CN114031624B - 螺环黄烷醇生物碱及其制备方法和应用 - Google Patents

螺环黄烷醇生物碱及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了对α‑葡萄糖苷酶活性具有抑制作用的4个螺环黄烷醇生物碱及其制备方法和应用，由式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ或式Ⅳ所示结构表示：
Figure DDA0003361819830000011

Description

螺环黄烷醇生物碱及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物碱技术领域，尤其涉及一种螺环黄烷醇生物碱及其制备方法和应用。
背景技术
茶叶是世界三大无酒精饮料之一。目前，绿茶是中国生产和销售规模最大的茶类，并以其独特的风味和丰富的种类深受广大消费者的喜爱。随着人们对美好生活的向往和追求地不断提高，健康问题也越来越多的得到关注。随着茶与健康领域的研究不断深入，茶叶所具有的潜在健康功效也逐渐被人们发掘和证实。大量研究表明，茶叶具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、减肥和预防神经退行性疾病等潜在功效。此外，随着现代天然产物化学技术和代谢组学分析技术在茶与健康研究中得到应用，发现茶叶所具有的潜在健康功效与茶叶中的各类活性成分有关。目前被研究报道的茶叶中活性成分主要包括多酚类，黄酮类和生物碱类化合物等。同时，在茶叶内含成分研究中引入高分辨率质谱仪，也为进一步发现更多的茶叶活性成分提供了可能。
炒青绿茶的加工工艺主要包括，杀青、揉捻和炒干，常见的炒青绿茶包括西湖龙井、碧螺春和出口眉茶等。其中英红九号(Camellia sinensis var.assamica)是无性系大叶种茶树品种，具有产量高、萌芽早和生育期长的特点，主要产地在中国广东省。以英红九号茶树鲜叶的一芽二叶或三叶为标准进行采摘，通过滚筒杀青机以200℃的温度对鲜叶进行杀青，此时高温使茶叶内的多酚氧化酶和过氧化物酶等失去活性，阻止多酚类化合物进一步发生酶促氧化反应。使用揉捻机对杀青后的加工叶进行揉捻处理，使茶叶在外力作用下发生形变，茶叶细胞产生破碎并使部分茶叶内含成分附着在加工叶表面，与外部环境产生更多接触，并形成紧结的条索外形。最后通过滚筒炒干机以180℃的温度将茶叶加工叶炒至含水率为4-5％。
杀青作为绿茶加工的关键工艺，使绿茶保留了更多的儿茶素类化合物，炒青工艺提供了长时、高温的加工环境，这些都为进一步在加工过程中产生儿茶素衍生物创造了可能。而这些儿茶素及其衍生物作为茶叶中的活性成分，与炒青绿茶的各种潜在健康功效密不可分。因此，针对炒青绿茶活性成分的分离和鉴定的研究必不可少。从大叶种炒青绿茶中研究开发出具有生物活性的生物成分，不仅对夏秋季茶树资源的开发利用提供解决方案，还能为天然成分药物的开发应用等领域做出重要贡献。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种对α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用的螺环黄烷醇生物碱，该螺环黄烷醇生物碱，由式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ或式Ⅳ所示结构表示：
Figure BDA0003361819810000021
Figure BDA0003361819810000031
本发明所要解决的技术问题之二是提供上述螺环黄烷醇生物碱在制备降血糖药物中的用途。
具体可提供一种降血糖药物，由上述螺环黄烷醇生物碱和药用辅料制成。
所述降血糖药物的药物剂型包括口服型、外用型和注射型。
所述口服型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂；所述外用型包括栓剂、捈剂、洗剂、膏剂、透皮贴剂；所述注射型包括注射液、混旋液、冻干粉。具体制备方法参照制药领域的常规方法制备，所用药用辅料根据剂型不同选择制药领域通用的辅料。
本发明所要解决的技术问题之三是提供上述螺环黄烷醇生物碱的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料粉碎
以大叶种炒青绿茶为原料，粉碎得到绿茶粉末；
(2)浸提
采用丙酮水溶液对步骤(1)所得绿茶粉末进行浸提得到浸提液；
(3)萃取除杂
对步骤(2)所得浸提液进行萃取处理和减压浓缩处理得到膏状提取物；
(4)分离纯化
对步骤(3)所得膏状提取物进行分离纯化处理得到螺环黄烷醇生物碱。
优选地，原料的选择以大叶种茶树鲜叶制成的绿茶。
更优选地，本发明所用提取原料由英红九号大叶种茶树鲜叶加工制作而成，属于不发酵的长炒青绿茶工艺。
优选地，步骤(2)中，丙酮水溶液的浓度为80％。
优选地，步骤(3)中，萃取处理采用依次使用二氯甲烷和正丁醇的分级萃取工艺；采用二氯甲烷萃取时，保留萃取后母液；采用正丁醇萃取时，保留正丁醇层萃取液。
优选地，分离纯化处理包括将膏状提取物溶解后依次经过MCI gel CHP20P柱层析、Toyopearl HW-40F柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析和高效液相色谱柱洗脱。
优选地，分离纯化处理具体操作如下，如图1所示，将步骤(3)所得膏状提取物用浓度<10％的甲醇水溶液溶解后，按图1所示，通过MCI gel CHP20P柱层析，以甲醇与水作为流动相，按照甲醇与水的体积比依次为0:100、10:90、30:70、50:50、70:30、80:20和100:0进行梯度洗脱，收集合并得到C1-C6共6个组分；
其中C2和C3组分是由50％甲醇水和70％甲醇水洗脱得到的部分合并得到的，并分别通过Toyopearl HW-40F柱进行梯度洗脱，Toyopearl HW-40F柱采用与MCI gel CHP20柱相同的流动相及比例进行梯度洗脱，分别收集合并得到C2-1至C2-26共26个组分，和C3-1至C3-38共38个组分；
然后将50-80％甲醇水洗脱得到的C2-9至C2-11合并得到组分D，以及C3-11至C3-13合并得到组分E；
通过Sephadex LH-20凝胶柱分别对组分D和组分E进行梯度洗脱，Sephadex LH-20凝胶柱以无水乙醇作为流动相进行洗脱，随后收集并合并得到D1至D26共26个组分，和E1至E23共23个组分；
最后将D12组分和E5至E11组分分别采用Waters e2695高效液相色谱***和半制备色谱柱进行制备分离；其中半制备色谱柱采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18column(5μm，9.4mm×250mm)柱，流速2毫升/分钟，流动相为色谱级乙腈和超纯水；
D12组分洗脱条件为：0-35分钟，30％乙腈水等度洗脱，30.752分钟洗脱样品为上述式Ⅰ所示螺环黄烷醇生物碱；
E5至E11合并后的组分洗脱条件为：0-35分钟，25％乙腈水等度洗脱，15.621分钟洗脱样品为上述式Ⅳ所示螺环黄烷醇生物碱，23.701分钟洗脱样品为上述式Ⅲ所示螺环黄烷醇生物碱，30.605分钟洗脱样品含有上述式Ⅱ所示螺环黄烷醇生物碱，进一步按照25％乙腈水等度洗脱，19.463分钟洗脱样品为上述式Ⅱ所示螺环黄烷醇生物碱。
本发明所要解决的技术问题之四是提供上述螺环黄烷醇生物碱的检测方法，采用UPLC-Q-TOF-MS检测方法，流速0.2毫升/分钟；
流动相为：A相0.1％甲酸水，B相含0.1％甲酸的乙腈；
洗脱条件如下：0-0.5分钟，5％乙腈水；0.5-1.5分钟，5％乙腈水-10％乙腈水；1.5-4分钟，10％乙腈水-23％乙腈水；4-7分钟，23％乙腈水-30％乙腈水；7-9分钟，30％乙腈水-35％乙腈水；9-9.5分钟，35％乙腈水-43％乙腈水；9.5-10.5分钟，43％乙腈水-55％乙腈水；10.5-11.5分钟，55％乙腈水-65％乙腈水；11.5-12.5分钟，65％乙腈水-85％乙腈水；12.5-13.5分钟，85％乙腈水-95％乙腈水；13.5-15分钟，95％乙腈水；15-17分钟，5％乙腈水。
检测到上述螺环黄烷醇生物碱(式Ⅰ)去质子化离子分子量为578.1295，保留时间为10.837分钟；
螺环黄烷醇生物碱(式Ⅱ)去质子化离子分子量为594.1266，保留时间为9.874分钟；
螺环黄烷醇生物碱(式Ⅲ)去质子化离子分子量为426.1202，保留时间为9.700分钟；
螺环黄烷醇生物碱(式Ⅳ)去质子化离子分子量为442.1155，保留时间为8.632分钟。
本发明的有益效果体现在：
1、本发明所得具有生物活性的螺环黄烷醇生物碱对α-葡萄糖苷酶活性有一定抑制作用，可以用于制备降血糖药物，对农业和医药领域具有重要的意义，为有效开发利用大叶种炒青绿茶提供了更为广阔的前景。
2、本发明螺环黄烷醇生物碱的制备方法工艺简单，容易实施，成本较低，具有非常好的应用前景。
3、本发明螺环黄烷醇生物碱的检测方法工艺简单，容易实施，准确率高，可用于寻找含有本发明螺环黄烷醇生物碱的生物资源，增加本发明螺环黄烷醇生物碱获取路径，提高其利用度。
附图说明
图1为螺环黄烷醇生物碱Ⅰ-Ⅳ提取分离流程图。
图2为大叶种绿茶甲醇提取物及螺环黄烷醇生物碱Ⅰ-Ⅳ的总离子流图。
图3为螺环黄烷醇生物碱Ⅰ-Ⅳ在负离子模式下的二级质谱离子碎片。
图4为半制备HPLC分离螺环黄烷醇生物碱Ⅰ-Ⅳ的液相图以及其对应的验纯图和紫外吸收图(UV光谱)。
图5为螺环黄烷醇生物碱Ⅰ-Ⅳ实测CD谱及其骨架化合物的实测CD谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1螺环黄烷醇生物碱及其制备
1.1螺环黄烷醇生物碱的说明
螺环黄烷醇生物碱的结构如式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ或式Ⅳ所示结构表示：
Figure BDA0003361819810000081
Figure BDA0003361819810000091
式Ⅰ所示的螺环黄烷醇生物碱((–)-8-(5″′S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-spiro-γ-lactoneepicatechin-3-O-gallate)，式Ⅱ所示的螺环黄烷醇生物碱((–)-8-(5″′S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-spiro-γ-lactoneepigallocatechin-3-O-gallate)，式Ⅲ所示的螺环黄烷醇生物碱((–)-8-(5″′S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-spiro-γ-lactoneepicatechin)和式Ⅳ所示的螺环黄烷醇生物碱((–)-8-(5″′S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-spiro-γ-lactone epigallocatechin)依次命名为螺环黄烷醇生物碱Ⅰ、螺环黄烷醇生物碱Ⅱ、螺环黄烷醇生物碱Ⅲ和螺环黄烷醇生物碱Ⅳ。
1.2制备方法及结果
(1)取4.5公斤大叶种炒青绿茶，对其粉碎处理，得到绿茶粉末；
(2)如图1所示，向绿茶粉末中加入20升80％丙酮水溶液，常温浸提24小时，然后在70Hz下超声浸提2小时，之后过滤得到滤液；按上述步骤浸提六次，通过减压蒸馏获得900克浸膏(组分A)；
然后用3升二氯甲烷对上述浸提液进行常温萃取，震荡摇匀并静置后，下层即为二氯甲烷萃取液，按上述步骤萃取七次，保留上层经二氯甲烷萃取后的母液，通过减压蒸馏浓缩获得组分B；
最后用3升正丁醇对上述经二氯甲烷萃取后的浓缩母液进行常温萃取，震荡摇匀并静置后，取上层正丁醇层，即为正丁醇萃取液，同样方法萃取五次后，合并正丁醇萃取液，减压浓缩至膏状，得正丁醇部位浸膏580克(组分C)并保留这一目标提取物；
(3)如图1所示，上述将正丁醇部位膏状提取物(组分C)用<10％的甲醇水溶液溶解后，按图1所示，通过MCI gel CHP20P柱层析，MCI gel柱使用甲醇与水作为流动相，按照甲醇与水的体积比依次为0:100、10:90、30:70、50:50、70:30、80:20和100:0进行梯度洗脱，收集合并得到C1-C6共6个组分。
其中C2和C3组分是由50％甲醇水和70％甲醇水洗脱得到的部分合并得到的，并分别通过Toyopearl HW-40F柱进行梯度洗脱，Toyopearl HW-40F柱采用与MCI gel CHP20柱相同的流动相及比例进行梯度洗脱，分别收集合并得到C2-1至C2-26共26个组分，和C3-1至C3-38共38个组分。
然后将50％-80％甲醇水洗脱得到的C2-9至C2-11合并得到组分D，以及C3-11至C3-13合并得到组分E。
通过Sephadex LH-20凝胶柱分别对组分D和组分E进行梯度洗脱，Sephadex LH-20凝胶柱以无水乙醇作为流动相进行洗脱，随后收集并合并得到D1至D26共26个组分，和E1至E23共23个组分。最后将D12组分采用Waters e2695高效液相色谱***和半制备色谱柱进行制备分离。
其中半制备色谱柱采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 column(5μm，9.4mm×250mm)柱，流速2毫升/分钟，流动相为色谱级乙腈和超纯水，D12组分洗脱条件为：0-35分钟，30％乙腈水等度洗脱，得到螺环黄烷醇生物碱Ⅰ(即(–)-8-(5″′S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-spiro-γ-lactone epicatechin-3-O-gallate)(保留时间30.752分钟，质量4毫克)。
将E5至E11组分合并后采用Waters e2695高效液相色谱***和半制备色谱柱进行制备分离。其中半制备色谱柱采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 column(5μm，9.4mm×250mm)柱，流速2毫升/分钟，流动相为色谱级乙腈和超纯水，洗脱条件为：0-35分钟，25％乙腈水等度洗脱，得到：
螺环黄烷醇生物碱Ⅱ(即(–)-8-(5″′S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-spiro-γ-lactone epigallocatechin-3-O-gallate)(保留时间30.605分钟，质量5毫克)，
螺环黄烷醇生物碱Ⅲ(即(–)-8-(5″′S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-spiro-γ-lactone epicatechin)(保留时间23.701分钟，质量5毫克)
和螺环黄烷醇生物碱Ⅳ(即(–)-8-(5″′S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-spiro-γ-lactone epigallocatechin)(保留时间15.621分钟，质量4毫克)。
1.3螺环黄烷醇生物碱的性状验证
螺环黄烷醇生物碱Ⅰ的特性如下：
1)可溶于甲醇和DMSO，白色无定型粉末；
2)
Figure BDA0003361819810000121
nm：203.8，277.1；
3)IR(KBr)νmax(cm-1)：3204，2809，1809，1671，1632，1530；
4)HR-ESI-MS(负离子模式)：m/z＝578.1295([M-H]-，C29H24NO12 -理论计算值为578.1304)。
螺环黄烷醇生物碱Ⅱ的特性如下：
1)可溶于甲醇和DMSO，白色无定型粉末；
2)
Figure BDA0003361819810000122
nm：205.0，272.4；
3)IR(KBr)νmax(cm-1)：3386，1811，1675，1629，1535；
4)HR-ESI-MS(负离子模式)：m/z＝594.1266([M-H]-，C29H24NO13 -计算值为594.1253)。
螺环黄烷醇生物碱Ⅲ的特性如下：
1)可溶于甲醇和DMSO，白色无定型粉末；
2)
Figure BDA0003361819810000123
nm：200.3，279.5；
3)IR(KBr)νmax(cm-1)：3378，1809，1671，1632，1521；
4)HR-ESI-MS(负离子模式)：m/z＝426.1202([M-H]-，C22H20NO8 -计算值为426.1194)。
螺环黄烷醇生物碱Ⅳ的特性如下：
1)可溶于甲醇和DMSO，白色无定型粉末；
2)
Figure BDA0003361819810000124
nm：203.8，277.5；
3)IR(KBr)νmax(cm-1)：3247，1809，1671，1632，1536；
4)HR-ESI-MS(负离子模式)：m/z＝442.1155([M-H]-，C22H20NO9 -计算值为442.1144)。
螺环黄烷醇生物的核磁共振光谱数据如下所示：
Figure BDA0003361819810000131
Figure BDA0003361819810000141
Figure BDA0003361819810000142
注：1H NMR在500MHz，13C NMR在125MHz条件下测试，δ单位为ppm，耦合常数J单位为Hz，溶剂为氘代DMSO。
由上表以及图4、图5可以看出，四个新化合物均通过紫外光谱UV、红外光谱IR及1HNMR、13C NMR、ESI-HR-MS、1H-1H COSY，HSQC、HMBC和NOESY等二维核磁共振谱归属，证明了所得化合物的结构。
实施例2螺环黄烷醇生物碱对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用试验
用PBS(PH＝7.0)配制浓度为0.2U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，螺环黄烷醇生物碱Ⅰ-Ⅳ和作为阳性对照的阿卡波糖的浓度为50μmol/L，4-硝基苯酚-α-d-葡萄糖苷(PNPG，50μmol/L)。
移取40μL测试化合物(测试浓度分别为250μM，27.75μM，3μM，0.25μM，0.0275μM)的PBS混合溶液和60μLα-葡萄糖苷酶的PBS溶液，置于96孔板中混合，然后放置在37℃的培养箱中恒温反应15分钟。随后移取60μL的PNPG溶液添加至微孔中，并放置在37℃的培养箱中反应20分钟。最后使用酶标仪测得405nm紫外光下的吸光度。每组实验重复3次。空白组的条件设置与实验组相同，但使用等体积的PBS溶液替代α-葡糖糖苷酶溶液。抑制率的计算方法为：
抑制率(％)＝(E-S)/E×100
其中E为未添加测试样品的酶活性，S为添加测试样品的酶活性。
IC50值是根据Reed-Muench法计算获得，最终螺环黄烷醇生物碱Ⅰ-Ⅳ和阿卡波糖的抑制效果如下：
Figure BDA0003361819810000151
Figure BDA0003361819810000161
注：抑制率由平均值±误差表示(n＝3)；b为IC50＝对α-葡萄糖苷酶的最大抑制浓度的二分之一。
实验结果表明，螺环黄烷醇生物碱Ⅰ-Ⅳ对α-葡萄糖苷酶的活性都有显著的抑制效果，与报道的α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖相比，本发明螺环黄烷醇生物碱Ⅰ-Ⅳ的效果更好，螺环黄烷醇生物碱Ⅰ-Ⅳ的IC50值分别为3.34、5.47、22.50和15.38μmol/L，阿卡波糖的IC50值为181.63μmol/L。
α-葡萄糖苷酶广泛存在于各种生物包括人体的消化***中，α-葡萄糖苷酶可以水解碳水化合物，产生可被吸收的葡萄糖，从而引起血糖升高。因此，通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性来控制葡萄糖的释放，可以抑制进食后引起的高血糖。故开发α-葡萄糖苷酶活性的抑制剂，探究抑制α-葡萄糖苷酶的机制，对于防治糖尿病具有重要意义。
因此本发明所得螺环黄烷醇生物碱可应用于降血糖药物的制备。具体地说是将本发明螺环黄烷醇生物碱按医学上可接受的剂量和药学上所通用的辅料制成一种降脂减肥药物。该药物剂型包括口服型、外用型和注射型等。所述口服型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂等；所述外用型包括栓剂、捈剂、洗剂、膏剂、透皮贴剂等；所述注射型包括注射液、混旋液、冻干粉等。具体制备方法参照制药领域的常规方法制备。
实施例3黄烷醇生物碱的检测方法
检测仪器设备：安捷伦UPLC6545系列Q-TOF液质谱联用仪(安捷伦科技中国有限公司)，ACQUITY
Figure BDA0003361819810000171
HSS T3柱(2.1×100mm，1.8μm)。
茶样制备：将大叶种炒青绿茶粉碎机粉碎，得粉末状茶样。2g茶粉先后采用20mL石油醚和乙酸乙酯分别萃取3次作为预处理，以减少植物色素和咖啡因的干扰。然后用20mL的70％甲醇水超声提取6小时。浸提结束后将茶样浸提液过一次0.22微米滤膜后即得待分析样品液。
采用UPLC-Q-TOF-MS检测方法，流速0.2毫升/分钟。流动相：A相0.1％甲酸水，B相含0.1％甲酸的乙腈，洗脱条件：0-0.5分钟，5％乙腈水；0.5-1.5分钟，5％乙腈水-10％乙腈水；1.5-4分钟，10％乙腈水-23％乙腈水；4-7分钟，23％乙腈水-30％乙腈水；7-9分钟，30％乙腈水-35％乙腈水；9-9.5分钟，35％乙腈水-43％乙腈水；9.5-10.5分钟，43％乙腈水-55％乙腈水；10.5-11.5分钟，55％乙腈水-65％乙腈水；11.5-12.5分钟，65％乙腈水-85％乙腈水；12.5-13.5分钟，85％乙腈水-95％乙腈水；13.5-15分钟，95％乙腈水；15-17分钟，5％乙腈水。
实验结果：以螺环黄烷醇生物碱Ⅰ-Ⅳ为标品，如图2和图3所示，在大叶种绿茶甲醇提取物中检测到上述螺环黄烷醇生物碱Ⅰ去质子化离子分子量为578.1295，保留时间为10.837分钟；螺环黄烷醇生物碱Ⅱ去质子化离子分子量为594.1266，保留时间为9.874分钟；螺环黄烷醇生物碱Ⅲ去质子化离子分子量为426.1202，保留时间为9.700分钟；螺环黄烷醇生物碱Ⅳ去质子化离子分子量为442.1155，保留时间为8.632分钟。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.螺环黄烷醇生物碱，其特征在于，其结构式如下：
Figure FDA0003361819800000011
2.如权利要求1所述螺环黄烷醇生物碱在制备降血糖药物中的应用。
3.降血糖药物，其特征在于，由如权利要求1所述螺环黄烷醇生物碱和药用辅料制成。
4.如权利要求3所述降血糖药物，其特征在于，所述降血糖药物的药物剂型为口服型、外用型或注射型。
5.如权利要求1所述螺环黄烷醇生物碱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原料粉碎
以大叶种炒青绿茶为原料，粉碎得到绿茶粉末；
(2)浸提
采用丙酮水溶液对步骤(1)所得绿茶粉末进行浸提得到浸提液；
(3)萃取除杂
对步骤(2)所得浸提液进行萃取处理和减压浓缩处理得到膏状提取物；
(4)分离纯化
对步骤(3)所得膏状提取物进行分离纯化处理得到螺环黄烷醇生物碱。
6.如权利要求5所述螺环黄烷醇生物碱的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，丙酮水溶液的浓度为80％。
7.如权利要求5或6所述螺环黄烷醇生物碱的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，萃取处理采用依次使用二氯甲烷和正丁醇的分级萃取工艺；采用二氯甲烷萃取时，保留萃取后母液；采用正丁醇萃取时，保留正丁醇层萃取液。
8.如权利要求5或6所述螺环黄烷醇生物碱的制备方法，其特征在于，分离纯化处理包括将膏状提取物溶解后依次经过MCI gel CHP20P柱层析、Toyopearl HW-40F柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析和高效液相色谱柱洗脱。
9.如权利要求8所述螺环黄烷醇生物碱的制备方法，其特征在于，分离纯化处理具体操作如下，将步骤(3)所得膏状提取物用浓度<10％的甲醇水溶液溶解后，通过MCI gelCHP20P柱层析，以甲醇与水作为流动相，按照甲醇与水的体积比依次为0:100、10:90、30:70、50:50、70:30、80:20和100:0进行梯度洗脱，收集合并得到C1-C6共6个组分；
其中C2和C3组分是由50％甲醇水和70％甲醇水洗脱得到的部分合并得到的，并分别通过Toyopearl HW-40F柱进行梯度洗脱，Toyopearl HW-40F柱采用与MCI gel CHP20柱相同的流动相及比例进行梯度洗脱，分别收集合并得到C2-1至C2-26共26个组分，和C3-1至C3-38共38个组分；
然后将50-80％甲醇水洗脱得到的C2-9至C2-11合并得到组分D，以及C3-11至C3-13合并得到组分E；
通过Sephadex LH-20凝胶柱分别对组分D和组分E进行梯度洗脱，Sephadex LH-20凝胶柱以无水乙醇作为流动相进行洗脱，随后收集并合并得到D1至D26共26个组分，和E1至E23共23个组分；
最后将D12组分和E5至E11组分分别采用Waters e2695高效液相色谱***和半制备色谱柱进行制备分离；其中半制备色谱柱采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 column柱，流速2毫升/分钟，流动相为色谱级乙腈和超纯水；
D12组分洗脱条件为：0-35分钟，30％乙腈水等度洗脱，30.752分钟洗脱样品为权利要求1中式Ⅰ所示螺环黄烷醇生物碱；
E5至E11合并后的组分洗脱条件为：0-35分钟，25％乙腈水等度洗脱，15.621分钟洗脱样品为权利要求1中式Ⅳ所示螺环黄烷醇生物碱，23.701分钟洗脱样品为权利要求1中式Ⅲ所示螺环黄烷醇生物碱，30.605分钟洗脱样品含有权利要求1中式Ⅱ所示螺环黄烷醇生物碱，进一步按照25％乙腈水等度洗脱，19.463分钟洗脱样品为权利要求1中式Ⅱ所示螺环黄烷醇生物碱。
10.如权利要求1所述螺环黄烷醇生物碱的检测方法，其特征在于，采用UPLC-Q-TOF-MS检测方法，流速0.2毫升/分钟；
流动相为：A相0.1％甲酸水，B相含0.1％甲酸的乙腈；
洗脱条件如下：
0-0.5分钟，5％乙腈水；
0.5-1.5分钟，5％乙腈水-10％乙腈水；
1.5-4分钟，10％乙腈水-23％乙腈水；
4-7分钟，23％乙腈水-30％乙腈水；
7-9分钟，30％乙腈水-35％乙腈水；
9-9.5分钟，35％乙腈水-43％乙腈水；
9.5-10.5分钟，43％乙腈水-55％乙腈水；
10.5-11.5分钟，55％乙腈水-65％乙腈水；
11.5-12.5分钟，65％乙腈水-85％乙腈水；
12.5-13.5分钟，85％乙腈水-95％乙腈水；
13.5-15分钟，95％乙腈水；
15-17分钟，5％乙腈水。
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