CN113156001A - 一种包含当归的中药复方的指纹图谱构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含当归的中药复方的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：取中药复方供试品和对照品进行检测，其中该中药复方由当归、桂枝、甘草、白芍、生姜和大枣组成，其中该对照品为没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸胺和6‑姜辣素，该检测的色谱条件为：采用C₁₈色谱柱，以甲醇或乙腈为流动相A、酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序为：0～20min，5％～12％A；20～90min，12％～85％A；流速为0.8～1.2mL/min；柱温为25～40℃；检测波长为210～330nm；根据检测结果，获得该中药复方的成分信息，或成分及其含量信息。本发明运用高效液相技术，对包含当归的中药复方的化学成分进行了全面***地解析，为质量控制和药效物质基础的深入研究提供了理论依据。

Description

一种包含当归的中药复方的指纹图谱构建方法及其应用

技术领域

本申请涉及中药质量鉴定技术领域，特别是涉及一种包含当归的中药复方的指纹图谱构建方法及其应用。

背景技术

随着我国中药制剂的快速发展，中药制剂的质量管理问题也受到了人们的广泛关注，其质量的优劣会直接影响到医疗质量和患者生命安危。影响中药制剂质量的因素主要包括：(1)原药材的质量，中药材的质量好坏是直接影响中药制剂临床疗效的关键原因之一，由于目前中药材的来源较为复杂，且品种繁多，许多药材市场常常以次充好从中取得大量的经济利益。此外，现今我国药材市场对野生药材的供应相对缺乏再加上受到国家对野生自然资源采集的限制，许多地方采取用种植的药材来代替野生药材会严重影响药剂的质量，使药材的质量下降，特别是过量使用化肥，大幅度提升中药材的产量，从而导致这与野生药材的气味发生了改变，从而影响了中药的疗效；(2)生产过程，在中药制剂的每一个环节中从投料到制剂的制备都需要投料人员认真仔细地按照工艺中的处方核查所投的药味及数量，如果少投或者多投都会影响到产品的整体质量。此外，还要注意中药制剂的粉碎、提取、浓缩、干燥和精制等方面的工序，这对中药成品的成分含量具有较大的影响作用。因此，在工艺设计时应根据药材的性质进行综合性的思考，选择最优的制备条件和最佳工艺，并做好工序中的质量监督工作，从而保障中药制剂的质量；(3)工艺用水、洁净区环境、工艺卫生，在制剂时，工艺用水也是重要的一个步骤，如果工艺卫生和洁净区环境存在不合格的情况，那将会直接引发微生物的滋生和污染，从而导致生产的制剂出现不合格的产品；(4)包装材料及现代包装技术，现今制剂的包装材料也是影响制剂质量的关键，例如塑料具有透气性和吸附性，它既能保证液体药物的溶媒挥发，也会使其含挥发成分的药物性能改变，加速药物的分解，使用劣质的包装袋，也会使有害的物质渗入制剂当中，此外，由于中药制剂具有剂型多、品种繁杂和生产量小等特点，因此，就会出现因包装袋质量差而导致液体剂外漏、液体发生霉变、药液与包装之间发生反应、固体制剂因受潮而变质等问题的出现，这将严重影响制剂的质量。

中药(包括单味中药和中药复方)指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分***研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。

中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以解决这一问题，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。这也正好符合中医药整体学说。在此基础上，如果进一步开展谱效学研究，可使中药质量与其药效真正结合起来，有助于阐明中药作用机理。总之，中药指纹图谱的研究和建立，对于提高中药质量，促进中药现代化具有重要意义。

当归，为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根。主产于甘肃东南部，以岷县产量多，质量好，其次为云南、四川、陕西、湖北等省，均为栽培。当归具有补血活血，调经止痛，润肠通便之功效，常用于血虚萎黄、眩晕心悸、***、经闭痛经、虚寒腹痛、风湿痹痛、跌扑损伤、痈疽疮疡和肠燥便秘等。酒当归活血通经，用于经闭痛经，风湿痹痛和跌扑损伤等。

桂枝，为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥嫩皮。主产于广西、广东及云南等地。春、夏季剪下嫩枝，晒干或阴干，切成薄片或小段用。桂枝味辛、甘，温，归心、肺、膀胱经。桂枝具有发汗解肌、温通经脉、助阳化气和平冲降气的功效。常用于风寒感冒、脘腹冷痛、血寒经闭、关节痹痛、痰饮、水肿和心悸等。

甘草，为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhizainflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎。分布于东北、华北、陕西、甘肃、青海、新疆、山东等地。甘草具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛以及调和诸药之功效。常用于脾胃虚弱、倦怠乏力、心悸气短、咳嗽痰多、脘腹与四肢挛急疼痛、痈肿疮毒以及缓解药物毒性与烈性。

白芍，为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根。夏、秋二季采挖，洗净，除去头尾和细根，置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮，晒干。白芍具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳之功效。常用于血虚萎黄、***、自汗、盗汗、胁痛、腹痛、四肢挛痛和头痛眩晕等。

生姜，为姜科姜属植物姜Zingiber officinale Rosc.的新鲜根茎，别名有姜根、百辣云、勾装指、因地辛、炎凉小子、鲜生姜。姜的根茎(干姜)、栓皮(姜皮)、叶(姜叶)均可入药。生姜味辛，性微温，归肺、脾、胃经。生姜具有解表散寒、温中止呕、温肺止咳、解毒的功效，常用于风寒感冒、脾胃寒症、胃寒呕吐、肺寒咳嗽和解鱼蟹毒等。

大枣，为鼠李科枣属植物枣Ziziphusjujuba Mill.的干燥成熟果实，含蛋白质、脂肪、糖类、胡萝卜素、B族维生素、维生素C、维生素P以及钙、磷、铁和环磷酸腺苷等营养成分。其中维生素C的含量在果品中名列前茅，有维生素王之美称。大枣味甘，性温，无毒，用于乏力便溏、妇人脏躁、预防输血反应、降低血清谷丙转氨酶、抗肿瘤、抗氧化、降血压、降胆固醇、保肝护肝、提高免疫力、防治脑供血不足、抗过敏、防治心血管病、防治骨质疏松和贫血。

本申请所要求保护的包含当归的中药复方由当归、桂枝、甘草、白芍、生姜和大枣组成。高效液相色谱因其具有高分辨率、高灵敏度、高选择性等特点，被广泛运用到中药药效物质基础、化学成分分析等研究领域中。中药化学成分解析是中药药效物质阐明及质量控制的关键问题之一。中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。所以，中药指纹图谱已经成为目前国际上较为先进的中药质量控制手段。目前，尚未见文献报道对上述复方的化学成分进行全面地分析以及指纹图谱研究。

美国食品药品管理局(FDA)植物药产品工业指南、WHO草药评价指南中均指出，如果草药制剂的活性成分不能鉴别，可以通过指纹图谱(fingerprint spectrum)证明产品质量的一致。欧共体在草药质量指南注释中也指出，草药及其制剂是以整体作为有效物质，因此，草药的质量稳定性仅靠测定已知的有效成分是不够的，应该通过指纹图谱显示其所含的各种成分。印度草药典、英国草药典、德国药用植物协会、加拿大药用及芳香植物协会等，也接受用指纹图谱来保证有效成分未明的草药产品质量的一致性。目前国家药品监督管理局对中药注射剂已要求具有相关的指纹图谱，对提高中药注射剂的质量起到了关键作用，但对其他剂型的中药尚没有强制性要求。

中药指纹图谱包括中药化学指纹图谱、蛋白指纹图谱、DNA指纹图谱及生物效应指纹图谱等。通常说的指纹图谱是指化学指纹图谱，是中药材、中药提取物或中成药经适当处理后，采用一定分析手段，得到的能够标示该中药主要化学成分特性的色谱或光谱。

中药化学指纹图谱可以分为中药光谱指纹图谱，如红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、X射线衍射图谱等；色谱指纹图谱，如薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳图谱(CE)等；波谱指纹图谱，如质谱(MS)、核磁共振波谱(NMR)等；DNA指纹图谱；以及采用多种现代分析仪器联用得到的多维多息特征谱(characteristic fingerprintof muhrdimension and muhrdata)，如HPLC/MS、HPLC/Ms/MS、GC/MS、CE/MS等。

中药指纹图谱研究方法虽然较多，但色谱学方法应是主流方法，尤其是TLC，HPLC和GC色谱技术，已经成为大家所公认的三种常规的分析手段，尤其是HPLC是目前研究中药指纹图谱应优先考虑的方法。

中药指纹图谱有两个作用：一是通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别中药材的真伪或产地：二是通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的制定，能有效控制产品的质量，确保产品质量的相对一致。

中药指纹图谱的制作和应用通常包括：(1)采集具有代表性的中药(单味中药和中药复方)样品，采取适当的方法制备供试品溶液，并选用适当的标准标准品(参照物)，进行分析方法的优选；(2)根据确定的分析方法，对一定批次的中药样品进行分离分析，将所得的多批次数据进行处理，得到标准指纹图谱；(3)将样品按照与标准指纹图谱制作相同的方法进行样品处理、分离分析后，将所得的指纹图谱图谱与标准指纹图谱进行相似度比较，一般相似度达到80％以上即可视为该样品为合格。相似度的计算和评价方法通常采用相关系数与相合系数或夹角余弦法。关于相似度评价，其中以国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价***”应用较多。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种包含当归的中药复方成分检测方法及其指纹图谱构建方法。该检测方法测得的图谱能较全面的反映上述中药复方中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，峰型好，重复性较好，获得的对照指纹图谱能够客观评估样品的质量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

根据本发明的一个方面，提供了一种包含当归的中药复方的检测方法，其包括如下步骤：

取中药复方供试品和对照品进行检测，其中该中药复方由当归、桂枝、甘草、白芍、生姜和大枣组成，其中该对照品为没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸胺和6-姜辣素，

该检测的色谱条件为：采用C₁₈色谱柱，以甲醇或乙腈为流动相A、酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序为：0～20min，5％～12％A；20～90min，12％～85％A；流速为0.8～1.2mL/min；柱温为25～40℃；检测波长为210～330nm；

根据检测结果，获得所述中药复方的成分信息，或成分及其含量信息。

进一步地，该供试品的制备工艺包括：在该中药复方中添加水或醇，得到中药复方溶液；以及该中药复方溶液经过超声提取或回流提取后，过滤得到该供试品。

进一步地，该对照品的制备工艺包括：称取适量的没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸胺和6-姜辣素；以及添加30％-70％甲醇制成含各成分浓度为0.02～0.2mg·mL-1的对照品。

进一步地，该流速为1.0～1.2mL/min，该柱温为30～40℃。

进一步地，理论板数按没食子酸计算不低于8000。

进一步地，该C₁₈色谱柱为Agilent Zorbax SB-C₁₈色谱柱、Phenomenex Gemini C₁₈色谱柱、Thermo syncronis C₁₈色谱柱、Agilent 5TC-C₁₈色谱柱、Kromasil 100-5C₁₈色谱柱、Waters symmetry C₁₈色谱柱或Phenomenex Luna C₁₈色谱柱。

进一步地，该酸水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐、多元弱酸及其盐中的一种或多种。

进一步地，该酸为甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。

进一步地，该酸水溶液为0.08％-0.3％的磷酸水溶液。

进一步地，该酸水溶液为0.08％-0.12％的磷酸水溶液。

进一步地，该酸水溶液为0.1％的磷酸水溶液。

进一步地，该中药复方由下列重量份的组分制成：当归1-10份、桂枝1-10份、甘草1-10份、白芍1-10份、生姜1-10份和大枣1-10份。

进一步地，该中药复方由下列重量份的组分制成：当归4份、桂枝3份、甘草2份、白芍6份、生姜3份和大枣4份。

进一步地，该甘草为炙甘草。

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含当归的中药复方的指纹图谱构建方法，

供试品溶液的制备：在中药复方中添加水或醇，得到中药复方溶液；以及所述中药复方溶液经过超声提取或回流提取后，过滤得到所述供试品溶液，其中所述中药复方由当归、桂枝、甘草、白芍、生姜和大枣组成；

对照品溶液的制备：称取没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸胺和6-姜辣素，加30％-70％甲醇制成含各成分浓度为0.02～0.2mg·mL^-1的所述对照品溶液；

高效液相检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以甲醇或乙腈为流动相A、酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序为：0～20min，5％～12％A；20～90min，12％～85％A；流速为0.8～1.2mL/min；柱温为25～40℃；检测波长为210～330nm；

根据高效液相检测结果，获得中药复方指纹图谱。

进一步地，该高效液相检测的流速为1.0～1.2mL/min，柱温为30～40℃。

进一步地，理论板数按没食子酸计算不低于8000。

进一步地，该指纹图谱包括1-13号峰，其中，1号峰为没食子酸作为参照峰、7号峰为芍药苷、8号峰为阿魏酸、9号峰为甘草苷、12号峰为甘草酸胺、13号峰为6-姜辣素，其保留时间分别为6.4～7.2min、28.4～29.2min、34.4～35.2min、36.4～37.2min、72.4～73.2min、77.6～78.4min。

进一步地，该中药复方由下列重量份的组分制成：当归1-10份、桂枝1-10份、甘草1-10份、白芍1-10份、生姜1-10份和大枣1-10份。

进一步地，该中药复方由下列重量份的组分制成：当归4份、桂枝3份、甘草2份、白芍6份、生姜3份和大枣4份。

进一步地，该甘草为炙甘草。

进一步地，该酸水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐、多元弱酸及其盐中的一种或多种。

进一步地，该酸为甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。

进一步地，该酸水溶液为0.08％-0.3％的磷酸水溶液。

进一步地，该C₁₈色谱柱为Agilent Zorbax SB-C₁₈色谱柱、Agilent5TC-C₁₈₍₂₎色谱柱、Phenomenex Kinetex C₁₈色谱柱、Ultimate XB C₁₈色谱柱、Hypersil GOLD C₁₈色谱柱、Diamonsil C₁₈色谱柱或Supersil ODS2 C₁₈色谱柱。

进一步地，8号峰来自当归；10号峰和11号峰来自桂枝；9号峰和12号峰来自甘草；1号峰、2号峰、6号峰和7号峰来自白芍；13号峰来自生姜药材；3号峰、5号峰为当归、白芍共有峰；4号峰为甘草、白芍共有峰。

进一步地，1-13号峰的保留时间分别为6.4～7.2min、7.6～8.4min、17.2～18.0min、19.6～20.4min、22.4～23.2min、26～26.8min、28.4～29.2min、34.4～35.2min、36.4～37.2min、46.4～47.2min、60～60.8min、72.4～73.2min、77.6～78.4min。

根据本发明的又一个方面，提供了一种对照品组合物的标准指纹图谱，该对照品为没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸胺和6-姜辣素，该标准指纹图谱为高效液相色谱图谱，该图谱中呈现6个色谱峰，其中1号峰是与参照峰没食子酸的峰保留时间相同的色谱峰，与1号峰保留时间相比，其他5个色谱峰的相对保留时间分别为：4.23±10％、5.12±10％、5.41±10％、10.71±10％、11.47±10％。

根据本发明的又一个方面，提供了一种对照品组合物的标准指纹图谱，该对照品为没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸胺和6-姜辣素，该标准指纹图谱为高效液相色谱图谱，其色谱条件为：采用C18色谱柱，以甲醇或乙腈为流动相A、酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序为：0～20min，5％～12％A；20～90min，12％～85％A；流速为0.8～1.2mL/min；柱温为25～40℃；检测波长为210～330nm。

进一步地，建立上述标准指纹图谱后，按上述检测方法构建包含当归的中药复方的指纹图谱，然后将其与上述标准指纹图谱相比较，相似度不低于0.90。

进一步地，建立所述标准指纹图谱后，将上述构建方法所构建的指纹图谱与上述标准指纹图谱相比较，相似度不低于0.90。

根据本发明的再一个方面，提供了一种根据上述检测方法在构建包含当归的中药复方的指纹图谱中的应用。

根据本发明检测方法能准确获得包含当归的中药复方的成分信息，或成分及其含量信息。而且本发明得到的图谱能较全面的反映包含当归的中药复方中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，峰型好，重复性较好，获得的指纹图谱能够客观评估样品的质量。本发明共鉴定出13个化合物，其中6个化合物经对照品验证。该结果为阐明包含当归的中药复方的药效物质基础奠定了基础，并为质量控制提供参考。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本申请要求保护的范围。

图1为26批具有代表性上述中药复方物质基准对应实物(冻干粉)样品生成对照指纹图谱。其中从下至上所涉及的批号分别为DGJZT-1-1、DGJZT-1-2、DGJZT-2-1、DGJZT-3-1、DGJZT-3-2、DGJZT-4-1、DGJZT-4-2、DGJZT-5-1、DGJZT-5-2、DGJZT-6-2、DGJZT-7-1、DGJZT-7-2、DGJZT-8-1、DGJZT-9-1、DGJZT-9-2、DGJZT-11-1、DGJZT-11-2、DGJZT-10-1、DGJZT-12-1、DGJZT-12-2、DGJZT-13-1、DGJZT-13-2、DGJZT-14-2、DGJZT-15-1、DGJZT-15-2和DGJZT-15-3。

图2为包含当归的中药复方供试品的HPLC指纹图谱。其中，该指纹图谱包括1-13号峰，其中1号峰为没食子酸作为参照峰、7号峰为芍药苷、8号峰为阿魏酸、9号峰为甘草苷、12号峰为甘草酸胺、13号峰为6-姜辣素；其中8号峰来自当归；10号峰和11号峰来自桂枝；9号峰和12号峰来自甘草；1号峰、2号峰、6号峰和7号峰来自白芍；13号峰来自生姜药材；3号峰、5号峰为当归、白芍共有峰；4号峰为甘草、白芍共有峰。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。

本发明公开了一种包含当归的中药复方的检测方法及其指纹图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。

除特别指出，本发明提供的技术方案中所用药品、试剂、仪器均可由常规渠道或市场购得。

根据本发明的一个方面，提供了一种包含当归的中药复方的检测方法，其包括如下步骤：

取中药复方供试品和对照品进行检测，其中该中药复方由当归、桂枝、甘草、白芍、生姜和大枣组成，其中该对照品为没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸胺和6-姜辣素，

该检测的色谱条件为：采用C₁₈色谱柱，以甲醇或乙腈为流动相A、酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序为：0～20min，5％～12％A；20～90min，12％～85％A；流速为0.8～1.2mL/min；柱温为25～40℃；检测波长为210～330nm；

根据检测结果，获得所述中药复方的成分信息，或成分及其含量信息。

在一种优选的实施方式中，该供试品的制备工艺包括：在该中药复方中添加水或醇，得到中药复方溶液；以及该中药复方溶液经过超声提取或回流提取后，过滤得到该供试品。

在一种优选的实施方式中，该对照品的制备工艺包括：称取适量的没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸胺和6-姜辣素；以及添加30％-70％甲醇制成含各成分浓度为0.02～0.2mg·mL^-1的对照品。

为了获得更好的色谱峰分离效果且具有较低的柱压，在一种优选的实施方式中，该流速为1.0～1.2mL/min，该柱温为30～40℃。

在一种优选的实施方式中，理论板数按没食子酸计算不低于8000。

在一种优选的实施方式中，该C₁₈色谱柱为Agilent Zorbax SB-C₁₈色谱柱、Agilent 5TC-C₁₈₍₂₎色谱柱、Phenomenex Kinetex C₁₈色谱柱、Ultimate XB C₁₈色谱柱、Hypersil GOLD C₁₈色谱柱、Diamonsil C₁₈色谱柱或Supersil ODS2 C₁₈色谱柱。

在一种优选的实施方式中，该酸水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐、多元弱酸及其盐中的一种或多种。

在一种优选的实施方式中，该酸为甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。

为了使色谱峰得到更好的分离，保留时间适宜，达到指纹图谱信息最大化原则，且重现性和稳定性更优，在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.08％-0.3％的磷酸水溶液。

在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.08％-0.12％的磷酸水溶液。

在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.1％的磷酸水溶液。

在一种优选的实施方式中，该中药复方由下列重量份的组分制成：当归1-10份、桂枝1-10份、甘草1-10份、白芍1-10份、生姜1-10份和大枣1-10份。

在一种优选的实施方式中，该中药复方由下列重量份的组分制成：当归4份、桂枝3份、甘草2份、白芍6份、生姜3份和大枣4份。

在一种优选的实施方式中，该甘草为炙甘草。

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含当归的中药复方的指纹图谱构建方法，

供试品溶液的制备：在中药复方中添加水或醇，得到中药复方溶液；以及所述中药复方溶液经过超声提取或回流提取后，过滤得到所述供试品溶液，其中所述中药复方由当归、桂枝、甘草、白芍、生姜和大枣组成；

对照品溶液的制备：称取没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸胺和6-姜辣素，加30％-70％甲醇制成含各成分浓度为0.02～0.2mg·mL^-1的所述对照品溶液；

高效液相检测的色谱条件为：采用C₁₈色谱柱，以甲醇或乙腈为流动相A、酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序为：0～20min，5％～12％A；20～90min，12％～85％A；流速为0.8～1.2mL/min；柱温为25～40℃；检测波长为210～330nm；

根据高效液相检测结果，获得中药复方指纹图谱。

本发明的指纹图谱构建方法的有益效果是：

(1)用本发明所提供的方法所建立的包含当归的中药复方指纹图谱，能有效地表征上述中药复方的质量，有利于全面监控药材的质量；

(2)指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定个别化学成分而判定上述中药复方整体质量的片面性，又减少了为质量达标而认为处理的可能性；

(3)本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；

(4)该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。

为了获得更好的色谱峰分离效果且具有较低的柱压，在一种优选的实施方式中，该高效液相检测的流速为1.0～1.2mL/min，柱温为30～40℃。

在一种优选的实施方式中，理论板数按没食子酸计算不低于8000。

在一种优选的实施方式中，该指纹图谱包括1-13号峰，其中，1号峰为没食子酸作为参照峰、7号峰为芍药苷、8号峰为阿魏酸、9号峰为甘草苷、12号峰为甘草酸胺、13号峰为6-姜辣素，其保留时间分别为6.4～7.2min、28.4～29.2min、34.4～35.2min、36.4～37.2min、72.4～73.2min、77.6～78.4min。

在一种优选的实施方式中，该中药复方由下列重量份的组分制成：当归1-10份、桂枝1-10份、甘草1-10份、白芍1-10份、生姜1-10份和大枣1-10份。

在一种优选的实施方式中，该中药复方由下列重量份的组分制成：当归4份、桂枝3份、甘草2份、白芍6份、生姜3份和大枣4份。

在一种优选的实施方式中，该甘草为炙甘草。

在一种优选的实施方式中，该酸水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐、多元弱酸及其盐中的一种或多种。

在一种优选的实施方式中，该酸为甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。

为了使色谱峰得到更好的分离，保留时间适宜，达到指纹图谱信息最大化原则，且重现性和稳定性更优，在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.08％-0.3％的磷酸水溶液。

在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.08％-0.12％的磷酸水溶液。

在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.1％的磷酸水溶液。

在一种优选的实施方式中，该C₁₈色谱柱为Agilent Zorbax SB-C₁₈色谱柱、Phenomenex Gemini C₁₈色谱柱、Thermo syncronis C₁₈色谱柱、Agilent5TC-C₁₈色谱柱、Kromasil 100-5C₁₈色谱柱、Waters symmetry C₁₈色谱柱或Phenomenex Luna C₁₈色谱柱。

在一种优选的实施方式中，8号峰来自当归；10号峰和11号峰来自桂枝；9号峰和12号峰来自甘草；1号峰、2号峰、6号峰和7号峰来自白芍；13号峰来自生姜药材；3号峰、5号峰为当归、白芍共有峰；4号峰为甘草、白芍共有峰。

在一种优选的实施方式中，1-13号峰的保留时间分别为6.4～7.2min、7.6～8.4min、17.2～18.0min、19.6～20.4min、22.4～23.2min、26～26.8min、28.4～29.2min、34.4～35.2min、36.4～37.2min、46.4～47.2min、60～60.8min、72.4～73.2min、77.6～78.4min。

本发明通过大量实验筛选出最佳的流动相组成、梯度洗脱方式、检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的指纹图谱检测方法，可建立良好的指纹图谱。采用本发明提供的复方中药指纹图谱检测方法，可以同时检测该中药复方中的13个活性成分，从而可以全面、客观、准确的检测和评价该中药复方的质量，对保证临床疗效具有重要意义。

根据本发明的又一个方面，提供了一种对照品组合物的标准指纹图谱，该对照品为没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸胺和6-姜辣素，该标准指纹图谱为高效液相色谱图谱，该图谱中呈现6个色谱峰，其中1号峰是与参照峰没食子酸的峰保留时间相同的色谱峰，与1号峰保留时间相比，其他5个色谱峰的相对保留时间分别为：4.23±10％、5.12±10％、5.41±10％、10.71±10％、11.47±10％。

根据本发明的又一个方面，提供了一种对照品组合物的标准指纹图谱，该对照品为没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸胺和6-姜辣素，该标准指纹图谱为高效液相色谱图谱，其色谱条件为：采用C18色谱柱，以甲醇或乙腈为流动相A、酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序为：0～20min，5％～12％A；20～90min，12％～85％A；流速为0.8～1.2mL/min；柱温为25～40℃；检测波长为210～330nm。

在一种优选的实施方式中，建立上述标准指纹图谱后，按上述检测方法构建包含当归的中药复方的指纹图谱，然后将其与上述标准指纹图谱相比较，相似度不低于0.90。

在一种优选的实施方式中，建立所述标准指纹图谱后，将上述构建方法所构建的指纹图谱与上述标准指纹图谱相比较，相似度不低于0.90。

根据本发明的再一个方面，提供了一种根据上述检测方法在构建包含当归的中药复方的指纹图谱中的应用。

实施例

供试品溶液的制备方法

取12g当归、9g桂枝、6g炙甘草、18g白芍、9g生姜和12g大枣，加水2000ml，浸泡50分钟，煎煮150分钟，以120目双层滤布滤过，滤液备用，冷冻干燥，得冻干粉约19g。取上述冻干粉约0.9g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，称定重量，超声处理15分钟(功率250W40kHz)，取出，放冷，称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

对照品溶液的制备方法

取甘草酸铵对照品、阿魏酸对照品、没食子酸对照品、甘草苷对照品、芍药苷对照品适量，精密称定，分别加50％甲醇制成每1ml含甘草酸铵0.5mg、阿魏酸0.2mg、没食子酸0.5mg、甘草苷2.0mg、芍药苷1.5mg的对照品储备液。另取6-姜辣素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含6-姜辣素2mg的对照品储备液。分别精密吸取甘草酸铵对照品储备液5ml、阿魏酸对照品储备液5ml，没食子酸对照品储备液10ml、甘草苷对照品储备液5ml、芍药苷对照品储备液10ml、6-姜辣素对照品1ml，制成每1ml成每1ml含甘草酸铵0.05mg、阿魏酸0.02mg、没食子酸0.1mg、甘草苷0.2mg、芍药苷0.3mg、6-姜辣素0.2mg的混合溶液，即得对照品溶液(其中甘草酸重量＝甘草酸铵重量/1.0207)。

本发明提供的一种包含当归的中药复方的指纹图谱检测方法的最佳条件筛选过程：

1、仪器与试剂

高效液相色谱仪安捷伦1100色谱***，包括G1322A型脱气机、G1311A型四元泵、G1313A型自动进样器、G1315B型DAD二极管阵列检测器、G1316A型柱温箱、ChemStation色谱工作站；

电子分析天平：SHIMADZU(岛津)AUW120D、Sartorius(赛得利斯)BSA124S；

超声清洗机：KQ-500DB型昆山市超声仪器有限公司；

电热套：DZTW型邦西仪器科技(上海)有限公司；

超纯水机：AXLK1820-2阿修罗重庆阿修罗科技发展有限公司；

色谱柱：Agilent 5TC-C₁₈₍₂₎柱(柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)批号：551725、554265、556323、547698；

Phenomenex Kinetex C₁₈柱(柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；

Ultimate XB C₁₈柱(柱长25cm，内径4.6mm，粒径5μm)；

Hypersil GOLD C₁₈柱(柱长25cm，内径4.6mm，粒径5μm)；

Diamonsil C₁₈柱(柱长25cm，内径4.6mm，粒径5μm)；

Supersil ODS2 C₁₈柱(柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；

Agilent ZORBAX SB-C₁₈(柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；

试剂：乙腈、甲醇，色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2、检测波长的选择

取供试品溶液和对照品溶液各10μl，以乙腈(A)-0.1％磷酸溶液(B)***为流动相，用DAD检测器进行检测，对图谱进行分析。参考中国药典当归、甘草、生姜、白芍、桂枝含量测定中检测波长，综合考虑供试品溶液的3D吸收图和混合对照品溶液的吸收。

结果表明，甘草酸及甘草苷在247nm有最大吸收峰，白芍药材中多个物质在210nm处有较大吸收且芍药苷在230nm处有最大吸收峰，肉桂酸及桂皮醛在290nm处有最大吸收峰，阿魏酸在327nm处有最大吸收峰，没食子酸在210nm处有最大吸收峰。

为了实现中药复方各成分能够具有明显的吸收峰，本申请所采用的检测方式为在不同时间段采用不同的检测波长，如下表1所示。采用上述方式，所提供的化学成分信息量大，可得到理想的色谱图。

表1检测波长转换表

3、流动相梯度的选择

以乙腈(A)-0.1％磷酸溶液(B)***为流动相，检测波长250nm，改变流动相梯度，比较色谱峰的变化。

表2流动相梯度1

结果表明，当采用流动相梯度洗脱1进行梯度洗脱时，首末两端的峰过于密集，且芍药苷与其相邻的峰的分离度差，芍药苷峰中夹有其它峰，需进一步优化，具体优化梯度见表3。

表3流动相梯度2

结果表明，当采用流动相梯度洗脱2进行梯度洗脱时，峰信息不全面，存在峰丢失，35～40分钟的峰分离度差，白芍中芍药苷峰严重拖尾，且夹杂有其它峰，需进一步优化，具体优化梯度见表4。

表4流动相梯度3

结果表明，当采用流动相梯度洗脱3进行梯度洗脱时，芍药苷峰的拖尾情况得以改善，但峰个数少，且集中在20分钟前后出峰，需进一步优化，具体优化梯度见表5。

表5流动相梯度4

结果表明，当采用流动相梯度洗脱4进行梯度洗脱时，芍药苷峰拖尾得以很好解决，阿魏酸峰、桂皮醛峰、甘草酸峰、6-姜酚峰、没食子酸峰的分离度均大于1.5，且基线平稳，故选梯度4作为后续研究。

4、流动相***组成的选择

固定流动相梯度变化程序，比较流动相为乙腈(A)-水(B)***、乙腈(A)-0.1％醋酸溶液(B)***、乙腈(A)-0.1％甲酸溶液(B)***和乙腈(A)-0.1％磷酸溶液(B)***时，检测波长按表6中规定进行转换，比较色谱峰的变化。

表6流动相***组成考察结果

结果表明，当流动相***为乙腈(A)-0.1％甲酸溶液(B)和乙腈(A)-0.1％醋酸溶液(B)时，210nm波长下的色谱图基线漂移非常严重；当流动相***为乙腈(A)-水(B)时，色谱图中各峰面积明显小于乙腈(A)-0.1％磷酸溶液(B)流动相中***，峰信息也不如后者丰富；当流动相***为乙腈(A)-0.1％磷酸溶液(B)***时，对各主要色谱峰的分离情况较好，色谱峰信息最丰富，故选择流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸溶液(B)***。采用流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸溶液(B)***进行洗脱，各色谱峰分离很好，保留时间适宜，达到指纹图谱信息最大化原则，且重现性和稳定性优。

5、不同磷酸浓度的选择

固定流动相梯度变化程序，同一供试品溶液，其他色谱条件不变，考察0.08％磷酸溶液、0.1％磷酸溶液、0.12％磷酸溶液流三种不同浓度磷酸对色谱峰的影响。结果见表7。

表7不同磷酸浓度流动相***考察结果

结果表明，0.08％磷酸溶液、0.1％磷酸溶液、0.12％磷酸溶液三种不同浓度磷酸溶液对没食子酸、阿魏酸、甘草酸铵色谱峰影响差异不大，当流动相磷酸溶液浓度为0.1％时分离基线相对较平稳，结合指纹图谱，选择乙腈-0.1％磷酸溶液为后续研究。

6、柱温的选择

本发明分别在25℃、30℃、35℃和40℃柱温下分析所述中药复方，对比各柱温下的色谱图，实验结果表明，在25℃至40℃条件下，色谱峰分离较好，尤其30℃柱温条件下，色谱峰分离情况最好，柱压也较低，因此优选30℃为最佳柱温条件。

7、色谱柱的选择

本发明通过大量实验筛选了不同的色谱柱，采用多种不同型号的色谱柱进行测定：

色谱检测结果表明，Agilent ZORBAX SB-C₁₈(柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)色谱柱可将样品达到基线分离，各色谱峰分离度良好，重现性和稳定性好，可以建立稳定的指纹图谱。

经过上述大量实验筛选，本发明优选的最佳色谱条件为：优选用Agilent ZORBAXSB-C₁₈(柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)色谱柱；流动相：A相为乙腈，B相为0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱，流动相流速为1ml/min；检测波长的变化如表1所示；柱温为30℃；

梯度洗脱方式如下表8所示：

表8梯度洗脱方式

精密度试验

取批号为DGJZT-1-1的包含当归的中药复方，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按照上述指纹图谱优选的色谱条件连续进样6次，进行测定。考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积＞3％的共有峰面积值，结果13个共有峰的相对保留时间的RSD≤0.15％，相对峰面积＞3％的共有峰的相对峰面积值RSD≤1.5％，又以第1次进样所得指纹图谱作为参照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均大于0.99，符合指纹图谱的技术要求。表明本发明提供的指纹图谱检测方法精密度良好。

稳定性试验

取批号为DGJZT-1-1的包含当归的中药复方，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按照上述指纹图谱优选的色谱条件于0、3、6、9、12小时分别测定一次指纹图谱，共测6次，考察13个共有峰的相对保留时间和相对峰面积＞3％的共有峰面积值，结果各共有峰相对保留时间RSD≤1.5％，相对峰面积＞3％的共有峰相对峰面积值RSD≤2.0％，又以第1次进样所得指纹图谱作为参照，计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均大于0.99，表明本发明提供的指纹图谱检测方法，在12小时内是稳定的。

重复性试验

取批号为DGJZT-1-1的包含当归的中药复方，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按照上述指纹图谱优选的色谱条件于0、3、6、9、12小时分别测定一次指纹图谱，共测6次，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积＞3％的共有峰面积值，结果各共有峰相对保留时间RSD≤2.0％，相对峰面积＞3％的共有峰相对峰面积值RSD≤2.0％，并以第1次进样所得指纹图谱作为参照，计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均大于0.99，表明本发明提供的指纹图谱检测方法的重复性好。

共有峰标记

包含当归的中药复方物质基准对应实物根据高效液相色谱法(《中国药典》2015年四部通则0512)进行了指纹图谱方法研究。采用药典委员会编制的指纹图谱相似度评价软件“中药色谱指纹图谱相似度评价***2012版”，采用26批具有代表性上述中药复方物质基准对应实物(冻干粉)样品生成对照指纹图谱(如图1所示)；并对上述中药复方物质基准对应实物(冻干粉)各个共有峰的化学性质进行分析，并指认出甘草酸铵、阿魏酸、芍药苷、甘草苷、没食子酸、6-姜辣素峰。

1号峰为没食子酸、7号峰为芍药苷、8号峰为阿魏酸、9号峰为甘草苷、12号峰为甘草酸胺、13号峰为6-姜辣素。8号峰来自当归药材；10、11号峰来自桂枝药材；9、12号峰来自甘草药材；1、2、6、7号峰来自白芍药材；13号峰来自生姜药材。3、5号峰为当归、白芍共有峰；4号峰为甘草、白芍共有峰。

与没食子酸参照物峰相应的峰为S峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价***，供试品指纹图谱与上述中药复方物质基准对应实物(冻干粉)对照指纹图谱经Mark峰相似度计算相似度均大于0.90。

结合上述中药复方物质基准对应实物(冻干粉)指纹图谱方法学验证结果及26批上述中药复方物质基准对应实物(冻干粉)的共有峰情况，规定：

供试品指纹图谱中，应分别呈现与甘草酸铵、阿魏酸、没食子酸、甘草苷、芍药苷、桂皮醛、6-姜辣素色谱峰保留时间相同的色谱峰，并应出现13个共有峰，以1(S)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13号峰为标记(如图2所示)，按中药色谱指纹图谱相似度评价***，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。具体如表9所示。

表926批物质基准HPLC指纹图谱匹配相似度

含量测定

以阿魏酸、甘草酸的含量和指标成分的***适应性为评判指标，对包含当归的中药复方物质基准含量测定的色谱条件和***适应性进行验证，并且对样品的前处理方法进行考察，确定供试品制备方法，通过对该测定方法进行方法学考察，建立了上述中药复方物质基准中阿魏酸、甘草酸含量的方法，并测定了多批上述中药复方物质基准中阿魏酸、甘草酸的含量，结果表明了该方法简单易操作，具有分离效果好、灵敏度高、重复性好等优点。

26批次物质基准对应实物阿魏酸实测范围为0.024％～0.043％，均值0.033％，均值±30％的波动范围为0.023％～0.043％，26批物质基准对应实物的阿魏酸含量测定数据均符合均值±30％的波动范围(0.023％～0.043％)。

26批次物质基准对应实物甘草酸实测范围为0.11％～0.20％，均值0.16％，均值±30％的波动范围为0.11％～0.21％，26批物质基准对应实物的甘草酸含量测定数据均符合均值±30％的波动范围(0.11％～0.21％)。

根据以上方法学考察结果表明，本发明提供的指纹图谱检测方法，具有很好的精密度、重复性和稳定性，可以全面、客观、准确的检测和评价本申请的包含当归的中药复方的质量，对保证临床疗效具有重要意义。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

以上对本申请实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本申请的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本申请的思想，基于本申请的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本申请保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

Claims (10)

1.一种包含当归的中药复方的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

取中药复方供试品和对照品进行检测，其中所述中药复方由当归、桂枝、甘草、白芍、生姜和大枣组成，其中所述对照品为没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸胺和6-姜辣素，

所述检测的色谱条件为：采用C₁₈色谱柱，以甲醇或乙腈为流动相A、酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序为：0～20min，5％～12％A；20～90min，12％～85％A；流速为0.8～1.2mL/min；柱温为25～40℃；检测波长为210～330nm；

根据检测结果，获得所述中药复方的成分信息，或成分及其含量信息。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，

所述供试品的制备工艺包括：在所述中药复方中添加水或醇，得到中药复方溶液；以及所述中药复方溶液经过超声提取或回流提取后，过滤得到所述供试品；

优选地，所述对照品的制备工艺包括：称取适量的没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸胺和6-姜辣素；以及添加30％-70％甲醇制成含各成分浓度为0.02～0.2mg·mL^-1的所述对照品；

更优选地，所述流速为1.0～1.2mL/min，所述柱温为30～40℃；

特别优选地，理论板数按没食子酸计算不低于8000；

最优选地，所述C₁₈色谱柱为AgilentZorbax SB-C₁₈色谱柱、Phenomenex Gemini C₁₈色谱柱、Thermo syncronis C₁₈色谱柱、Agilent 5TC-C₁₈色谱柱、Kromasil 100-5C₁₈色谱柱、Waters symmetry C₁₈色谱柱或Phenomenex Luna C₁₈色谱柱。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，

所述酸水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐、多元弱酸及其盐中的一种或多种；

优选地甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸；

更优选地0.08％-0.3％的磷酸水溶液；

特别优选地，所述中药复方由下列重量份的组分制成：当归1-10份、桂枝1-10份、甘草1-10份、白芍1-10份、生姜1-10份和大枣1-10份；

尤其优选地，所述中药复方由下列重量份的组分制成：当归4份、桂枝3份、甘草2份、白芍6份、生姜3份和大枣4份；

最优选地，所述甘草为炙甘草。

4.一种包含当归的中药复方的指纹图谱构建方法，其特征在于，

供试品溶液的制备：在中药复方中添加水或醇，得到中药复方溶液；以及所述中药复方溶液经过超声提取或回流提取后，过滤得到所述供试品溶液，其中所述中药复方由当归、桂枝、甘草、白芍、生姜和大枣组成；

对照品溶液的制备：称取没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸胺和6-姜辣素，加30％-70％甲醇制成含各成分浓度为0.02～0.2mg·mL^-1的所述对照品溶液；

高效液相检测的色谱条件为：采用C₁₈色谱柱，以甲醇或乙腈为流动相A、酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序为：0～20min，5％～12％A；20～90min，12％～85％A；流速为0.8～1.2mL/min；柱温为25～40℃；检测波长为210～330nm；

根据高效液相检测结果，获得中药复方指纹图谱。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，

所述高效液相检测的流速为1.0～1.2mL/min，柱温为30～40℃；

优选地，理论板数按没食子酸计算不低于8000；

更优选地，所述指纹图谱包括1-13号峰，其中，1号峰为没食子酸作为参照峰、7号峰为芍药苷、8号峰为阿魏酸、9号峰为甘草苷、12号峰为甘草酸胺、13号峰为6-姜辣素，其保留时间分别为6.4～7.2min、28.4～29.2min、34.4～35.2min、36.4～37.2min、72.4～73.2min、77.6～78.4min；

特别优选地，所述中药复方由下列重量份的组分制成：当归1-10份、桂枝1-10份、甘草1-10份、白芍1-10份、生姜1-10份和大枣1-10份；

尤其优选地，所述中药复方由下列重量份的组分制成：当归4份、桂枝3份、甘草2份、白芍6份、生姜3份和大枣4份；

最优选地，所述甘草为炙甘草。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，

所述酸水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐、多元弱酸及其盐中的一种或多种；

优选地甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸；

更优选地0.08％-0.3％的磷酸水溶液；

尤其优选地，所述C₁₈色谱柱为Agilent Zorbax SB-C₁₈色谱柱、Agilent 5TC-C₁₈₍₂₎色谱柱、Phenomenex Kinetex C₁₈色谱柱、Ultimate XB C₁₈色谱柱、Hypersil GOLD C₁₈色谱柱、Diamonsil C₁₈色谱柱或Supersil ODS2 C₁₈色谱柱；

特别优选地，8号峰来自当归；10号峰和11号峰来自桂枝；9号峰和12号峰来自甘草；1号峰、2号峰、6号峰和7号峰来自白芍；13号峰来自生姜药材；3号峰、5号峰为当归、白芍共有峰；4号峰为甘草、白芍共有峰；

最优选地，1-13号峰的保留时间分别为6.4～7.2min、7.6～8.4min、17.2～18.0min、19.6～20.4min、22.4～23.2min、26～26.8min、28.4～29.2min、34.4～35.2min、36.4～37.2min、46.4～47.2min、60～60.8min、72.4～73.2min、77.6～78.4min。

7.一种对照品组合物的标准指纹图谱，其特征在于，所述对照品为没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸胺和6-姜辣素，所述标准指纹图谱为高效液相色谱图谱，所述图谱中呈现6个色谱峰，其中1号峰是与参照峰没食子酸的峰保留时间相同的色谱峰，与1号峰保留时间相比，其他5个色谱峰的相对保留时间分别为：4.23±10％、5.12±10％、5.41±10％、10.71±10％、11.47±10％。

8.一种对照品组合物的标准指纹图谱，其特征在于，所述对照品为没食子酸、芍药苷、阿魏酸、甘草苷、甘草酸胺和6-姜辣素，所述标准指纹图谱为高效液相色谱图谱，其色谱条件为：采用C₁₈色谱柱，以甲醇或乙腈为流动相A、酸水溶液为流动相B，梯度洗脱程序为：0～20min，5％～12％A；20～90min，12％～85％A；流速为0.8～1.2mL/min；柱温为25～40℃；检测波长为210～330nm。

9.根据权利要求7或8所述的标准指纹图谱，其特征在于，

建立所述标准指纹图谱后，按权利要求1至3中任一项所述的检测方法构建包含当归的中药复方的指纹图谱，然后将其与所述标准指纹图谱相比较，相似度不低于0.90；

可替换地，建立所述标准指纹图谱后，将权利要求5或6所述的构建方法所构建的指纹图谱与所述标准指纹图谱相比较，相似度不低于0.90。

10.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法在构建包含当归的中药复方的指纹图谱中的应用。

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