CN114032211A - 乙酰栓菌酸用于cik细胞体外扩增的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了乙酰栓菌酸用于CIK细胞体外扩增的用途。本发明发现，乙酰栓菌酸一方面可以提高CIK细胞增殖活性，另一方面可以提高CIK细胞纯度，可以用于CIK细胞体外培养，具有开发用作CIK细胞培养基添加剂的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫治疗领域，涉及CIK细胞的体外培养，具体涉及乙酰栓菌酸用于CIK细胞体外扩增的用途。
背景技术
细胞免疫治疗是一种有潜力的肿瘤治疗方法，细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)是其中一种具有广谱杀瘤活性的免疫细胞。CIK是一群异质性细胞，主要的效应细胞为CD3+CD56+具有自然杀伤细胞(naturalkiller，NK)样特征的T细胞。临床研究证实，CIK对多种肿瘤具有杀伤活性，能使患者临床获益。
乙酰栓菌酸(Tsugaric acid A)是一种有机羧酸类化合物，结构式如下。
为了提高CIK细胞的细胞免疫治疗效果，需要提高CIK细胞体外培养的效率。
发明内容
本发明是为了克服现有技术的不足，提供乙酰栓菌酸用于CIK细胞体外扩增的用途。
技术方案如下：
乙酰栓菌酸用于CIK细胞体外扩增的用途。
乙酰栓菌酸用于制备CIK细胞培养基的用途。
一种CIK细胞培养基，其中含有促进CIK细胞体外扩增的乙酰栓菌酸。
有益效果：
本发明发现，乙酰栓菌酸一方面可以提高CIK细胞增殖活性，另一方面可以提高CIK细胞纯度，可以用于CIK细胞体外培养，具有开发用作CIK细胞培养基添加剂的应用前景。
附图说明
图1为单个核细胞向CIK细胞诱导培养过程中的显微镜观察结果。
图2为流式检测CD3+CD56+表型的结果。
具体实施方式
一、试验材料
淋巴细胞分离液购自Solarbio。
GT-T551培养基购自TAKARA，人AB血清购自SIGMA。
乙酰栓菌酸购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98％。
CD3-PerCP-Cy5.5和CD56-FITC购自BD。
二、试验方法
1、CIK细胞的培养和鉴定
取健康献血者外周抗凝血100mL，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，洗涤后用含有5％人AB血清的GT-T551培养基调整为2.5×106个/mL，并加入重组人IFN-γ至终浓度为1000U/mL，置于37℃、5％CO2条件培养。24h后加人白介素IL-2至终浓度为1000U/mL和抗CD3单抗至终浓度为50ng/mL。此后每2～3d更换培养液并补加人IL-2。第3、5、7、9d于显微镜下观察。培养9d后，收集细胞。取0、9d细胞适量，按照常规的流式细胞检测法加入PerCP-Cy5.5标记的CD3和FITC标记的CD56抗体对细胞表面标志物进行鉴定。
2、CIK细胞增殖活性测定
收集培养9d的细胞，PBS洗涤，用含有5％人AB血清的GT-T551培养基重悬制成细胞密度为5×104/mL的细胞悬浮液，接种于96孔板中，每孔5000个细胞，24h后，药物组更换为含有20μg/mL或50μg/mL乙酰栓菌酸的完全培养基，对照组更换为不含乙酰栓菌酸的完全培养基，在37℃、5％CO2条件继续培养，48h后，每孔加入20μL的CCK8溶剂，继续培养4h，用酶标仪于450nm处测定各孔吸光值OD，按照公式计算CIK细胞增殖活性：
CIK细胞增殖活性(％)＝药物组OD值/对照组OD值×100％。
对照组增殖活性计为100％。
3、CIK细胞纯度测定
收集培养9d的细胞，PBS洗涤，用含有5％人AB血清的GT-T551培养基重悬制成细胞密度为5×104/mL的细胞悬浮液，接种于6孔板中，每孔2.5mL，24h后，药物组更换为含有20μg/mL或50μg/mL乙酰栓菌酸的完全培养基，对照组更换为不含乙酰栓菌酸的完全培养基，在37℃、5％CO2条件继续培养，48h后，收集细胞，PBS洗涤，按照常规的流式细胞检测法加入PerCP-Cy5.5标记的CD3和FITC标记的CD56抗体，检测CD3+CD56+表型细胞的比例，即得CIK细胞纯度。
4、统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件包处理数据，用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05代表差异具有统计学意义。
三、试验结果
显微镜下观察显示，细胞生长状态良好(图1)。培养0、9d细胞的流式结果如图2中A、B所示，CD3+CD56+表型细胞的百分率由1.7％提高到20.8％，说明CIK细胞诱导成功。
CIK细胞增殖活性如表1所示，药物组CIK细胞增殖活性更强，且存在剂量效应。
表1各组OD值和细胞增殖活性
**表示与对照组相比P<0.05，差异具有统计学意义。
对照组和药物组流式结果如图2中C、D、E所示，药物组CD3+CD56+表型细胞的百分率(35.7％、55.6％)显著高于对照组(25.2％)，说明药物组CIK细胞纯度更高。
综合上述实验结果可以看出，乙酰栓菌酸一方面可以提高CIK细胞增殖活性，另一方面可以提高CIK细胞纯度，可以用于CIK细胞体外培养，具有开发用作CIK细胞培养基添加剂的应用前景。
以上实施例旨在具体介绍本发明的实质性内容，但不应将本发明的保护范围局限于以上具体的实施例。
Claims (3)
1.乙酰栓菌酸用于CIK细胞体外扩增的用途。
2.乙酰栓菌酸用于制备CIK细胞培养基的用途。
3.一种CIK细胞培养基，其中含有促进CIK细胞体外扩增的乙酰栓菌酸。
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