷,再称定质量,用50%甲醇补足减失的质量,摇匀,过虑,即得。
4.如权利要求1所述的妇科再造丸UPLC指纹图谱的建立方法,其特征在于:所述15个共有峰,以10号峰黄芪苷为参照峰,其余峰相对保留时间分别为0.098-0.099,0.114-0.18,0.0151,0.246,0.364,0.474 ,0.817,0.887,0.905,1.081,1.196,1.330,1.464,1.607。
5.如权利要求1所述的妇科再造丸UPLC指纹图谱的建立方法,其特征在于:所述流速为0.3mL·min-1;所述检测波长:280nm。
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