CN110567951A - 基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，涉及基于CRISPR‑Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系及其检测方法。根据ASGV保守序列设计出crRNA，并制作用于比色检测的AuNP‑DNA，探究Cas12a蛋白体外切割反应时间和linker DNA浓度对检测效果的影响，建立最佳ASGV可视化检测体系及检测方法，该方法为恒温反应条件，并通过CRISPR‑Cas12a‑crRNA复合体识别病毒来提高特异性，且linker DNA具有通用性，不需要昂贵的双标记探针，借助低速离心可在40 min内检测多个样本，其检测下限为5.62×102copies/反应，灵敏度比RT‑PCR高100倍。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种苹果茎沟病毒的检测方法，特别是指基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系及其检测方法。
背景技术
苹果（Malus domesica）是世界栽培面积和产量最大的水果之一，主要种植于世界温带地区，具有很高的商业价值。2018——2019年世界苹果总产量预计为6860.0万t，中国苹果总产量预计将达3100.0万t。同时，苹果产业面临着严重的苹果病毒病问题，目前已知苹果病毒病17种，其中以ACLSV、ASPV、ASGV等潜隐性病毒在我国发生较为普遍，危害较大。潜隐性病毒通常不表现明显症状，但是树体感病后会减少16%-36%的生长量，降低17.0 %-73.7%产量，同时降低苹果根系对土壤营养物质的吸收和利用，使得施肥量增多30%-40%，对苹果品质和产量造成严重损害。
长期以来，由于人们对潜隐病毒缺乏认识，且在栽培中无法辨别铲除，致使苹果潜隐性病毒病的发生危害不断扩大。苹果病毒病尚无有效的化学或生物制剂，一旦感染，终身带毒，长期受害。嫁接是苹果病毒传播的主要途径，因此繁殖无病毒苗木，加强苗木和园区树体的病毒检疫，是防治病毒病的唯一途径和根本保障。
传统上，苹果病毒常采用指示植物法和酶联免疫吸附法进行检测。随着分子生物学发展，以核苷酸为基础的分子检测技术，如聚合酶链式反应（Polymerase chainreaction，PCR）等，已在苹果主要病毒的检测中得到广泛采用。专利CN201510051864.0提供的检测方法，采用感病材料的cDNA为模板，通过特异性引物扩增出产物，该产物再通过载体连接以及转化之后， 挑取阳性克隆扩繁培养并进行质粒提取和鉴定（酶切鉴定）进而获得阳性重组质粒标准品。PCR检测特异性强，准确性高，然而这种方法繁琐，不仅需要相关专业操作培训，还需采购PCR仪、照胶仪等体积较大、价格昂贵的设备。
CRISPR-Cas技术是一种最新涌现的基因组编辑技术，具有很强的靶标特异性，最近研究发现，cas12a蛋白在识别靶标后可以激发反式切割活性，及对体系中任意单链DNA进行不加区别的切割。利用这一特性已经开发出了通过观测荧光信号，来检测人类***状瘤病毒（HPV）并且能精确的区分其中两个亚型。同时，张峰团队将CRISPR技术与横向流动试纸条结合，开发出了可在2h之内检测出寨卡病毒（ZIKV）和登革热（DHF）的试纸条。除病毒之外，CRISPR已经应用于检测肠道微生物，通过粪便可以精确检测出艰难梭菌（Clostridiumdifficile）。但是，基于CRISPR的检测方法运用荧光检测时耗费大量时间且需要酶标仪等大型设备，随后开发的依靠试纸条的可视化检测虽然简便，但是需要添加大量昂贵的荧光探针才能观测，成本较高。
纳米金颗粒（AuNPs）比色检测是一种更加简单且廉价的检测形式，通过AuNPs的聚集将吸收峰移动到更长的波长，并将胶体溶液的颜色从红色变为紫色。因此可以采用纳米金颗粒（AuNPs）作为显色剂，结合CRISPR-Cas12a技术研发一种以苹果组织粗提液为模板的高效、低成本的病毒检测方法。
发明内容
为解决上述现有检测苹果病毒方法中存在的问题，本发明提出一种基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系及其检测方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系，所述检测体系包含Cas12a蛋白、crRNA、Linker DNA、AuNP-DNA复合物和NEBuffer 2.1。
所述AuNP-DNA复合物的制备方法为：
（1） 向200 μL的13 nm AuNP溶液中加入2 μL的1 wt % Tween20和10 μL的4 μM mPEG-SH，得混合溶液；
（2） 向步骤（1）得到的混合溶液中加入10 μL 100 μM硫醇化DNA1，并加入50 μL 4MNaCl，室温下老化60 min，得处理液；
（3） 将处理液置于离心机中4 ℃ 14000 rpm离心10 min除去上清液，得沉淀；
（4） 用PBST溶液重悬步骤（3）的沉淀，反复离心重悬三次后加入200 μL PBST溶液得到AuNP-DNA1；
（5） 参照步骤（1）-（4）制备AuNP-DNA2；
（6） 将AuNP-DNA1和AuNP-DNA2各取5 μL混合，向混合液加入2.8 μL 4 M NaCl溶液，得到用于比色检测的AuNP-DNA复合物。
所述步骤（1）中13 nm AuNP溶液的物质的量浓度为0.1 mg/mL。
所述步骤（2）中DNA1序列如SEQ ID NO.1所示，DNA2序列如SEQ ID NO.2所示。
所述crRNA的制备方法为：以ASGV-T7-crRNA-F和ASGV-crRNA-R为引物，经PCR后回收产物并进行反转录得crRNA；其中ASGV-T7-crRNA-F序列如SEQ ID NO.4所示、ASGV-crRNA-R序列如SEQ ID NO.5所示。
所述Linker DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
所述的苹果茎沟病毒可视化检测体系的检测方法，步骤如下：
①将Cas12a蛋白和crRNA混合后，加入14.5μLNEBuffer 2.1，在37℃加热仪器中温浴5min进行预组装；
② 向步骤①的反应管中加入linker DNA和待测样品，在37 ℃加热仪器上温浴30min；
③ 取5μL步骤②的反式切割产物加入到AuNP-DNA复合物溶液中；
④ 在室温下静置10 min后，用微型离心机离心1 min，观察结果，颜色保持红色不变即为阳性，颜色变为粉色即为阴性。
所述步骤①中Cas12a蛋白的浓度为1μM、用量为4μL，crRNA的浓度为10μM、用量为0.5μL。
所述步骤②中linker DNA的浓度为10μM、用量为0.5μL，待测样品的量为0.5μL。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明将CRISPR技术和AuNP-DNA结合用于检测ASGV，通过制备价格低廉的AuNP-DNA复合物溶液，并依靠cas12a-crRNA蛋白复合体识别病毒序列后对linker DNA进行切割，阻止AuNP-DNA发生交联反应，实现对ASGV的可视化检测。本发明不需要昂贵的双标记探针，且制备的linker DNA具有通用性，适用于对任何病毒进行检测，且在等温反应条件，40 min之内就可以完成对大量样本的检测。
2、本发明建立了一种基于CRISPR-Cas12a技术和AuNP-DNA复合物来快速检测ASGV的方法。该方法为恒温反应条件，并通过CRISPR-cas12a-crRNA识别来提高特异性，且linker DNA具有通用性，不需要昂贵的双标记探针，借助低速离心可在40 min内检测多个样本，其检测下限为5.62×102copies/反应，灵敏度比RT-PCR高100倍。在对51份田间样品进行检测时，该方法与RT-PCR相比阳性检出率一致率为98.04%，一致率高，具有良好的特异性。
3、本发明通过制备低廉的、可通用的AuNP-DNA复合物溶液来省去合成高昂的荧光探针，开发出了一种全新的、低成本的CRISPR可视化检测方法。通过对该检测方法反应时间，liner DNA浓度等方面的优化建立起了成本低，特异性强，灵敏度高的ASGV检测方法。该方法的检测成本上为3元/样本，远远低于其他可视化检测方法；在灵敏度上，该方法比普通RT-PCR高100倍；在特异性上，依靠CRISPR可将精确度提高到单碱基的差异；在反应温度上，该方法不需要RT-PCR热变性过程，也不需要任何精密的热循环仪器，反应恒温37℃下就可以进行；在时间上，利用Cas12a蛋白的反式切割活性可以在30 min之内将体系中的linkerDNA完全切割，从而保持AuNP溶液的颜色保持不变，缩短检测时间。同时，该方法与RT-PCR相比依靠crRNA和cas12a蛋白来识别ASGV省去了对引物反复筛选等步骤，且操作简便，不需要专业人员操作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为linker DNA浓度和反应时间（图A-B）；A:1-6：0.5 μM、1.0 μM、1.5 μM、2.5 μM、3.5 μM、5.0 μM；N：未加入linker DNA；B：1-5：10 min、20 min、30 min、40 min 、50 min；N：未加入linker DNA。
图2为苹果茎沟病毒RT-PCR和CRISPR-Cas12a纳米金比色法灵敏度试验（图A-B）；A：RT-PCR；B：CRISPR-Cas12a纳米金比色法；1-10：5.62×109-5.62×102拷贝/反应（质粒）；N：阴性对照；M：500 Marker。
图3为苹果茎沟病毒RT-PCR和CRISPR-Cas12a纳米金比色法试验（A-B）；图A：RT-PCR；图B：RT-PCR；M：500 DNA marker；N：阴性对照；1-13：田间样品。
图4为河南省三个苹果产区ASGV RT-PCR、CRISPR-Cas12a纳米金比色检测结果；N：阴性对照；1-51：田间样本。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验材料
供试寄主植物
2018年5-8月，从郑州、三门峡和洛宁采集了51份苹果叶片，其中有症状叶片30份，无明显症状叶片21份。采集样品时标好品种、株系、有无表症以及时间地点等基本信息，带回实验室，迅速用液氮冷冻，-80℃冰箱保存备用。
主要试剂、仪器
Cas12a蛋白（NEB公司、北京）、mPEG-SH（麦克林）、PBST缓冲液（索莱宝）、Tween-20（索莱宝）、Universal DNA 纯化回收试剂盒（北京天根，DP214）、T7 High Yield TranscriptionKit (ThermoFisher Scientific）、RNA反转录试剂盒（TAKARA，中国）、PCR仪（eppendorf）、离心机（eppendorf）、恒温水浴锅（精宏）、电泳仪（Bio-Rad）、涡旋仪（Vortex-Genie2）、高压灭菌器（Zealway）、超净工作台（airtech）及核酸检测成像***（Bio-Rad）。
实施例
基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系的检测方法：
1. AuNP-DNA复合物制备
① 探针DNA以及linker DNA序列，DNA1序列如SEQ ID NO.1所示，DNA2序列如SEQ IDNO.2所示，Linker DNA序列如SEQ ID NO.3所示；由生工生物（上海，中国）合成：
② 向200 μL的0.1 mg/ml 13 nm AuNP溶液中加入2 μL的1 wt % Tween20和10 μL的4μM mPEG-SH（MW~5kDa）；
③ 向混合物中加入10 μL 100 μM硫醇化DNA1或DNA2，并加入50 μL 4M NaCl；在室温下老化60 min；
④ 在离心机中4 ℃ 14000 rpm离心10 min除去上清液；
⑤ 用PBST溶液重悬沉淀，反复离心重悬三次后加入200 μL PBST溶液得到AuNP-DNA1或AuNP-DNA2；
⑥ 将AuNP-DNA1和AuNP-DNA2各取5 μL混合，向混合液加入2.8 μL 4 M NaCl溶液，组成用于比色检测的纳米金溶液。
2. crRNA的制备
设计crRNA：比对NCBI数据库中苹果茎沟病病毒分离物的序列，选取ASGV高度保守的区域作为ASGV靶标来设计crRNA转录模板，crRNA转录模板的引物为ASGV-T7-crRNA-F和ASGV-crRNA-R，其中ASGV-T7-crRNA-F序列如SEQ ID NO.4所示、ASGV-crRNA-R序列如SEQ IDNO.5所示；ASGV靶标序列如SEQ ID NO.6所示；由生工生物（上海，中国）合成。
退火制备crRNA转录模板：
退火反应体系如下表1所示：
① PCR反应程序为：98 ℃ 30 s；98℃ 10 s，60 ℃ 30s，72℃ 15 s，循环35次；72℃10min；4℃终止反应；
② 采用Universal DNA 纯化回收试剂盒纯化PCR产物，步骤参照说明书，并检测DNA浓度；
③ 取2 μg DNA回收产物，采用T7 High Yield Transcription Kit (ThermoFisherScientific）反转录成crRNA，步骤参照说明书，检测浓度并稀释至10μM。
3. CRISPR-Cas12a反应体系
根据GenBank数据库中查找已登录ASGV外壳蛋白基因的全长序列（KY680265.1），通过与多个ASGV外壳蛋白序列进行对比，在其相对保守的区域设计特异性引物ASGV-F1（GGCAGAACTCTTTGAACGAAT）和ASGV-R1（GTATAAAGGCAGGCATGTCAAC），扩增序列包含crRNA靶标序列。以当地感病植株叶片cDNA为材料，扩增产物经纯化连接到PMD20-T载体，构建ASGV病毒质粒。序列测序，Blast比对分析得知，其与印度李分离物（登陆号：HE978837.1）序列相似度最高，为99.26 %。CRISPR-Cas12a在体外识别病毒DNA并激活反式切割体系如下表2：
① 将Cas12a蛋白和crRNA混合后，加入NEBuffer 2.1，在37℃加热仪器中温浴5 min进行预组装；
② 向步骤①的反应管中加入linker DNA和ASGV病毒质粒，在37 ℃加热仪器上温浴30min。
3.1 反应时间的调控
确定CRISPR-Cas12a将linker DNA时完全切割所用时间，以ASGV病毒标准质粒（5.62×109 copies/反应）作为靶标。反式切割时间分别设定为10 min、20 min、30 min、40 min 、50min，重复试验，确定最佳的反应时间。
结果与分析
将CRISPR-Cas12a反应体系linker DNA浓度分别设为0.5 μM、1.0 μM、1.5 μM、2.5 μM、3.5 μM、5.0 μM。在37℃条件下，反应30 min结束后，将反应产物加入到纳米金复合物溶液中。室温10 min后，短暂离心观测颜色变化；linker DNA浓度为1.5 μM时，颜色变化效果较好，与对照有明显差异（图1，A）。因此，将1.5 μM作为linker DNA的最佳浓度。
将CRISPR-Cas12a反应体系时间分别设为为10 min、20 min、30 min、40 min、50min，反应结束后，将反应产物加入到AuNP-DNA溶液中。室温10 min后，短暂离心观测颜色变化；当反应为40 min时，颜色不在随着时间变化，但当反应30 min时，已与对照有明显差异，（图1，A）。因此，将30 min作为最佳反应时间（图1，B）。
综上所述，确定加入1.5μM的linker DNA，反应30 min为最佳反应体系。
3.2 CRISPR-Cas12a灵敏度试验
以ASGV质粒为靶标，计算拷贝数，稀释出以5.62×109 为起始拷贝数，以10为倍数依次进行稀释。分别进行RT-PCR和CRISPR -Cas12a结合AuNP-DNA检测。
拷贝数的计算方法：
CRISPR -Cas12a结合AuNP-DNA比色法检测：
① 参照表2的体系，将Cas12a蛋白和crRNA混合后，加入NEBuffer 2.1，在37℃加热仪器中温浴5 min进行预组装；
② 向步骤①的反应管中加入linker DNA和ASGV病毒质粒，在37 ℃加热仪器上温浴30min；
③ 取5μL上述反应液加入到AuNP-DNA溶液中；
④ 室温下静置10 min中后，用微型离心机离心1 min，观察结果，如颜色保持红色不变即为阳性，颜色变为粉色即为阴性。
以ASGV病毒质粒为模板，以5.62×109copies/反应为初始浓度，以10为倍数依次进行稀释，同时设置阴性对照，分别进行RT-PCR扩增检测和CRISPR-Cas12a比色检测，RT-PCR扩增引物为ASGV-F1（GGCAGAACTCTTTGAACGAAT）和ASGV-R1（GTATAAAGGCAGGCATGTCAAC），产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，观察结果。
RT-PCR的灵敏度为5.62×104copies/反应；CRISPR-Cas12a比色检测的灵敏度为5.62×10 copies2/反应。CRISPR-Cas12a比色检测灵敏度比RT-PCR高100倍，两种方法检出率一致性较高，结果可靠（见图2）。
3.4 特异性试验
参照上述优化条件，分别以13个样品的cDNA为待检测样品，进行RT-PCR扩增反应和CRISPR -Cas12a结合AuNP-DNA比色法，同时设置阴性对照，比较分析检测方法在特异性上的差异。RT-PCR的检测结果如图3（A），CRISPR-Cas12a结合AuNP-DNA比色法的检测结果见图3（B）两种检测方法的检测结果一致，说明CRISPR-Cas12a结合AuNP-DNA比色法的特异性较好。
实施效果例
大田采集的51个田间样品，提取RNA并反转录为cDNA，参照实施例的优化条件，分别用实施例中的CRISPR-Cas12a结合AuNP-DNA比色法和RT-PCR检测对样品cDNA的病毒进行检测，同时设置阴性对照，RT-PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，观察结果，比较分析检测方法在特异性上的差异。
结果表明，CRISPR-Cas12a结合AuNP-DNA比色法检测含有ASGV病毒的样品数为32，RT-PCR检测出ASGV的样品数为31，结果说明CRISPR-Cas12a结合AuNP-DNA比色法比RT-PCR灵敏度更高（图4）。因此，本发明建立ASGV的CRISPR-Cas12a结合AuNP-DNA比色法，结果准确，可用于检测病毒含量低的大田样本。
讨论
在本发明中，开创性的将CRISPR技术和AuNP-DNA溶液进行结合用于检测ASGV，不仅实现了将两种技术的结合，同时还极大的降低了他们各自的成本，建立了基于CRISPR-Cas12a的AuNP-DNA比色检测法，填补了CRISPR技术在植物病毒检测领域的空白。该方法依靠CRISPR-cas12a技术提高特异性和灵敏度，同时，通过制备低廉的、可通用的AuNP-DNA溶液来省去合成高昂的荧光探针，开发出了一种全新的、低成本的可视化检测方法。
通过对该检测方法反应时间，liner DNA浓度等方面的优化，建立起了成本低，特异性强，灵敏度高的ASGV检测方法。该方法的检测成本上为3元/样本，远远低于其他可视化检测方法；在灵敏度上，该方法比普通RT-PCR高100倍；在特异性上，依靠CRISPR-cas12a-crRNA复合体可精准识别靶标序列；在反应温度上，该方法不需要RT-PCR热变性过程，也不需要任何精密的热循环仪器，反应恒温37℃甚至常温下就可以进行；在时间上，利用Cas12a蛋白的反式切割活性可以在30 min之内将体系中的linker DNA完全切割，从而保持AuNP-DNA复合物溶液的颜色保持不变，缩短检测时间。同时，该方法与RT-PCR相比，省去了对引物反复筛选等步骤，且操作简便，不需要专业人员操作。综上所述，基于CRISPR-Cas12a的纳米金比色检测方法非常适用于对大田样本的快速检测，有助于及时根除感病植株，从而最大限度地降低病毒传播相关的风险。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 河南农业大学
<120> 基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系及其检测方法
<160> 6
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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gtgttgcttg tagtattttt aaaaaaaaaa 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（30）
<400> 2
gtgtttagga tttgcttttt aaaaaaaaaa 30
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
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tcctaaacac cacaacgaac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
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<400> 4
gaaattaata cgactcacta taggg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
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gaggcaggtt cggaaagtaa cctgatctac aacagtagaa attccctata gtgagtcgta 60
ttaatttc 68
<210> 6
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<212> DNA
<213> 病毒（Virus）
<220>
<221> misc_difference
<222> 28
<400> 6
caggttactt tccgaacctg cctcgaaa 28
Claims (9)
1.基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系，其特征在于：所述检测体系包含Cas12a蛋白、crRNA、Linker DNA、AuNP-DNA复合物和NEBuffer 2.1。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系，其特征在于，所述AuNP-DNA复合物的制备方法为：
（1） 向200 μL的13 nm AuNP溶液中加入2 μL的1 wt % Tween20和10 μL的4 μM mPEG-SH，得混合溶液；
（2） 向步骤（1）得到的混合溶液中加入10 μL 100 μM硫醇化DNA1，并加入50 μL 4MNaCl，室温下老化60 min，得处理液；
（3） 将处理液置于离心机中4 ℃ 14000 rpm离心10 min除去上清液，得沉淀；
（4） 用PBST溶液重悬步骤（3）的沉淀，反复离心重悬三次后加入200 μL PBST溶液得到AuNP-DNA1；
（5） 参照步骤（1）-（4）制备AuNP-DNA2；
（6） 将AuNP-DNA1和AuNP-DNA2各取5 μL混合，向混合液加入2.8 μL 4 M NaCl溶液，得到用于比色检测的AuNP-DNA复合物。
3.根据权利要求2所述的基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系，其特征在于：所述步骤（1）中13 nm AuNP溶液的物质的量浓度为0.1 mg/mL。
4.根据权利要求2所述的基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系，其特征在于：所述步骤（2）中DNA1序列如SEQ ID NO.1所示，DNA2序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系，其特征在于，所述crRNA的制备方法为：以ASGV-T7-crRNA-F和ASGV-crRNA-R为引物，经PCR后回收产物并进行反转录得crRNA；其中ASGV-T7-crRNA-F序列如SEQ ID NO.4所示、ASGV-crRNA-R序列如SEQ ID NO.5所示。
6.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系，其特征在于：所述Linker DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
7.权利要求1-6任一项所述的苹果茎沟病毒可视化检测体系的检测方法，其特征在于，步骤如下：
①将Cas12a蛋白和crRNA混合后，加入14.5μLNEBuffer 2.1，在37℃加热仪器中温浴5min进行预组装；
② 向步骤①的反应管中加入linker DNA和待测样品，在37 ℃加热仪器上温浴30min；
③ 取5μL步骤②的反式切割产物加入到AuNP-DNA复合物溶液中；
④ 在室温下静置10 min后，用微型离心机离心1 min，观察结果，颜色保持红色不变即为阳性，颜色变为粉色即为阴性。
8.根据权利要求7所述的苹果茎沟病毒可视化检测体系的检测方法，其特征在于：所述步骤①中Cas12a蛋白的浓度为1μM、用量为4μL，crRNA的浓度为10μM、用量为0.5μL。
9.根据权利要求7所述的苹果茎沟病毒可视化检测体系的检测方法，其特征在于：所述步骤②中linker DNA的浓度为10μM、用量为0.5μL，待测样品的量为0.5μL。
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