CN114014922A

CN114014922A - 调控植物耐盐性的蛋白质及其编码基因与应用

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Publication number: CN114014922A
Application number: CN202210001867.3A
Authority: CN
Inventors: 江颖; 李瑞芬; 冯浩; 张海纹; 杜青伟
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2022-01-05
Filing date: 2022-01-05
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2042-01-05
Also published as: CN114014922B

Abstract

本发明公开了调控植物耐盐性的蛋白质及其编码基因与应用。该蛋白质的名称为HbSETF，其氨基酸序列是SEQ ID No.1。本发明的目的是如何调控植物的抗逆性，具体地，本发明的目的是如何提高植物的耐盐性。本发明通过将蛋白质HbSETF的编码基因导入到受体植物中，得到了过表达HbSETF基因的拟南芥转基因株系。实验证明，过表达HbSETF基因的拟南芥转基因株系在盐胁迫条件下的耐盐性显著增强，表明HbSETF基因异位表达可增强植物对盐胁迫的耐受性。本发明的HbSETF基因可用于植物的抗逆性育种。

Description

调控植物耐盐性的蛋白质及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及调控植物耐盐性的蛋白质及其编码基因与应用。

背景技术

土壤盐碱化是农业作物生产中的主要非生物胁迫。盐胁迫对植物的生长发育有重要影响。在盐处理下，植物的种子萌发、根长、株高和果实发育均受到显著抑制。盐胁迫对植物的危害主要在渗透压胁迫和离子胁迫等方面，它们破坏植物细胞膜结构，影响许多酶的活性和光合作用器官的功能，导致光合作用下降，使农作物生长受阻，并造成全球作物产量大幅下降。其中渗透胁迫是植物暴露在盐渍土中最先经历的胁迫，它会影响植物的生长。当盐含量达到阈值时，离子毒性会发生，超过该阈值，植物将无法维持离子稳态和生长。离子毒性和渗透胁迫作为初级胁迫，进而会引起氧化胁迫和一系列次级胁迫。为了减少盐胁迫对作物产量的影响，亟需植物例如谷类（cereal）植物的耐盐性品种。

目前，针对盐渍化土壤的两种主要技术是：用化学或物理方法改造土壤，以及通过生物技术培育耐盐作物品种。人们曾试图通过合理灌溉、淡水洗涤和施用化学改良剂等方法来改造盐碱地，但因成本高昂、见效慢而难以推广，并且增加了土壤的次生盐渍化，使土壤中添加了大量化学残留物质。通过常规育种计划提高作物耐盐性的尝试取得了一定的成功，但是，由于耐盐性在遗传和生理上的复杂性，成功产生的植物的耐盐性仍然相对较低。随着转基因技术的日趋完善，利用基因工程手段获得抗干旱耐盐渍的转基因植物，已成为当今植物生物技术领域研究的热点之一，选育抗盐碱、耐干旱能力强的植物，提高植物耐旱耐盐性是解决干旱和盐渍问题的一条经济而有效的途径。因此，提高植物的耐盐性，挖掘重要的耐盐遗传资源，对于培育耐盐性作物品种起着关键的作用，而植物的耐盐机理是培育转基因抗性品种的理论基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的抗逆性和/或如何提高植物的耐盐性。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质，名称为HbSETF，所述蛋白质可为下述任一种：

A1）氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2）将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1）所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3）在A1）或A2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

为了使A1）中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

所述标签蛋白包括但不限于：GST（谷胱甘肽巯基转移酶）标签蛋白、His6标签蛋白（His-tag）、MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP（增强型绿色荧光蛋白）、eCFP（增强型青色荧光蛋白）、eYFP（增强型黄绿色荧光蛋白）、mCherry（单体红色荧光蛋白）或AviTag标签蛋白。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质HbSETF的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质HbSETF的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质HbSETF且具有蛋白质HbSETF功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

进一步地，所述蛋白质可来源于野大麦（Hordeum brevisubulatum）。

本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述B1）至B7）中的任一种：

B1）编码所述蛋白质HbSETF的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6）含有B1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2）所述表达盒的转基因植物组织；

B7）含有B1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2）所述表达盒的转基因植物器官。

上述生物材料中，B1）所述核酸分子可为下述任一种：

C1）编码序列（CDS）是SEQ ID No.2的第101-1129位的cDNA分子；

C2）核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

SEQ ID NO.2的第101-1129位所示的核苷酸序列为蛋白质HbSETF编码基因（HbSETF基因）的核苷酸序列。本发明所述的蛋白质HbSETF基因（HbSETF基因）可以为任意能够编码蛋白质HbSETF的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

B1）所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2的第101-1129位所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。

SEQ ID NO.2的第101-1129位所示的DNA分子（HbSETF基因）编码氨基酸序列是SEQID No.1的蛋白质HbSETF。

本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

本文中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质HbSETF。

上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1）在所述基因转录水平上进行的调控；2）在所述基因转录后进行的调控（也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控）；3）对所述基因的RNA转运进行的调控（也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控）；4）对所述基因的翻译进行的调控；5）对所述基因的mRNA降解进行的调控；6）对所述基因的翻译后的调控（也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控）。

所述调控基因表达的物质具体可为B1）-B3）中任一所述的生物材料。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体（如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等）、黏粒（即柯斯质粒）、Ti质粒、病毒载体等。在本发明的一个实施例中，所述载体具体可为pCAMBIA1300。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的HbSETF基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得对逆境胁迫抗性提高的转基因细胞系及转基因植株。携带HbSETF基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。

本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia）,欧文氏菌（Erwinia）,根癌农杆菌属（Agrobacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）,产碱菌属（Alcaligenes）,假单胞菌属（Pseudomonas）,芽胞杆菌属（Bacillus）等。具体可为根癌农杆菌GV3101。

所述重组载体具体可为pCAMBIA1300-HbSETF，所述重组载体pCAMBIA1300-HbSETF是将pCAMBIA1300载体的EcoRI和SalI识别位点间的片段（小片段）替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第101-1129位的DNA片段，保持pCAMBIA1300载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。

所述重组微生物具体可为重组根癌农杆菌GV3101/pCAMBIA1300-HbSETF，所述重组根癌农杆菌GV3101/pCAMBIA1300-HbSETF含有编码序列为SEQ ID No.2的第101-1129位所示的HbSETF基因。

本发明还提供了一种培育抗逆植物的方法，所述方法包括提高目的植物中所述蛋白质HbSETF的含量和/或活性，得到抗逆性高于所述目的植物的抗逆植物。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质HbSETF的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质HbSETF的编码基因的表达量实现。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质HbSETF的编码基因的表达量通过将所述蛋白质HbSETF的编码基因导入所述目的植物实现。

具体地，所述提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量可通过将SEQ IDNo.2的第101-1129位所示的DNA分子导入所述目的植物实现。

在本发明的一个实施方案中，所述培育抗逆植物的方法包括如下步骤：

（1）构建包含SEQ ID No.2的第101-1129位所示DNA分子的重组载体；

（2）将步骤（1）构建的重组载体转入目的植物（如作物或拟南芥）中；

（3）经筛选和鉴定获得抗逆性高于所述目的植物的抗逆植物。

本发明还提供了所述蛋白质HbSETF，和/或，所述生物材料的下述任一种应用：

D1）所述蛋白质HbSETF，和/或，所述生物材料在调控植物抗逆性中的应用；

D2）所述蛋白质HbSETF，和/或，所述生物材料在制备调控植物抗逆性的产品中的应用；

D3）所述蛋白质HbSETF，和/或，所述生物材料在培育抗逆植物中的应用；

D4）所述蛋白质HbSETF，和/或，所述生物材料在制备培育抗逆植物的产品中的应用；

D5）所述蛋白质HbSETF，和/或，所述生物材料在植物育种中的应用。

上述应用中，所述抗逆性包括耐盐性、耐旱性、耐热性、耐寒性和/或耐强光性。

本发明还提供了所述培育抗逆植物的方法，和/或，所述蛋白质HbSETF的结构域在创制抗逆植物和/或植物育种中的应用，所述蛋白质HbSETF的结构域的氨基酸序列为SEQID No.1的第154-214位的多肽。

所述植物育种可为作物抗逆转基因育种，具体可为作物耐盐性转基因育种。

所述调控植物抗逆性可为提高植物抗逆性或降低植物抗逆性，具体可为提高植物耐盐性或降低植物耐盐性。

本文所述抗逆性包括耐盐性、耐旱性、耐热性、耐寒性和/或耐强光性，但不限于此。

具体地，所述抗逆性具体可为耐盐性。

本发明中，所述抗逆植物理解为不仅包含将所述HbSETF基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述抗逆植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

所述抗逆植物包括耐盐植物、耐旱植物、耐热植物、耐寒植物和/或耐强光植物但不限于此。

本文中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。例如，可为十字花科植物或禾本科植物。

本文中，所述植物可为作物（如农作物）。

本文中，术语“蛋白质HbSETF”、“转录因子HbSETF”和“HbSETF”具有相同的含义，可互换使用。

乙烯信号通路的识别和功能鉴定对于理解盐生植物对自然盐碱环境的适应具有重要意义。本发明利用野生大麦（Hordeum brevisubulatum）CBL相互作用蛋白激酶HbCIPK2基因启动子（proHbCIPK2）为诱饵筛选酵母单杂交文库，成功鉴定了一个由盐、干旱和ABA诱导的乙烯反应转录因子（Stress-responsive ERF-like Transcription Factor），命名为HbSETF。

转录因子HbSETF全长基因具有1029 bp的开放阅读框（ORF），编码342个氨基酸的蛋白质HbSETF，蛋白质HbSETF的氨基酸序列为SEQ ID No.1，编码序列（CDS）为SEQ ID No.2的第101-1129位。蛋白质HbSETF的分子量为36.5 kDa，等电点为4.7。所述蛋白质HbSETF包含一个由61个氨基酸组成的单一AP2结构域（氨基酸序列为SEQ ID No.1的第154-214位），其中含有保守的丙氨酸（A）和天冬氨酸（D），表明它是ERF家族的成员。AP2结构域包含保守的YRG和RAYD元件，它们可能分别在DNA结合和蛋白质相互作用中发挥关键作用。此外，蛋白质HbSETF的C端区域含有一个保守的LSPLSPHP基序，该基序是一个丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化位点。PCR结果显示HbSETF基因的DNA没有内含子。***发育树分析表明，HbSETF蛋白分别与HvERF5（基因库号ANA52685）、AtERF5（AT5G47230）、ZmERF5（基因库号PWZ220596.1）和OsERF5（基因库号XP015624058）高度相似。搜索SWISS-MODEL数据库的结果(https://swissmodel. expasy.org/）表明HbSETF蛋白的AP2结构域的3D结构具有一个长的C-末端α-螺旋（α），包裹在一个三条反平行β-折叠（β1-β3）中，这段序列可以识别目标DNA的核心顺式作用元件GCC-box。

亚细胞定位分析显示HbSETF定位于细胞核内。酵母单杂交分析和凝胶迁移实验表明，HbSETF可直接与HbCIPK2基因启动子（proCIPK2）结合。双荧光素酶实验证实HbSETF能够反式激活HbCIPK2基因启动子。实验表明，本发明的转录因子HbSETF可识别HbCIPK2基因启动子的GCC盒并与之相互作用，表明转录因子HbSETF可能参与对HbCIPK2基因的调节作用，对HbCIPK2基因启动子具有转录激活作用。

与HbCIPK2基因启动子特异性结合的转录因子HbSETF是胁迫响应的AP2/ERF类转录因子，HbSETF基因对盐、干旱和ABA非生物胁迫处理存在不同程度的应答响应，在野大麦应对不同的环境胁迫时发挥重要的调控作用。

本发明通过将来源于野大麦（Hordeum brevisubulatum）的HbSETF编码基因导入到受体植物野生型拟南芥（WT，Col）中，得到了转基因拟南芥植株，实验证明，与未转基因受体对照野生型拟南芥（WT，Col）相比，过表达HbSETF基因的拟南芥转基因株系（L6、L7、L13）在盐胁迫条件下比野生型拟南芥（WT，Col）具有更长的根和更大的叶，鲜重和根系生长速率显著高于显著高于WT，幼苗生长实验也表明，转HbSIF1基因株系幼苗在盐胁迫条件下表现出比野生型植株更好的生长状态，叶绿素含量显著高于野生型植株，表明转基因植物的耐盐性显著增强。

进一步地实验显示HbSETF基因异位表达（过表达）的转基因拟南芥增强了植物对盐胁迫的耐受性，通过分析转基因植物中下游基因的表达，发现HbSETF显著增强了胁迫响应基因的转录水平，如AtCIPK24、AtRD29B和AtP5CS等。表明HbSETF通过增强HbCIPK2基因的表达在植物耐盐性中发挥作用。

综上，本发明的HbSETF基因可用于植物的抗逆性育种。

附图说明

图1为以HbCIPK2基因启动子为诱饵的cDNA文库筛选。其中图1中a为HbCIPK2基因启动子（proHbCIPK2）结构示意图；图1中b为酵母单杂交筛选库；图1中c为HbSETF蛋白结构示意图；图1中d为HbSEFT基因与HbCIPK2基因启动子在酵母中一对一验证。

图2为转录因子HbSETF属于AP2/ERF家族的ERF亚族结构示意图。其中图2中a为HbSETF AP2结构域的三维结构图；图2中b为HbSETF进化树分析；图2中c为HbSETF与其他物种ERF亚族转录因子的氨基酸序列比对。

图3为转录因子HbSETF的表达模式，亚细胞和组织定位。其中图3中a为HbSETF基因在各种逆境胁迫条件下的表达模式；图3中b为HbSETF蛋白的亚细胞定位；图3中c-g为转proHbSETF::GUS拟南芥不同组织化学染色。

图4为转录因子HbSETF转录激活HbCIPK2基因启动子。其中图4中a为转录因子HbSETF与HbCIPK2基因启动子的GCC Box互作；图4中b和图4中c为EMSA实验分析转录因子HbSETF可结合HbCIPK2基因启动子的GCC Box；图4中d为LUC活体成像分析图；图4中e和图4中f为双荧光素酶实验结果图。

图5为野生型和HbSETF基因过表达拟南芥植株在正常和盐胁迫下的表型及生理生化分析。其中图5中A为野生型和HbSETF基因过表达拟南芥植株幼苗时期在盐胁迫下的表型；图5中B和图5中C为分别检测根长和鲜重；图5中D为野生型和HbSETF基因过表达拟南芥植株成苗时在盐胁迫下的表型；图5中E为叶绿素含量测定。图5中F为Na⁺含量的测定；图5中G为K⁺含量的测定。“**”表示与野生型相比p<0.01，“***”表示与野生型相比p<0.001。MS表示用不含NaCl的MS平板进行培养的处理，100 mM 表示用含100 mM NaCl的MS平板进行培养的处理，125 mM 表示用含125 mM NaCl的MS平板进行培养的处理，Control表示为用NaCl溶液进行灌根的处理，NaCl表示用300 mM NaCl溶液进行灌根的处理。

图6为在正常和盐胁迫下，野生型和HbSETF基因过表达拟南芥植株中胁迫响应基因的相对表达量。MS表示用不含NaCl的MS平板进行培养的处理，100 mM 表示用含100 mMNaCl的MS平板进行培养的处理。图6中A、B、C、D、E和F分别为在正常和盐胁迫下，野生型和HbSETF基因过表达拟南芥植株中胁迫响应基因ADH（AtADH）、CIPK24（AtCIPK24）、KIN2（AtKIN2）、COR47（AtCOR47）、RD29B（AtRD29B）和P5CS（AtP5CS）的相对表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例采用Excel统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Student t检验，P＜0.05（*）表示具有显著性差异，P＜0.01（**）表示具有极显著性差异，P＜0.001（***）表示具有极显著性差异。以下实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的野生型拟南芥（WT，Col）为哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)，Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC)。

实施例1、转录因子HbSETF的筛选和鉴定

1、野大麦材料的培养

以野大麦种子在25 ℃室温条件下水培 21 天左右的幼苗为实验材料。在野大麦培养过程中：光照时间为16 h/8 h，光照强度为 6000 lx，相对湿度为 60％。21天后经过350 mM⋅NaCl、350 mM 甘露醇（Mannitol）、10% PEG6000 和20 μM ABA 分别处理 0 h，0.5h，1 h，2 h，3 h，6 h 和12 h后，得到不同处理时间的野大麦幼苗，用蒸馏水冲洗干净，再用干净的滤纸将水分吸干，分别收取地上和地下组织，先经液氮速冻1 min后于-80 ℃保存。

2、利用酵母单杂交技术筛选与HbCIPK2启动子特异性结合的转录因子

2.1、构建酵母单杂交文库

将步骤1中盐处理后组织样品保存于液氮，采用Trizol Reagent (Invitrogen)试剂法提取野大麦总RNA，凝胶电泳分析证明RNA无降解且质量良好后，利用Takara反转录试剂盒将所述总RNA反转录为cDNA，用来构建野大麦cDNA文库。利用Clontech公司的SMART^TMcDNA 文库构建试剂盒构建cDNA文库，cDNA经Chroma SPIN-400纯化柱纯化后与载体进行连接，得到cDNA文库质粒。

2.2、构建诱饵载体及诱饵菌株

野大麦蛋白激酶编码基因HbCIPK2的启动子是胁迫诱导型启动子，本实验室已获得授权专利（一种植物诱导型启动子及其应用，专利号：201610009572.5、公开号：CN105505932B）。以HbCIPK2基因全长启动子（名称为proHbCIPK2，核苷酸序列为SEQ IDNo.4）为诱饵，利用酵母单杂交技术筛选上游转录因子。首先通过酶切连接方法，将proHbCIPK2（SEQ ID No.4）连接到诱饵载体pAbAi（购买自Clontech Catalog No.630491），得到重组载体proHbCIPK2-pAbAi（该质粒是将pAbAi质粒经KpnI和XhoI酶切后，连接HbCIPK2的启动子得到。）。使用BbsⅠ酶分别酶切重组载体proHbCIPK2-pAbAi和阳性对照质粒p53-AbAi（购买自Clontech Catalog No. 630491），将线性化的质粒转化到酵母菌株Y1HGold（购买自Clontech Catalog No. 630491），涂布于SD/-Ura 固体培养基上，28 ℃培养3 d 后选生长良好的单克隆，加入 Matchmaker Insert Check PCR Mix 1进行PCR 鉴定，证明线性化的重组载体proHbCIPK2-pAbAi已经整合到酵母Y1HGold基因组中，从而获得诱饵酵母。从SD/-Ura培养基上挑取生长良好的Y1HGold [proHbCIPK2-pAbAi]（转化了诱饵载体proHbCIPK2-pAbAi的重组菌）和Y1HGold[p53-AbAi]（转化了对照质粒p53-AbAi的重组菌）菌落，摇菌并稀释至OD600为0.002，分别在抗生素金担子素A（Aureobasidin A，缩写AbA）（购买自Clontech Catalog No. 630491）浓度为0、100、200、400 ng/ml的 SD/-Ura 培养基上各涂 100 ul，筛选合适的AbA抑制自激活浓度（200 ng/ml）用于后续酵母单杂交文库筛选。

2.3、酵母单杂交文库筛选

将酵母菌株Y1HGold[proHbCIPK2-pAbAi]做成感受态，利用PEG/LiAC的转化方法将步骤2.1制备的cDNA文库质粒转入诱饵酵母Y1HGold[proHbCIPK2-pAbAi]感受态细胞。在含200 ng/ml AbA的 SD/-Leu 培养基上初步筛选，加入Matchmaker Insert Check PCRMix 2 （购买自Clontech Catalog No. 630497）进行PCR 扩增，将条带在500 bp以上的产物送去测序，测序结果在NCBI上进行Blast比对分析，结果筛选到了与HbCIPK2启动子特异性结合的转录因子HbSETF。

转录因子HbSETF基因（HbSETF基因）的核苷酸序列为SEQ ID No.2，SEQ ID No.2的第101-1129位是编码序列（CDS），编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质HbSETF。

3、HbSETF亚细胞定位分析

根据HbSETF基因CDS序列设计不含终止子的引物，PCR扩增HbSETF基因后，将该基因***pCAMBIA1307载体（CAMBIA公司）中构建pCAMBIA1307-HbSETF-GFP质粒（亚细胞定位载体），以pCAMBIA1307-AtCBF1-RFP质粒（CAMBIA公司）作为对照。将pCAMBIA1307-HbSETF-GFP和pCAMBIA1307-AtCBF1-RFP通过根癌农杆菌转化法转化洋葱表皮细胞，28 ℃暗箱培养72 h。选取转化的洋葱表皮制作成装片，用DAPI进行染色，在Olympus荧光显微镜下观察该基因的表达部位，并拍照记录保存。

4、LUC活体成像和双荧光素酶瞬时分析

将HbCIPK2基因启动子（ATG上游1750 bp序列，命名为：proHbCIPK2，核苷酸序列为SEQ ID No.4）导入LUC基因表达载体（名称pCAMBIA1300，CAMBIA公司），得到重组载体pCAMBIA1300-proHbCIPK2-LUC。扩增HbSETF基因的编码区（SEQ ID No.2的第101-1129位）并将其***pCAMBIA1307载体，得到重组载体pCAMBIA1307-HbSETF。将pCAMBIA1300-proHbCIPK2-LUC和pCAMBIA1307-HbSETF转化农杆菌菌株GV3101，注射烟草叶片。在侵染后第三天，叶片背面均匀涂抹300 μl终浓度为1 mM D-荧光素（Promega），并在黑暗中放置2分钟。使用生物活体成像仪（Night SHADE LV 985，Berthold，GER）扫描并拍摄处理过的叶片，根据荧光强度比较启动子活性。

将HbCIPK2基因启动子（SEQ ID No.4）***到pGreenII 0800-LUC 载体（北京华越洋生物公司）的上游作为报告基因表达载体，将HbSETF基因的编码区（SEQ ID No.2的第101-1129位）重组到pGreenII 62-SK载体（北京华越洋生物公司）上作为效应基因表达载体。阴性对照为空载体pGreenII 62-SK（北京华越洋生物公司）。将以上载体转化农杆菌GV3101，转化效应基因和报告基因的农杆菌培养液的混合比例为8:1，分别注射烟草叶片左右两端对称位置，用记号笔标记注射后的菌液范围，三天后将注射位置剪下，用打样机打碎叶片，加入细胞裂解液，随后使用试剂盒测量荧光素酶的活性，根据LUC与RLU的比值分析启动子的活性。

5、结果与分析

5.1、通过酵母单杂交筛选并鉴定转录因子HbSETF

前期的实验表明，过表达HbCIPK2基因可以提高植物的耐盐性。而HbCIPK2基因的启动子是由各种胁迫诱导的。因此，进一步深入研究是什么基因在调控HbCIPK2基因的表达。利用PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析并预测HbCIPK2启动子的顺式作用元件。发现其具有转录因子结合元件，如MYB、W-Box和DRE（图1中a），推测HbCIPK2基因的表达可能受应激相关转录因子的调控。因此，需要鉴定能够直接调节HbCIPK2基因的转录因子。将HbCIPK2基因启动子（SEQ ID No.4，1750bp）作为诱饵，筛选经盐胁迫处理的植物cDNA文库（图1中b），筛选到转录因子HbSETF。将含有HbSETF基因的猎物质粒和含有HbCIPK2启动子的诱饵质粒共同转化酵母感受态细胞，转化酵母可在含有AbA的SD/-Leu-Ura培养基上生长（图1中d），HbSETF蛋白结构如图1中c所示。

5.2、HbSETF基因的序列分析

采用RT-PCR技术从野大麦cDNA中扩增到HbSETF基因的全长序列。HbSETF基因具有1029 bp的开放阅读框（ORF），编码342个氨基酸的蛋白质HbSETF，蛋白质HbSETF的分子量为36.5 kDa，等电点为4.7。HbSETF蛋白包含一个由61个氨基酸组成的单一AP2结构域（图2），其中含有保守的丙氨酸（A）和天冬氨酸（D），表明它是ERF家族的成员（图2）。AP2结构域包含保守的YRG和RAYD元件，它们可能分别在DNA结合和蛋白质相互作用中发挥关键作用（图2）。此外，HbSETF蛋白的C端区域含有一个保守的LSPLSPHP基序，该基序是一个丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化位点（图2中c）。PCR结果显示HbSETF基因的DNA没有内含子。***发育树分析表明，HbSETF蛋白分别与HvERF5（基因库号ANA52685）、AtERF5（AT5G47230）、ZmERF5（基因库号PWZ220596.1）和OsERF5（基因库号XP015624058）高度相似（图2中b）。搜索SWISS-MODEL数据库的结果 (https://swissmodel. expasy.org/）表明HbSETF蛋白的AP2结构域的3D结构具有一个长的C-末端α-螺旋（α），包裹在一个三条反平行β-折叠（β1-β3）中，这段序列可以识别目标DNA的核心顺式作用元件GCC-box（图2中a）。

5.3、鉴定HbSETF蛋白是胁迫响应的AP2/ERF类转录因子

为确定HbSETF基因参与不同的胁迫响应，分析HbSETF基因在盐（350 mM NaCl）、干旱（10% PEG 6000和350 mM mannitol）和ABA胁迫（20μM）下，茎和根中的表达情况。在350mM NaCl胁迫下，处理后0.5 h，根中HbSETF基因的表达量开始上调，然后在2～12 h显著积累，茎中的表达情况与之类似（图3中a）。为模拟干旱胁迫，用10% PEG 6000处理幼苗。根系中的HbSETF基因对PEG 6000反应轻微。茎中HbSETF基因在0.5 h开始上升，并在3-12 h持续高表达。对于甘露醇（Mannitol）处理，根和茎中的HbSETF基因在2 h时明显被诱导表达（图3中a）。20μm ABA处理后，根和茎中HbSETF的表达量在处理2 h时达到最大值，之后缓慢降低。综上所述，HbSETF基因对盐、干旱和ABA非生物胁迫处理存在不同程度的应答响应。由此推测，HbSETF基因在野大麦应对不同的环境胁迫时可能发挥重要的调控作用。

为分析HbSETF蛋白的亚细胞定位，将HbSETF基因全长cDNA序列融合到绿色荧光蛋白（GFP）的5'端，由此产生的由CaMV 35S启动子驱动的pro35S::HbSETF:GFP融合基因在洋葱细胞中瞬时表达。共聚焦成像显示HbSETF-GFP融合蛋白主要在细胞核表达，与RFP荧光（AtCBF1-RFP）和DAPI（对核进行染色）成像相同（图3中b）。

HbSETF基因编码区上游约2 kb的启动子（SEQ ID No.3）融合GUS报告基因（proHbSETF::GUS）转化野生型拟南芥，收获纯合的T2代种子。选择萌发8天后的转化植株进行GUS染色，结果显示，在茎尖分生组织，叶片的维管组织中检测到强烈GUS表达（图3中c），根的维管组织有弱的GUS活性（图3中e）。对花絮进行染色，GUS基因在柱头和花蒂表达，也在雌蕊的花粉管和雄蕊的花丝中表达（图3中d）。在MS培养基中，15天幼苗的叶片维管组织以及茎尖分生组织中的GUS活性较弱（图3中f）。但经100 mM NaCl处理，叶片的维管组织以及茎尖中观察到强烈的GUS活性（图3中g）。显然，proHbSETF::GUS转化植株的GUS活性在盐胁迫下诱导增强。总之，proHbSETF::GUS转化植株活性主要在茎尖分生组织和不同组织的维管束中表达。

5.4、转录因子HbSETF激活HbCIPK2基因启动子

通过酵母单杂交技术确认转录因子HbSETF与HbCIPK2基因启动子结合。通过分析HbCIPK2基因启动子序列，在ATG起始密码子上游1750 bp序列含有AP2/ERF转录因子可识别的两个GCC-box（proHbCIPK2 GCC-box-1，-2）；这些GCC-box（序列：AGCCGCC）分别位于ATG上游-230 bp和-1086 bp（图1中a）。将HbCIPK2基因启动子两个GCC-box分别构建于pLacZi载体上与转录因子HbSETF CDS序列构建的pB42AD载体一起转入酵母EGY48中。结果表明，转录因子HbSETF确实能够与HbCIPK2基因启动子GCC盒结合（图4中a）。进一步设计两对生物素标记DNA序列的探针，根据酵母单杂交分析的16 bp序列，每对探针针对一个GCC盒。EMSA实验表明，体外纯化蛋白His-HbSETF可直接结合两个proHbCIPK2 GCC盒（图4中b和图4中c）。因此，酵母单杂交和体外EMSA实验均表明转录因子HbSETF可识别HbCIPK2基因启动子的GCC盒并与之相互作用。上述结果表明转录因子HbSETF可能参与对HbCIPK2基因的调节作用。

进一步地，通过LUC活体成像分析，证明了在体内转录因子HbSETF对HbCIPK2基因的作用。将分别携带pcambia1300-proHbCIPK2-LUC和pcambia1300-35S-HbSETF农杆菌共同注射烟草叶片中，携带pcambia1300-proHbCIPK2-LUC和pcambia1300农杆菌也共同注射烟草叶片并作为负对照，结果观察到pcambia1300-proHbCIPK2-LUC和pcambia1300-HbSETF荧光强于负对照（图4中d），表明转录因子HbSETF能作用于HbCIPK2基因，并使LUC的表达量增强。

利用同源重组方法将HbCIPK2基因启动子融合LUC作为报告基因，将HbSETF基因融合62-SK作为效应基因（图4中e）。双荧光素酶实验结果如图4中f所示，与空载体相比，转录因子HbSETF显著提高了HbCIPK2基因启动子的转录活性，说明转录因子HbSETF对HbCIPK2基因启动子具有转录激活作用。

实施例2、HbSETF基因过表达拟南芥及其耐盐性功能验证

1、HbSETF基因过表达拟南芥植株的获得

1.1构建包含SEQ ID No.2的第101-1129位所示DNA分子的重组载体

构建HbSETF基因过表达载体pCAMBIA1300-HbSETF：将HbSETF基因的编码序列（SEQID NO.2的第101-1129位）构建到载体pCAMBIA1300（CAMBIA公司）上，得到过表达HbSETF基因的重组载体，命名为pCAMBIA1300-HbSETF。

重组载体pCAMBIA1300-HbSETF是将pCAMBIA1300载体的EcoRI和SalI识别位点间的片段（小片段）替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第101-1129位的DNA片段，保持pCAMBIA1300载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。

1.2将步骤1.1构建的重组载体转入拟南芥中

将上述步骤1.1构建好的质粒（重组载体pCAMBIA1300-HbSETF）转入根癌农杆菌GV3101中，28 ℃条件下培养72小时后挑取单克隆，通过菌落PCR筛选阳性克隆（含有编码序列为SEQ ID No.2的第101-1129位的HbSETF基因），命名为重组根癌农杆菌GV3101/pCAMBIA1300-HbSETF,将阳性克隆（GV3101/pCAMBIA1300-HbSETF）利用花粉管侵染法转染野生型拟南芥（WT，Col），通过Kan抗生素筛选生长的T0代转HbSETF基因拟南芥株系，经过移栽种植，收获纯合的T2代种子（T3代转HbSETF基因拟南芥株系）。筛选到能正常生长的稳定转化的纯合株系编号分别为L6、L7、L13，用于后续实验。

2、转HbSETF基因拟南芥植株的耐盐性功能验证

将T2代转HbSETF基因和野生型拟南芥种子点播在MS平板上，生长一周后，转到分别含100 mM和125 mM NaCl的MS平板上，7天后观察表型并测量根长和鲜重。将筛选生长一致4周大小的转基因和野生型拟南芥进行盐害处理，采用300 mM NaCl溶液进行灌根处理，共处理3次，之后正常浇水。观察表型和分析叶绿素含量。

3、转HbSETF基因拟南芥植株cDNA合成和实时荧光定量PCR分析

用TRIzol试剂（大连TaKaRa公司）提取转HbSETF基因拟南芥植株根或叶片的RNA。用紫外可见分光光度计（NanoDrop 2000c）检测RNA浓度和纯度。使用反转录试剂盒（南京诺唯赞生物技术有限公司）合成cDNA，-20 ℃保存。利用Premier 5.0 软件，根据目的基因CDS序列（SEQ ID No.2的第101-1129位）设计Q-PCR引物（引物序列如表1所示）。以拟南芥组成性表达基因actin为内参，将cDNA模板用不含DNA酶的水稀释5倍，使用SYBR Green PCRMaster Mix试剂盒（南京诺唯赞生物技术有限公司）进行实时荧光定量PCR。所有反应进行三次生物学重复，采用2^-△△CT算法进行表达分析。

表1 实时荧光定量PCR分析所用引物

引物名称	引物序列（5’-3’）	序列编号
			AtActin1-F	GGCGATGAAGCTCAATCCAAACG	SEQ ID No.5
AtActin1-R	GGTCACGACCAGCAAGATCAAGACG	SEQ ID No.6
			AtSOD-F	CGCATGATCCTTTGGCTTCG	SEQ ID No.7
AtSOD-R	TCCTGGTTGGCTGTGGTTTC	SEQ ID No.8
			AtPOD-F	CCAAACTCTTCGTGGACTATGC	SEQ ID No.9
AtPOD-R	AACTCTTGGTCGCTCTGGAT	SEQ ID No.10
			AtCAT1-F	TCCTGTTATCGTTCGTTTCTCA	SEQ ID No.11
AtCAT1-R	CAAAGTTCCCCTCTCTGGTGTA	SEQ ID No.12
			AtLEA-F	GATTGACCCGGCTGAGCTACGA	SEQ ID No.13
AtLEA-R	AGATGGGATTCACCACAAAAGA	SEQ ID No.14
			AtP5CS-F	GGGACAAGTTGTGGATGGAGAC	SEQ ID No.15
AtP5CS-R	TGGTACAAACCTCAAGGAACAC	SEQ ID No.16
			AtNHX1-F	AGCCTTCAGGGAACCACAAT	SEQ ID No.17
AtNHX1-R	CTCCAAAGACGGGTCGCATG	SEQ ID No.18
			AtACT2-F	TCGCTGACCGTATGAGCAAAG	SEQ ID No.19
AtACT2-R	TGTGAACGATTCCTGGACCTG	SEQ ID No.20
			AtRD29B-F	GTGAAGATGACTATCTCGGTGGTC	SEQ ID No.21
AtRD29B-R	TACCAAGAGACTCAGCAATCTCTG	SEQ ID No.22
			AtKIN2-F	GTCAGAGACCAACAAGAATGCC	SEQ ID No.23
AtKIN2-R	TGACTCGAATCGCTACTTGTTC	SEQ ID No.24
			AtCOR15a-F	ACTCAGTTCGTCGTCGTTTCTC	SEQ ID No.25
AtCOR15a-R	TCTCACCATCTGCTAATGCCTC	SEQ ID No.26
			AtADH-F	CTCTTGGTGCTGTTGGTTTAGG	SEQ ID No.27
AtADH-R	AATTGGCTTGTCATGGTCTTTC	SEQ ID No.28
			AtFRY1-F	CGCAGTAGCACTAGGATTG	SEQ ID No.29
AtFRY1-R	TTGACACCGAGTTTATTGG	SEQ ID No.30
			AtCIPK24-F	ATTGAGGCTGTAGCGAAC	SEQ ID No.31
AtCIPK24-R	GGTATTCCTTCTGTTGCC	SEQ ID No.32
			AtCBL4-F	GGAGGAATCTCTTCGCTG	SEQ ID No.33
AtCBL4-R	CACGAAAGCCTTATCCACC	SEQ ID No.34
			AtCIPK2-F	TAAGTGCGCTTGCTGATTGC	SEQ ID No.35
AtCIPK2-R	CCGCTTTCGTACCCTCGTAT	SEQ ID No.36
			Hb-qRT-ERF6-F	CGGAGAAGCCGACGACTT	SEQ ID No.37
Hb-qRT-ERF6-R	GAAGGTGGCATCACAGGG	SEQ ID No.38

4、转HbSETF基因拟南芥植株的离子含量检测

对过表达HbSETF基因的转基因拟南芥株系（L6、L7）和野生型拟南芥（WT）中的Na⁺、K⁺含量进行测定，方法如下：

在垂直MS平板上生长的10天龄幼苗转移到不含或含有100 mM NaCl的MS平板上，并垂直放置。生长10天后，收集、消化植物材料，并使用电感耦合等离子体原子发射光谱法（Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometer, ICP-AES）测定钾离子和钠离子含量。

5、结果与分析

5.1、过表达HbSETF基因增强拟南芥的耐盐性

为验证HbSETF基因在植物中的作用，将HbSETF基因过表达于拟南芥。比较HbSETF基因过表达系（L6、L7和L13）和野生型拟南芥（WT）在盐胁迫下的生长发育。相比MS培养基，转基因拟南芥植株在含有100 mM NaCl的培养基上显示出比WT更长的根和更大的叶。在125mM NaCl处理后，WT植株表现出比转基因株系更严重的萎蔫（图5中A）。HbSETF基因过表达系的鲜重和根系生长速率显著高于100 mM或125 mM NaCl处理的野生型拟南芥（图5中B、图5中C）。

为确定HbSETF基因在增强耐盐性方面的作用，分析了转基因和野生型植株在成苗时期的表型。将HbSETF基因过表达系和WT植株在温室中培养20天，然后用300 mM NaCl处理10天，之后恢复正常的浇水和培养条件。若干天后，转基因植株表现出比野生型植株更好的生长状态（图5中D）。HbSETF基因过表达系的叶绿素含量显著高于野生型植株。这些结果表明转基因植物的耐盐性显著增强（图5中E）。

5.2、HbSETF基因过表达对Na⁺和K⁺积累的影响

为研究HbSETF基因过表达对Na⁺和K⁺积累的影响，用电感耦合等离子体发射光谱仪ICP-AES检测了正常条件（0 mM NaCl）和盐胁迫（100 mM NaCl）下转基因幼苗和野生型植株的离子含量。在正常条件下，转基因植株（L6和L7）和野生型植株（WT）的Na⁺或K⁺含量没有显著差异。然而，盐处理后，转基因拟南芥中Na⁺含量增加显著低于野生型（图5中F）。在相同处理下，非转基因植物的K⁺含量减少显著高于转基因植株（图5中G），结果表明过表达HbSETF基因在盐胁迫条件下可以阻止转基因拟南芥中K⁺减少和Na⁺积累，促使植物在盐胁迫下实现K⁺/Na⁺平衡，表明HbSETF基因介导了盐胁迫下转基因植株中过量的Na⁺外排，从而提高转基因植株的耐盐性。

5.3、HbSETF基因激活胁迫响应基因的表达

如上所述，转录因子HbSETF可以提高植物的耐盐性。为了解拟南芥中哪些胁迫响应基因受HbSETF基因的影响，采用半定量RT-PCR检测了这些靶基因的表达。分析了在HbSETF基因过度表达植株和野生型植物中14个与胁迫相关的基因的表达。根据RT-PCR结果，可以看到在MS培养基上生长的HbSETF基因过表达植株和WT植株之间，AtADH、AtCIPK24、AtKIN2、AtCOR47、AtRD29B和AtP5CS表达水平没有显著差异。在100 mM NaCl处理后，无论在转基因和野生型植株中，这些基因的表达均被上调；但在过表达系中的mRNA丰度增加明显高于野生型植株（图6中A-F）。而在盐胁迫下，过表达植株与野生型相比，其他6个胁迫响应基因的表达水平差异不大。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 调控植物耐盐性的蛋白质及其编码基因与应用

<160> 38

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 342

<212> PRT

<213> 野大麦(Hordeum brevisubulatum)

<400> 1

Met Glu Phe Ala Gly Glu Ala Asp Asp Phe Ala Leu Asp Leu Ile Arg

1 5 10 15

Glu His Leu Leu Gly Gly Asp Gly Gly Val Leu Ala Thr Ala Asn Asp

20 25 30

Asp Gln Gly Pro Phe Cys Asp Asp Val Thr Phe Pro Val Met Pro Pro

35 40 45

Ser Ala Ala Glu Pro Ala Ala Tyr Gln Gln Gln Pro Met Phe Phe Pro

50 55 60

Gln Gln Gln Gln Asp Glu Gln Met Gln Gly Tyr Met Asp Leu Thr His

65 70 75 80

Gln Tyr Leu Asn Ser Cys Pro Ser Thr Asp Val Pro Glu Ala Val Phe

85 90 95

Arg Ala Pro Glu Ala Val Met Ile Gln Phe Gly Gly Glu Pro Ser Pro

100 105 110

Val Thr Ala Pro Ser Ser Thr Leu Thr Ile Ser Val Pro Ala Lys Gly

115 120 125

Ser Phe Gly Trp Ala Gly Thr Ala Ala Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro

130 135 140

Ala Pro Val Glu Asp Phe Arg Lys Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg Pro

145 150 155 160

Trp Gly Lys Tyr Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Lys Arg Arg Gly Ser

165 170 175

Arg Val Trp Leu Gly Thr Tyr Asp Thr Ser Val Glu Ala Ala Arg Ala

180 185 190

Tyr Asp Arg Ala Ala Phe Arg Met Arg Gly Ala Lys Ala Ile Leu Asn

195 200 205

Phe Pro Asn Glu Val Gly Thr Arg Gly Ala Glu Leu Trp Ala Leu Pro

210 215 220

Pro Pro Val Pro Ala Ser Gln Ala Ala Gly Ala Thr Asn Lys Arg Lys

225 230 235 240

Arg Ser His Glu Glu Asp Ser Asp Val Glu Val Thr Gly Val Val Ile

245 250 255

Ser Lys Ala Pro Lys Thr Glu Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala Gln Val

260 265 270

Ser Trp Asp Thr Pro Ser Ser Val Ser Arg Glu Thr Ala Ser Ser Thr

275 280 285

Leu Thr Ser Ala Ala Thr Thr Pro Glu Gly Gly Phe Pro Pro Thr Pro

290 295 300

Ser Ser Ser Gly Trp Glu Gln Tyr Trp Glu Ala Leu Leu Gly Gly Met

305 310 315 320

Pro Leu Leu Ser Pro Leu Ser Pro His Pro Ala Leu Gly Phe Pro Gln

325 330 335

Leu Thr Val Ser Asp Gln

340

<210> 2

<211> 1329

<212> DNA

<213> 野大麦(Hordeum brevisubulatum)

<400> 2

ctcaggaaaa tcgaacagca gaactcacaa acaaacttgc aaacctctgc cactggcatc 60

gagtagttct ctaccgtgcc atcgatccct cttaggcggc atggagttcg ccggagaagc 120

cgacgacttt gctctcgacc tcatccgcga gcacctcctc ggcggcgacg gcggtgtcct 180

ggcgacggcc aacgatgatc agggcccttt ttgcgacgac gtcaccttcc ctgtgatgcc 240

accttccgcg gccgaaccag ccgcgtacca gcagcagccc atgttcttcc cgcagcagca 300

gcaggacgag cagatgcaag gttatatgga cctgacgcac cagtacctga actcctgccc 360

gtccaccgac gtccctgagg cggtgttccg ggcgccggag gcggtgatga tacagttcgg 420

cggcgagccg tctcctgtga ctgcgccgtc gtccacgctg accatctctg tgccggccaa 480

gggctcgttc gggtgggcgg ggactgctgc cgccgcggca ccgccagcgc cagcaccggt 540

ggaggacttc cgcaagtacc gcggcgtgcg gcagcggccg tggggcaagt atgcggcgga 600

gatccgcgac cccaagcgcc ggggctcccg cgtgtggctc ggcacctacg acacctccgt 660

ggaggccgcg cgtgcctacg accgcgctgc cttccggatg cgcggcgcca aggccattct 720

taacttccca aacgaggtcg gcacccgcgg cgccgagctg tgggcgcttc cgcctcctgt 780

acccgcgtcc caggccgccg gcgcgacgaa caaacgtaag agatcacatg aggaggactc 840

cgacgtcgag gtgaccggag tggtcataag caaggccccc aagaccgagg cgccgtcgcc 900

gtcgtccgcc caggtgtcgt gggacacgcc ctcgtccgtg tcgcgggaga cagcctcctc 960

gacgttgacg tcggcggcca cgacgccgga gggaggattt cctccgacgc cgtcgagctc 1020

gggctgggag cagtactggg aggcgctgct gggcggcatg ccgctgctct cgccgctgtc 1080

gccgcacccg gctctggggt tcccgcagct caccgtgagt gatcaataat taagaggcgg 1140

ttaattactg tgattgagct ggggttaacc aataagcagt ctttcgttgt ttagttggca 1200

gcggcatgca tgtctctgca tgctgggacg cgtacacttc tttgggacta atgataggtg 1260

taatgtgcgc gtttgctaag agacatgaag atcggatcga ccgatgcatg cttgtaaaga 1320

ataaacaac 1329

<210> 3

<211> 2149

<212> DNA

<213> 野大麦(Hordeum brevisubulatum)

<400> 3

cccaaattgt cgtgaaacca aggttcacaa accaccggtt ctgcacgtat atgtctgttt 60

ttgtgcaacc gcgtcggtcc tttcatcaaa ctgtgaaacg gcgttatatc atgtagaacg 120

agtccatgta tatcctctaa cagtttagcc acttgtaagt cgcctgaaat tagttttagg 180

tcagataatt ttggaagtaa gctgccgtag ggaaggaaga agcagccgcc ggcttgccag 240

agaagccctc tgggttcgcc tggaaagaaa tgttcatggt tggggttaga gggatggccg 300

gtggcagcac gacggtggac ggcgcttgtg gggagggcat ggccgcgaga ctggcgccgc 360

gggcagcggc atcagtcggt taagccggtg gtagatcggc ggttcgaggt atgaacagtg 420

aaccttttcg gaggttgaag aaggcgatct ggccatccat cttgcatccg atggctcata 480

tggaatcctc gtgtggtctc tcctcttcgt agtctcgtca tgatgcatgc cactcagtgg 540

cttttttttt ctatttcgtt gatgctttct ttgggcatga ttgtattgtt ggcacatccg 600

tcttagttgc tttgccactt tggttatgtt atatgaatgt ttgctttatt tataaagcga 660

gataaaaacc tatttcgagg aagacatcta gccagtcgag taatgctaca cataaaaaaa 720

gctacatgca gttttacgta attagccacc tggcaatctg tgattgtaag tagggggaag 780

gaggggccca ttccactgaa attcagcggg ggagagaatg gttgaaggaa agttatgcac 840

gtaattgttc gtaggtgtag gattattgct agccagtccc atcctctaat ggcatggagg 900

actaccgttc atttaacgcc atatacgagc cggtagtagt gctgtacctg gtgcggttta 960

tatgcatggc aacgagctat tttttttttc aagaacatgc aggagcatta catgtctttt 1020

ctattaagga gaagagaaat atcccaatac aaagatgatt atagggtcat atccgccctc 1080

gagggccatt gcccagggcg cgctctagtg gatctgaaag gggtgacgag ctaatttgga 1140

ttgcaacctt gttctgtgag cctgtttttt tttttttttt ttttggaaaa ggaggaagac 1200

cccggcctct gcatctgggc gatgcatgca gccactttat taattattct caaaagacct 1260

tacaaggaca tacaacagta tgtctgaagc caccgtctag gcaacatctg tcgctactcc 1320

tatccaattg atgtagggat gctgatgtgc cctccaccga cgcacgggta cgtttcgcca 1380

gcatgggatc ggacgtggca attaactcgt aacctagtac atcatctgca tgtgcacctg 1440

tcttcccatc ccatcgtttc gatcgctaat tgtgaacaat ttccttgcaa tctctgagta 1500

gtgagtacgc ggggaaagct ggccagccga tactaggact gcgcaatata agaatgacac 1560

tattgtatat attccttttc tgtgaataaa aattaagaga gagatacacg cgtcgcttca 1620

ttgcgaggtc tgggtatggg cagcagctaa tggctctcca gcgcgcgtct cattaaattc 1680

cttgtaaagt gtgagcggaa tggtcgaagc tcctgtcaat ggacgtacgt atgctatgcg 1740

cgcccctgtt cttctttctt gaaatgaaat gtgttcttca ttgacacgaa acccgaaaaa 1800

tctcggcgca gcaaatttga acaggatcga gtagtactac tgtgcttgac agtacagcgg 1860

cgccacatga aatgaaagca ttccacggaa agtgacgaga tcgagtagga ccccgaagcc 1920

ccaaaagcgg gccccggccg cgtgcaatcg tgttggtcaa atcgaatcaa atgcccgaga 1980

acataggcct tcccgtctcc ttcctgcagc tgtcctataa gtacgcacac caccaccgct 2040

agttttgtcc tcaggaaaat cgaacagcag aactcacaaa caaacttgca aacctctgcc 2100

actggcaccg agtagttctc taccgtgcca tcgatccctc ttaggcggc 2149

<210> 4

<211> 1750

<212> DNA

<213> 野大麦(Hordeum brevisubulatum)

<400> 4

gccagtgcta ctactactgc ttcccgttgt ttcaaagctg gcagatcgcc atctactacg 60

atctgcgcca ttgatgctcc atatataatt tacagccgca ggtcaaaaag atcttcctcc 120

gtgacccgac aattatggag caccatcatg cacgtaaaac aaaggccgag cgccgcccgc 180

ccacgctcca gctagagctc tacaaagtct accaccgata ttttcgcacc gaaaacaatc 240

caccgaagtt cacagccgcg agtcaaaagt ttccttcgtg gcgaccctac aattatggag 300

tgccatttct caataaataa aaaataaaat tacggagtgc catcatgcac gcaggtaaaa 360

caagggctgg gcacgggaac catgcatgcc tatgaaacaa gggctggtcc gatggccggc 420

cgattcagaa cggacggcgg aggacggcca acgggccgat ccaatttcgt ccgtccgtcg 480

cagcggacag gccagcgcat tattggtggg ccccgccgcg gcgtaatttt accggcccac 540

agcggcgggc ggtgggtggg tgtggtttgg tctgcggcga gggagaggag gaatatctct 600

ctgcgggaat ggatccatcc ctagcgggcg gggggttgtg ccgcccccgc ggcgtataaa 660

acggagccgc ctctcaagct taacctctcg ctgcacaaag ctctctctca caccagcctc 720

tagaaaaaga aatctaccac cactctgccg tcgtctccca gccccgccgc ccacgcatca 780

gcctcctcac tccctcccct agcccgccgt cctcctcgcg actactcatc tcttcgcgga 840

ggaagggatc tgatctaccg ccggggttgc cgcgggttcc gttcgcgtcg ccggccgccg 900

ggatctggta cacggcctca ctcgcttctc cctggttctg cctctggttc cggttgcggt 960

tcgtagttat tgattcatgt gtatgtgcgc gaaatattga tgccatctag agaggtctcg 1020

gcgatttagg agcttccgtt gaatgatacg gaatataaga tgctagtttt ttagttcttc 1080

aaccaaaaaa aatggtagtt ttcctttttc agttcgtgtc gatgcgcgtt tacgggggct 1140

gccgcttcat ttttggcagc ggtagcttta ggcttggcgg tagtgcgtcc ccgcagagag 1200

agatcgatcg accaaccacg gccaggtgcc acgggaagtt agatttcgtt cgtttctgac 1260

tctctgccgt aagaggaacg cacgcatatg ctcttgtccg tgtacgcgga aaagatctac 1320

ttttcctctt ctgcgtagac agatgccttt taacctccaa cttggatttg ccttcagtac 1380

atatagccgt gtgtctaacg ttgtgctttg ttttgtgatt cgcagcatct tgatttccac 1440

aaggaggaac catcttaggg aatgcagaga gatgtgtttg catgctagag agctaccttg 1500

cgagggaatc ggcagggtag ccgccccagt ttctgctttg attgaccttg atgacaccgg 1560

cgcacagcag caccacacaa cgcacctctt cttccatgtg cttctgcaca atggggttcg 1620

acgtggcatc tcaaccatca tcttagatta ccacctcgga ggggacggtt gaggccatct 1680

agcgcccgca ggctcccttg caaggtccgg gatcgctgct gattttgtct gtgtacatct 1740

gcctgccacc 1750

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ggcgatgaag ctcaatccaa acg 23

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

ggtcacgacc agcaagatca agacg 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

cgcatgatcc tttggcttcg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

tcctggttgg ctgtggtttc 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

ccaaactctt cgtggactat gc 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

aactcttggt cgctctggat 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

tcctgttatc gttcgtttct ca 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

caaagttccc ctctctggtg ta 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

gattgacccg gctgagctac ga 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

agatgggatt caccacaaaa ga 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

gggacaagtt gtggatggag ac 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

tggtacaaac ctcaaggaac ac 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

agccttcagg gaaccacaat 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

ctccaaagac gggtcgcatg 20

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

tcgctgaccg tatgagcaaa g 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

tgtgaacgat tcctggacct g 21

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

gtgaagatga ctatctcggt ggtc 24

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

taccaagaga ctcagcaatc tctg 24

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

gtcagagacc aacaagaatg cc 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

tgactcgaat cgctacttgt tc 22

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

actcagttcg tcgtcgtttc tc 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

tctcaccatc tgctaatgcc tc 22

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

ctcttggtgc tgttggttta gg 22

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

aattggcttg tcatggtctt tc 22

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

cgcagtagca ctaggattg 19

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 30

ttgacaccga gtttattgg 19

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 31

attgaggctg tagcgaac 18

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 32

ggtattcctt ctgttgcc 18

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 33

ggaggaatct cttcgctg 18

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 34

cacgaaagcc ttatccacc 19

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 35

taagtgcgct tgctgattgc 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 36

ccgctttcgt accctcgtat 20

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 37

cggagaagcc gacgactt 18

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 38

gaaggtggca tcacaggg 18

Claims

1.蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为下述任一种：

A1）氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质来源于野大麦。

3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述B1）至B7）中的任一种：

B1）编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，B1）所述核酸分子为下述任一种：

C1）编码序列是SEQ ID No.2的第101-1129位的cDNA分子；

C2）核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

5.一种培育抗逆植物的方法，其特征在于，所述方法包括提高目的植物中权利要求1或2所述蛋白质的含量和/或活性，得到抗逆性高于所述目的植物的抗逆植物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中权利要求1或2所述蛋白质的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量实现。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量通过将权利要求1或2所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现。

8.权利要求1或2所述蛋白质，和/或，权利要求3或4所述生物材料的下述任一种应用：

D1）权利要求1或2所述蛋白质，和/或，权利要求3或4所述生物材料在调控植物抗逆性中的应用；

D2）权利要求1或2所述蛋白质，和/或，权利要求3或4所述生物材料在制备调控植物抗逆性的产品中的应用；

D3）权利要求1或2所述蛋白质，和/或，权利要求3或4所述生物材料在培育抗逆植物中的应用；

D4）权利要求1或2所述蛋白质，和/或，权利要求3或4所述生物材料在制备培育抗逆植物的产品中的应用；

D5）权利要求1或2所述蛋白质，和/或，权利要求3或4所述生物材料在植物育种中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗逆性包括耐盐性、耐旱性、耐热性、耐寒性和/或耐强光性。

10.权利要求5-7中任一所述的方法，和/或，权利要求1或2所述蛋白质的结构域在创制抗逆植物和/或植物育种中的应用，所述结构域是氨基酸序列为SEQ ID No.1的第154-214位的多肽。