CN114015804B

CN114015804B - 一种丁香疫霉的特异性检测靶标Psyri_s00018g00015.1及其应用

Info

Publication number: CN114015804B
Application number: CN202111517439.8A
Authority: CN
Inventors: 戴婷婷; 周紫薇; 焦彬彬; 俞萱; 徐洁莹
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2021-12-13
Filing date: 2021-12-13
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2041-12-13
Also published as: CN114015804A

Abstract

本发明公开了一种丁香疫霉(Phytophthora syringae)的检测新靶标Psyri_s00018g00015.1及其检测引物、检测试剂盒和检测方法，该检测靶标Psyri_s00018g00015.1的蛋白序列如SEQ ID NO：1所示，编码该蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。同时，本发明还公开了特异性检测靶标Psyri_s00018g00015.1的RPA检测技术的特异性引物及探针组合，其正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO:4所示，探针序列如SEQ ID NO：5所示。本发明发现了丁香疫霉新的检测靶标，为丁香疫霉的检测提供了新的检测途径，同时基于该靶标开发的RPA‑LFD检测引物和探针，能够实现丁香疫霉的特异性检测，灵敏度高。

Description

一种丁香疫霉的特异性检测靶标Psyri_s00018g00015.1及其应用

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种丁香疫霉的特异性检测靶标Psyri_ s00018g00015.1及其应用。

背景技术

疫霉（Phytophthora）正式报道有100多个种, 许多疫霉都有严重危害农业生产安全的记录，可以说个个是农作物的毁坏者，轻则造成缺苗断垄，重则造成严重的产量损失，甚至绝产。因此，防止外来有害检疫性疫霉菌传入我国具有重要意义。丁香疫霉（P. syringae）是疫霉属病原菌，能够对寄主植物造成根腐、枝干流胶等症状，引起柑橘类果实褐腐，目前该病原菌广泛分布在全球各个盛产柑橘的地区，在我国尚未发现，是我国重要进境检疫对象。中国每年从国外进口大量柑橘类水果，包括葡萄柚、脐橙等，该病原菌有伴随进口产品进入我国的风险。2011 年天津口岸从美国脐橙上截获丁香疫霉（P. syringae），各地检疫机关多次从进口水果中发现该疫霉，2013 年和 2015年仅从美国进境水果上已分别截获6和14批次。

不同的靶标序列检测的特异性和灵敏度存在一定的差距，因选择的目标靶序列不同、片段大小不同，结果都会有很大差别。发掘特异性好的靶基因是目前丁香疫霉（P. syringae）检测技术的核心。靶标基因的选择要确保其在种内的不同菌株间的高度保守，而在种间变异性较高。发掘高信赖度特异性分子检测靶标并基于新靶标建立灵敏、准确的丁香疫霉（P. syringae）检测技术体系对提升对丁香疫霉的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。

发明内容

针对现有技术中丁香疫霉生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种新的丁香疫霉的检测新靶标Psyri_s00018g00015.1及其靶标建立的RPA-LFD检测引物组合物。本发明另一目的是提供上述丁香疫霉的RPA-LFD检测方法。本发明建立的快速检测丁香疫霉的方法，通过特异性和灵敏度评价，可用于实际样品的检测，为丁香疫霉的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本研究根据已公布的疫霉基因组序列 (樟疫霉P. cinnamomi，大豆疫霉 P. sojae，橡树疫霉P. ramorum，致病疫霉P. infestans，辣椒疫霉P. capsici)以及CGRB测序中心获得的疫霉基因组序列，包括丁香疫霉（P. syringae）、冬生疫霉（P. hibernalis）、烟草疫霉（P. nicotianae）、豇豆疫霉(P. vignae)、栗黑水疫霉（P. cambivora）、樟疫霉(P. cinnamomi)、樟疫霉变种等共计15种疫霉的全基因组序列分析，通过Blast 序列搜索，序列提取、比对与分析，挖掘大规模的基因组数据库，从而发掘疫霉菌的检测靶标。通过全基因组比对，共计获得丁香疫霉特异性检测靶标1131个；随机从丁香疫霉1131个特异性基因中挑选出部分基因作为候选基因，设计了并筛选特异性引物。采用RPA-LFD技术对设计的特异性引物进行验证。特异性评价选择与丁香疫霉不同种（冬生疫霉；栗黑水疫霉；寄生疫霉；致病疫霉；木香疫霉；草莓疫霉；苎麻疫霉等）和不同属的菌（平头炭疽菌；茄镰刀菌；稻瘟病菌；立枯丝核菌；大丽轮轮枝菌；终极腐霉）的DNA作为模板，进行验证，最终获得1个丁香疫霉检测新靶标基因Psyri_s00018g00015.1。

第一方面，本发明提供了一种丁香疫霉的特异性检测靶标Psyri_ s00018g00015.1，所述检测靶标的蛋白序列如SEQ ID NO：1所示：

MTSTREASDQSSPTTHTPERLRSQQQEEEEDIAPPLEYVHLKDTILPPSILALSHITKELNLLLMTPDEAAVEAAATGDTEWMIYLLARFKYFDNEETVAETAAVHGHLQMVKMVAFHFYDYGSFIKI（SEQ ID NO.1）。

另一方面，本发明提供了一种丁香疫霉的特异性检测靶标Psyri_ s00018g00015.1，所述检测靶标的核苷酸列如SEQ ID NO：2所示：

ATGACGTCCACGCGTGAGGCGTCTGACCAGAGCAGCCCCACCACCCACACCCCAGAGCGTCTACGCTCACAGCAGCAAGAAGAAGAAGAAGATATCGCCCCTCCCCTCGAATATGTCCACCTCAAAGACACCATTTTGCCCCCCTCCATTCTGGCTCTGTCACATATCACAAAAGAGCTCAATCTTTTGCTCATGACCCCAGACGAAGCGGCTGTTGAAGCCGCAGCAACGGGCGACACTGAGTGGATGATTTACCTATTGGCCAGATTTAAGTACTTTGACAACGAAGAGACGGTTGCCGAGACGGCGGCTGTCCATGGGCACCTCCAGATGGTGAAAATGGTGGCATTCCACTTTTACGACTACGGAAGTTTCATCAAGATATGA（SEQ ID NO.2）。

另一方面，本发明还提供了一种检测丁香疫霉的引物和探针组合，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，所述反向引物序列如SEQ IDNO：4所示，所述探针序列如SEQ ID NO：5所示。

Psyri015.1F:CCAGAGCGTCTACGCTCACAGCAGCAAGAAGAAGA（SEQ ID NO：3）；

Psyri015.1R:TGATGAAACTTCCGTAGTCGTAAAAGTGGAATGC（SEQ ID NO：4）；

Psyri015.1P：5'-CGAAGCGGCTGTTGAAGCCGCAGCAACGGGGACACTGAGTGGATG-3'；（SEQID NO：5），其5'端用FAM标记，3'端用C3Spacer修饰，且在探针的序列中间距5'端的30bp处进行THF修饰。

另一方面，本发明还提供了一种检测丁香疫霉的试剂盒，至少包括1次用量的含有上述的引物和探针组合的检测溶液。

进一步地，所述试剂盒还包括：装有冻干酶粉的Twist Amp 反应单元管、缓冲液Buffer、MgAc、去离子水、HybriDetect assay buffer、侧流层析试纸条。

另一方面，本发明还提供了所述特异性检测靶标Psyri_s00018g00015.1、所述的引物和探针组合以及所述的试剂盒在检测丁香疫霉中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种丁香疫霉的检测方法，其特征在于，

1）提取待测样本DNA；

2）以DNA为模板，利用本发明所述的引物（SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4）和探针（SEQID NO.5）组合或本发明所述的试剂盒进行RPA扩增；

其中，所述RPA扩增：向装有冻干酶粉的 0. 2 mL Twist Amp 反应单元管 (Twist Amp nfo kits，Twist) 中加入缓冲液Buffer 29.5μL，10μM的上游引物（SEQ IDNO.3）2.1μL，10μM的下游引物（SEQ ID NO.4）2.1μL，探针（SEQ ID NO.5）0.6μL，DNA 2.0μL，MgAc 2.5μL加在PCR管盖内部，去离子水补足至50μL；将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于39℃金属浴上反应30min，温育4 分钟，将反应管再次混匀，离心 3-5 s，放入水浴锅39℃继续反应30 min。

3）应用侧流层析试纸条进行RPA扩增产物检测；

取RPA反应产物10μL加入190μL的 HybriDetect assay buffer (MileniaBiotec, Giessen, Germany)进行稀释，稀释后取10μL滴在试纸条的 HybriDetect 1strip。另一端试纸条垂直***100μL 的HybriDetect assay buffer中，室温放置5min。

当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有丁香疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有丁香疫霉。

与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1）本发明提供了一个新的且高信赖度特异性丁香疫霉分子检测靶标Psyri_ s00018g00015.1，为丁香疫霉的检测提供了一个新的检测途径。

2）基于该新靶标建立灵敏、准确、高通量的RPA-LFD检测技术体系，克服了现有技术中丁香疫霉的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测丁香疫霉的问题。本发明检测方法与常规PCR相比，检测速度快，不必经过变性、退火、延伸三个步骤，RPA反应的最适温度在25℃-40℃之间，无需变性，在常温下20min左右即可完成反应。不需要复杂仪器，能较好满足对丁香疫霉的现场检测，对提升丁香疫霉的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。

3）本发明所提供的检测方法准确性高：本发明根据丁香疫霉菌检测新靶标Psyri_ s00018g00015.1的序列，设计特异性的检测引物和探针组合，LFD侧流层析试纸条检测结果目标条带清析，RPA检测浓度为10 pg·μL^-1，RPA侧流层析试纸条检测方法的灵敏度要比PCR方法高出100倍。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1 是基于丁香疫霉新发掘检测靶标靶标Psyri_s00001g00003. 1的引物RPA-LFD侧流层析试纸条灵敏度检测结果图；

图2是基于丁香疫霉新发掘检测靶标Psyri_s00018g00015.1的剩余引物RPA-LFD侧流层析试纸条种间特异性检测结果图；

图3是基于丁香疫霉新发掘检测靶标Psyri_s00018g00015.1的RPA-LFD侧流层析试纸条在种间特异性检测结果图；

图4是基于丁香疫霉新发掘检测靶标Psyri_s00018g00015.1的RPA-LFD的侧流层析试纸条在属间的特异性检测结果图检测结果图；

图5是基于丁香疫霉新检测靶标Psyri_s00018g00015.1设计的特异性引物普通PCR灵敏度验证电泳图；

图6是基于丁香疫霉新检测靶标Psyri_s00018g00015.1的RPA-LFD的侧流层析试纸条灵敏度验证电泳图；

图7是活体组织中丁香疫霉的RPA-LFD侧流层析试纸条检测结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1

通过全基因组序列比对获得了1100多个丁香疫霉特异性基因，随机从丁香疫霉1000多个特异性基因中挑选出部分基因作为候选基因(Psyri_s00018g00015.1、Psyri_ s00001g00003.1、Psyri_s00001g00023.1Psyri_s00016g00009.1、Psyri_ s00024g00013.1)，设计了并筛选特异性引物，表1列出其中5个靶标基因以及上下游检测引物（表1）。

表1 丁香疫霉菌5个特异性基因序列及引物表

选择与丁香疫霉不同种（雪松疫霉；冬生疫霉；栗黑水疫霉；瓜类疫霉；致病疫霉；恶疫霉等），以设计的各个靶标引物进行RPA-LFD检测。

样品检测：向装有冻干酶粉的 0.2 mL TwistAmp 反应单元管 (TwistAmp Basickits，Twist) 中加入缓冲液Buffer 29.5μL，10μM的上游引物2.1μL，10μM的下游引物2.1μL，探针0.6μL，DNA 2.0μL，MgAc 2.5μL加在PCR管盖内部，去离子水补足至50μL；将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于39℃金属浴上反应30min，温育4分钟，将反应管再次混匀，离心 3-5 s，放入水浴锅39℃继续反应30 min。

阴性对照：操作步骤同样品检测，将2.0μL模板DNA改为加入2.0μL灭菌ddH₂O。RPA反应结束后，应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内（Control line），一条位于检测区（Test line），则结果为阳性，表明样本中含有丁香疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区（Test line）没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有丁香疫霉。

以靶标Psyri_s00001g00003. 1为例，采用分子检测靶标Psyri_s00001g00003. 1设计的引物，引物序列如下：上游引物Psyri003.1F和下游引物Psyri003.1R，其实际的引物序列为：Psyri003. 1F: ATGCCCCGGCTCACAGTCAGACATAATGTTTTGG（SEQ ID NO: 8）;Psyri003. 1R: TTATTGGCAAACGTGTGGTGTGGTGGTCAGATGA（SEQ ID NO: 9）；选择与丁香疫霉不同种（雪松疫霉；冬生疫霉；栗黑水疫霉；瓜类疫霉；致病疫霉；恶疫霉等），结果显示该引物的特异性高，但灵敏度差，仅10 ng/uL，结果如图1所示。

以靶标Psyri_s00018g00015.1为例，其实际的引物序列为：Psyri015.1F:CCAGAGCGTCTACGCTCACAGCAGCAAGAAGAAGA（SEQ ID NO: 3）；Psyri015.1R:TGATGAAACTTCCGTAGTCGTAAAAGTGGAATGC（SEQ ID NO: 4）；选择与丁香疫霉不同种（雪松疫霉；冬生疫霉；栗黑水疫霉；瓜类疫霉；致病疫霉；恶疫霉等），RPA-LFD检测结果显示剩余所选引物的特异性差，结果如图2所示。

综合分子靶标的检测特异性和灵敏度考虑，筛选获得分子检测靶标Psyri_ s00018g00015.1为最终丁香疫霉的检测新靶标，以及特异性引物及探针组合，其正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO: 4所示，探针序列如SEQ ID NO：5所示。

实施例2

进一步验证RPA侧流层析试纸条检测方法的特异性，以丁香疫霉菌株和其它疫霉以及病原菌为供试材料（表2），RPA侧流层析试纸条检测方法的结果显示丁香疫霉的试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内（Control Line），一条位于检测区（Test Line），则结果为阳性，其它疫霉以及病原菌的试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区（TestLine）没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有丁香疫霉。

选择与丁香疫霉不同种（雪松疫霉；冬生疫霉；栗黑水疫霉；瓜类疫霉；致病疫霉；恶疫霉等）和不同属的菌（终极腐霉；木贼镰孢菌；平头炭疽菌；大丽轮枝菌；立枯丝核菌；稻瘟病菌等）的DNA作为模板，进行RPA-LFD(侧流层析试纸条检测)。

表2 用于丁香疫霉PCR检测的真菌和卵菌菌株及检测结果

图3是基于丁香疫霉新发掘检测新靶标Psyri_s00018g00015.1的RPA-LFD侧流层析试纸条特异性检测结果图；图中1：丁香疫霉（P. syringae）；2：雪松疫霉（P. lateralis）；3：冬生疫霉（P. hibernalis）；4：瓜类疫霉（P. melonis）；5：致病疫霉（ P. infestans）；6：恶疫霉（P. cactorum）；7：大豆疫霉（P. sojae）；8：阴性对照。图3中显示1号有2条带，其中一条带为质控线（Control Line），一条线为检测线（Test Line），因此呈阳性，其余只有一条质控线（Control Line）的条带呈阴性，表明样本中含有丁香疫霉；说明新发掘检测靶标Psyri_s00018g00015.1具有种间的特异性。

图4是基于高信赖度特异性分子检测新靶标Psyri_s00018g00015.1的RPA-LFD侧流层析试纸条在属间的特异性检测结果图检测结果图；1：丁香疫霉（P. syringae）；2：终极腐霉（Pythium ultimum）；3：木贼镰孢菌（Fusarium equiseti）；4：平头炭疽菌（Colletotrichum truncatum）；5：大丽轮枝菌（Verticilium dahliae）；6：立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）；7：稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）；8：阴性对照；图4中显示第1条有2条带，其中一条带为质控线（Control line），一条线为检测线，因此呈阳性，表明样本中含有丁香疫霉；其余只有一条质控线（Control line）的条带呈阴性。说明新发掘检测靶标Psyri_s00018g00015.1具有属间的特异性。

实施例3

用同样浓度的丁香疫霉的标准菌株的基因组DNA作为扩增模板，采用上下游引物Psyri015.1F/Psyri015.1R进行PCR扩增反应，比较两种方法的灵敏度；重复实验3次，以确定PCR法检测丁香疫霉基因组DNA的灵敏度；3次重复实验的结果一致。在基因组DNA浓度为1ng·μL^-1时，PCR检测能够检测出特异性条带，结果如图5所示，证明发生特异性扩增，检测结果判为阳性。利用本发明的RPA扩增反应后，LFD侧流层析试纸条检测结果如图6所示目标条带清析。由此可见，基于同一新发掘靶标Psyri_s00018g00015.1，RPA侧流层析试纸条检测方法的灵敏度要比PCR方法高出100倍。结果表明RPA检测浓度为10 pg·μL^-1，而PCR检测浓度为1ng·μL^-1时能看到目标条带，说明RPA检测的灵敏度高于PCR。但PCR检测过程需要2.5h，而RPA检测时间仅需30min，且不需要PCR仪等昂贵的仪器设备，操作程序简便，更有利在生产中推广应用。

实施例4

采用NaOH碱裂解法提取接种丁香疫霉的发病柑橘的DNA，将其作为模板用于PCR扩增。取1uL DNA溶液，按实施例3的方法，进行RPA-LFD检测。结果如图7所示，RPA扩增反应后，LFD侧流层析试纸条检测结果。结果显示，接种丁香疫霉的发病柑橘(2,3,4)能显示2条棕色条带，目标条带清析，能有效检测出丁香疫霉。而其它真菌和卵菌只有在质控区出现一条棕色条带，阴性对照也只有在质控区出现一条棕色条带。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种丁香疫霉的特异性检测靶标Psyri_s00018g00015.1及其应用

<130> 2021

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 128

<212> PRT

<213> 丁香疫霉(Phytophthora syringae)

<400> 1

Met Thr Ser Thr Arg Glu Ala Ser Asp Gln Ser Ser Pro Thr Thr His

1 5 10 15

Thr Pro Glu Arg Leu Arg Ser Gln Gln Gln Glu Glu Glu Glu Asp Ile

20 25 30

Ala Pro Pro Leu Glu Tyr Val His Leu Lys Asp Thr Ile Leu Pro Pro

35 40 45

Ser Ile Leu Ala Leu Ser His Ile Thr Lys Glu Leu Asn Leu Leu Leu

50 55 60

Met Thr Pro Asp Glu Ala Ala Val Glu Ala Ala Ala Thr Gly Asp Thr

65 70 75 80

Glu Trp Met Ile Tyr Leu Leu Ala Arg Phe Lys Tyr Phe Asp Asn Glu

85 90 95

Glu Thr Val Ala Glu Thr Ala Ala Val His Gly His Leu Gln Met Val

100 105 110

Lys Met Val Ala Phe His Phe Tyr Asp Tyr Gly Ser Phe Ile Lys Ile

115 120 125

<210> 2

<211> 387

<212> DNA

<213> 丁香疫霉(Phytophthora syringae)

<400> 2

atgacgtcca cgcgtgaggc gtctgaccag agcagcccca ccacccacac cccagagcgt 60

ctacgctcac agcagcaaga agaagaagaa gatatcgccc ctcccctcga atatgtccac 120

ctcaaagaca ccattttgcc cccctccatt ctggctctgt cacatatcac aaaagagctc 180

aatcttttgc tcatgacccc agacgaagcg gctgttgaag ccgcagcaac gggcgacact 240

gagtggatga tttacctatt ggccagattt aagtactttg acaacgaaga gacggttgcc 300

gagacggcgg ctgtccatgg gcacctccag atggtgaaaa tggtggcatt ccacttttac 360

gactacggaa gtttcatcaa gatatga 387

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

ccagagcgtc tacgctcaca gcagcaagaa gaaga 35

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

tgatgaaact tccgtagtcg taaaagtgga atgc 34

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

cgaagcggct gttgaagccg cagcaacggg gacactgagt ggatg 45

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

aagaagatat cgcccctccc ctcgaatat 29

<210> 7

<211> 192

<212> DNA

<213> 丁香疫霉(Phytophthora syringae)

<400> 7

atgccccggc tcacagtcag acataatgtt ttggggcgtg agcaggaaga cctggtgctt 60

ctccagctga cacctcattc tccaatgtgc aacgcaattg aaggtgagtt agacgaattt 120

attgctattg catgcgtcct caactcaacc atcaagcgtc atctgaccac cacaccacac 180

gtttgccaat aa 192

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

atgccccggc tcacagtcag acataatgtt ttgg 34

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

ttattggcaa acgtgtggtg tggtggtcag atga 34

<210> 10

<211> 204

<212> DNA

<213> 丁香疫霉(Phytophthora syringae)

<400> 10

atggtcaagt ccgagcgacg ctacatctcc atggaaaggc tctatttttg cgcggcgtac 60

atttgtgctc agcagagttt gacctttcgt gtgacggtgt ggggtgctac gttgagcgac 120

cccaagtacg tcgtcagctc taatctccgt ctgcgcaata tccgcgacat cactgtctgg 180

aatgacattt tggtcgacaa ttga 204

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

atggtcaagt ccgagcgacg ctacatctcc atgg 34

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

tcaattgtcg accaaaatgt cattccagac agtg 34

<210> 13

<211> 516

<212> DNA

<213> 丁香疫霉(Phytophthora syringae)

<400> 13

atgacgcaca tcagctggaa ttgtatccga gctcagcatt tttggagaag atacttggag 60

cactggctgg ggtatgaagt ctccaatcta cgactcgagc agtacaagca ctacattgcg 120

gcacgacggg cgccaccaat cgggactcga ctgaagcgca aaataacgga acgatacggg 180

acatggagac aagagaatgc agacgcacta ccatcggtgg cgcactattg tgactcgtac 240

gcaaccaagt ggtccatgaa gacgtggcga gctgctccgc aactggaata tatgtggaca 300

acctgtctac ggcagctgca cgggatagcg cggcgagaac gaaccaggtc cgcgacaaag 360

cttgaaggag ttcagttcca gctcagcctc gactgctacg cggatatagg aacggaaatg 420

gacccgcagg atcctcctcc agctccagcc aagtggctcc gaacagagtc gcagttgggc 480

aaacgactta cacaatacca ggaagctatt aactaa 516

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

gcactggctg gggtatgaag tctccaatct acga 34

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

cagttgcgga gcagctcgcc acgtcttcat ggac 34

<210> 16

<211> 423

<212> DNA

<213> 丁香疫霉(Phytophthora syringae)

<400> 16

atgcttggtg gcgccccacc gccgacatac aaagtggctt gtcgaaagcc acaattgatg 60

gatcaactgg ctaagtattt gctgagtaca ttgataccgt gggagttgga gggtaagcaa 120

cttcccttcg actttagcgg tgatggttta cttgaattgt gtagactgtg ggaccgttcg 180

gatgatgttc tcattaatcg acagcgttat cgtttaatag ccaatattcg tcgacgaggt 240

aaccaaaaga atgcagctgg tgacacgttt atgcattggc gtgctcgcaa tgttgactgg 300

tggaccgatg cttctcgacg tactgtcaac gaggacgaca ataatgttgt ttccaatgat 360

ggtctggaat ttgataccga gttccaggga gctaacacgt tgctgaagct ttgtttcaat 420

tag 423

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

acaattgatg gatcaactgg ctaagtattt gctg 34

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

attgtcgtcc tcgttgacag tacgtcgaga agca 34

Claims

1.一种丁香疫霉的特异性检测靶标Psyri_s00018g00015.1，其特征在于，所述检测靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种检测丁香疫霉的引物和探针组合，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，所述反向引物序列如SEQ ID NO：4所示，所述探针序列如SEQ ID NO：5所示。

3.一种检测丁香疫霉的试剂盒，其特征在于，至少包括1次用量的含有权利要求2所述的引物和探针组合的检测溶液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：装有冻干酶粉的Twist Amp 反应单元管、缓冲液Buffer、MgAc、去离子水、HybriDetect assay buffer、侧流层析试纸条。

5.权利要求1所述的特异性检测靶标Psyri_s00018g00015.1、权利要求2所述的引物和探针组合以及权利要求3或4所述的试剂盒在检测丁香疫霉中的应用。

6.一种丁香疫霉的检测方法，其特征在于，

1）提取待测样本DNA；

2）以DNA为模板，利用权利要求2所述的引物和探针组合或权利要求4所述的试剂盒进行RPA扩增；

3）应用侧流层析试纸条进行RPA扩增产物检测；当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有丁香疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有丁香疫霉。