CN108997487B

CN108997487B - 抗逆相关蛋白z76在调控植物抗逆性中的应用

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Publication number: CN108997487B
Application number: CN201811024442.4A
Authority: CN
Inventors: 贺琳; 袁红梅; 徐晶宇; 杨克军; 程殿君
Original assignee: Institute Of Industrial Crops Of Heilongjiang Academy Of Agricultural Sciences; Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Institute Of Industrial Crops Of Heilongjiang Academy Of Agricultural Sciences; Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2018-09-04
Filing date: 2018-09-04
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2038-09-04
Also published as: CN108997487A

Abstract

本发明公开了抗逆相关蛋白Z76在调控植物抗逆性中的应用。本发明所提供的抗逆相关蛋白Z76为a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆相关的蛋白质。实验证明，在野生型拟南芥中过表达Z76基因，得到转Z76基因拟南芥；与野生型拟南芥相比，转Z76基因拟南芥的抗逆性增强。因此，蛋白质Z76在培育抗逆性增强的植物中具有重要的理论意义和实用价值。

Description

抗逆相关蛋白Z76在调控植物抗逆性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗逆相关蛋白Z76在调控植物抗逆性中的应用。

背景技术

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，可以利用生物技术改进植物生长特性，进而提高植物对逆境的适应能力。

在干旱和高盐等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害,增强对胁迫环境的抗性。

发明内容

本发明的目的是提高植物的抗逆性。

本发明首先保护蛋白质Z76在调控植物抗逆性中的应用；所述蛋白质Z76可为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆相关的蛋白质。

其中，序列表中序列2由267个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质Z76的核酸分子在调控植物抗逆性中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，编码所述蛋白质Z76的核酸分子可为b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b3)与b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质Z76的DNA分子；

b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质Z76的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由804个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

上述应用中，所述调控植物抗逆性可为增加植物抗逆性。

上述应用中，所述抗逆性可为抗盐性和/或抗旱性。

上述应用中，所述植物可为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)十字花科植物；c5)玉米；c6)玉米合344自交系；c7)拟南芥；c8)野生型拟南芥Columbia-0亚型。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：提高出发植物中所述蛋白质Z76表达量和/或活性，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的抗逆性增强。

上述方法中，所述“提高出发植物中所述蛋白质Z76表达量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到增加植物中所述蛋白质Z76表达量和/或活性的效果。

上述方法中，所述“提高出发植物中所述蛋白质Z76表达量和/或活性”可通过向出发植物中导入提高所述蛋白质Z76表达量和/或活性的物质实现。

所述“向出发植物中导入提高所述蛋白质Z76表达量和/或活性的物质”具体可通过向出发植物中导入编码所述蛋白质Z76的核酸分子实现。

上述方法中，所述编码蛋白质Z76的核酸分子可为b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

上述方法中，所述“向出发植物中导入编码所述蛋白质Z76的核酸分子”可通过向出发植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体***编码所述蛋白质Z76的核酸分子，得到的重组质粒。所述重组载体具体可为实施例提及的重组质粒pROKⅡ-Z76。所述重组质粒pROKⅡ-Z76具体是将序列表中序列1所示的DNA分子***pROKⅡ载体的限制性内切酶KpnI和SacI的酶切识别位点之间得到的。

本发明还保护一种植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质Z76的含量和/或活性，从而增加抗逆性。

上述任一所述方法中，所述抗逆性可为抗盐性和/或抗旱性。

上述任一所述方法中，所述植物可为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)十字花科植物；c5)玉米；c6)玉米合344自交系；c7)拟南芥；c8)野生型拟南芥Columbia-0亚型。

上述任一所述干旱可通过加入甘露醇模拟(在实验室条件下)。加入的甘露醇浓度越高，则环境的干旱程度越大。

实验证明，在野生型拟南芥中过表达Z76基因，得到转Z76基因拟南芥；与野生型拟南芥相比，转Z76基因拟南芥的抗逆性增强。因此，蛋白质Z76在培育抗逆性增强的植物中具有重要的理论意义和实用价值。

附图说明

图1为干旱胁迫和盐胁迫下，Z76基因的表达模式分析。

图2为盐胁迫处理条件下，拟南芥的生长状态和萌发率统计结果。

图3为盐胁迫处理条件下，拟南芥的根长统计结果。

图4为盐胁迫处理条件下，拟南芥的根部生长状态。

图5为干旱胁迫处理条件下，拟南芥的生长状态和萌发率统计结果。

图6为干旱胁迫处理条件下，拟南芥的根长统计结果。

图7为干旱胁迫处理条件下，拟南芥的根部生长状态。

图8为生理指标测定结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)记载与如下文献中：Kim H，Hyun Y，Park J，Park M，Kim M，Kim H，Lee M，Moon J，Lee I，Kim J.A geneticlink between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsisthaliana.Nature Genetics.2004，36:167-171)。拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)在下文中简称野生型拟南芥。

pROKⅡ载体记载与如下文献中：Huiyan Guo，Yucheng Wang，Liuqiang Wang，PingHu，Yanmin Wang，Yuanyuan Jia，Chunrui Zhang，Yu Zhang，Yiming Zhang，Chao Wang andChuanping Yang.Expression of the MYB transcription factor geneBplMYB46affects abiotic stress tolerance and secondary cell wall depositionin Betula platyphylla.Plant Biotechnology Journal(2017)15：107–121.

TRIzol试剂为Invitrogen公司的产品。ReverTra Ace qPCR RT Master Mix withgDNA Remover为TOYOBO公司的产品。

下述实施例中，玉米合344自交系简称玉米。

下述实施例中，利用SPSS 16.0(SPSS Inc,Chicago，IL，USA)软件进行统计分析。单因素方差分析比较不同株系(WT、OE-3和OE-16)在同一处理条件下差异是否具有显著性(星号代表P<0.05,双星号代表P<0.01)。

下述实施例中，加入不同浓度的甘露醇用于模拟干旱环境。甘露醇浓度越高，则环境的干旱程度越大。

实施例1、抗逆相关蛋白Z76编码基因的克隆

1、提取玉米根系的总RNA，然后反转录，得到玉米根系的cDNA。

2、以玉米根系的cDNA为模板，采用引物Z76-KpnI-F：5’-CGGGGTACCATGGACGACGGGGACCTGGAT-3’和引物Z76-SacI-R：5’-CCGAGCTCTCACTTCTTTTCAACATTTGG-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到约819bp的PCR扩增产物。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，然后回收约819bp的片段。

4、采用pGM-T试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司的产品)将步骤3回收的片段和pGM-T(pGM-T试剂盒中的组件)进行连接，得到重组T载体。具体步骤如下：

(1)平末端目的片段加A

制备反应体系1。反应体系1为20μL，由15μL步骤3回收的片段、4μL Tailing-AReaction Buffer(pGM-T试剂盒中的组件)和1μL Taq DNA Polymerase(pGM-T试剂盒中的组件)组成。

取反应体系1，72℃处理30min，得到目的片段。

(2)目的片段连入T载体

制备反应体系2。反应体系2为10μL，由1μL 10×T4DNA Ligation Buffer(pGM-T试剂盒中的组件)、1μL T4DNA Ligase(浓度为3U/μL)、1μL pGM-T(浓度为50ng/μL)、4μL目的片段和3μL ddH₂O组成。

取反应体系2，22℃处理1h，得到连接产物。

(3)转化

(3-1)将16μL IPTG溶液(浓度为50mg/mL)和40μL X-Gal溶液(浓度为20mg/mL)均匀涂布在含有Amp的LB固体平板上，37℃避光1h；

(3-2)取装有100μL大肠杆菌DH5ɑ感受态的离心管，加入10μL连接产物，轻弹混匀，冰浴30min；

(3-3)完成步骤(3-2)后，42℃热激90s，将所述离心管立即冰浴3min，期间不要摇动离心管；

(3-4)完成步骤(3-3)后，向所述离心管中加入800μL 37℃预热的LB液体培养基，37℃、130rpm振荡培养1h；

(3-5)完成步骤(3-4)后，取所述离心管，离心，弃上清，将菌液混匀，吸取100μL均匀涂在步骤(3-1)制作的LB固体平板上，倒置LB固体平板，37℃过夜培养。

(4)酶切和测序

(4-1)挑取LB固体平板上的白色单菌落，采用引物Z76-KpnI-F和引物Z76-SacI-R进行菌落PCR。如果某单菌落的PCR扩增产物中含有约819bp的片段，则该单菌落为阳性单菌落。

(4-2)用牙签挑取阳性单菌落，接种于含有Amp的LB液体培养基，37℃过夜培养，得到培养菌液。

(4-3)取所述培养菌液，提取质粒。

(4-4)取步骤(4-3)提取的质粒，用限制性内切酶KpnI和SacI进行酶切。

结果表明，酶切产物中含有约819bp的片段。

(4-5)将步骤(4-3)提取的质粒送至华大基因进行测序。测序引物为T7F和M13R。

测序结果表明，质粒(即重组T载体)中含有序列表中序列1所示的DNA分子(即Z76基因)，编码序列表中序列2所示的Z76蛋白或蛋白质Z76。

实施例2、表达模式分析

一、干旱胁迫下Z76基因的表达模式

1、cDNA的获得

(1)选取籽粒饱满、大小一致的玉米种子，先用自来水冲洗干净，再加入10％(v/v)次氯酸钠溶液消毒30min，蒸馏水洗净，浸种12h后催芽，将玉米种子置于培养箱中27℃暗培养24h，待长出约1.5cm的根，将玉米种子种在打好孔的泡沫板上，1/2Hoagland培养液培养。待玉米生长至三叶一心，选取生长一致的玉米幼苗，用含10％(w/v)PEG的1/2Hoagland营养液处理12h。取实验材料(根系或叶片)，用锡箔纸包裹，液氮处理30s以上，-80℃保存。

(2)完成步骤(1)后，采用TRIzol试剂提取实验材料的总RNA，得到PEG处理12h的RNA。

(3)完成步骤(2)后，取PEG处理12h的RNA，采用ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA Remover反转录出第一链cDNA，得到PEG处理12h的cDNA。

按照上述方法，将步骤(1)中的12h分别替换为24h和72h，其它步骤均不变，依次得到PEG处理24h的cDNA和PEG处理72h的cDNA。

按照上述方法，将步骤(1)中的12h替换为0h，其它步骤均不变，得到对照cDNA。

2、以步骤1得到的各个cDNA为模板，使用Bio-Rad Chromo4real-time PCR***实时定量PCR检测玉米根中Z76基因的相对表达量(以玉米Actin1(GRMZM2G126010_T01)为内参)。

反应体系为25μL，由12.5μL 2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo公司的产品)、上游引物、下游引物、2μL cDNA模板(约100ng)和RNase free ddH₂O组成。上游引物和下游引物在该反应体系中浓度均为0.5μM。

反应程序：94℃30s；94℃12s，58℃30s，72℃30s，45个循环；80℃1s。

检测Z76基因的引物为5’-CGTCCGAGAACAACAGCAA-3’和5’-ATACGGGAACGCACCAATC-3’。

检测玉米Actin1的引物为：5’-GATGATGCGCCAAGAGCTG-3’和5’-GCCTCATCACCTACGTAGGCAT-3’。

将对照cDNA中Z76基因的相对表达量作为1，其它cDNA(PEG处理12h的cDNA、PEG处理24h的cDNA或PEG处理72h的cDNA)中Z76基因的相对表达量见图1(左图为叶片，右图为根系)。结果表明，在干旱胁迫下，随着处理时间的延长，叶片中Z76基因的相对表达量逐渐增加，根系中Z76基因的相对表达量先缓慢上升后下降。

二、高盐胁迫下Z76基因的表达模式

1、cDNA的获得

(1)选取籽粒饱满、大小一致的玉米种子，先用自来水冲洗干净，再加入10％(v/v)氯酸钠溶液消毒30min，蒸馏水洗净，浸种12h后催芽，将玉米种子置于培养箱中27℃暗培养24h，待长出约1.5cm的根，将玉米种子种在打好孔的泡沫板上，1/2Hoagland培养液培养。待玉米生长至三叶一心，选取生长一致的玉米幼苗，用含200mM NaCl的1/2Hoagland营养液处理12h。取实验材料(根系或叶片)，用锡箔纸包裹，液氮处理30s以上，-80℃保存。

(2)完成步骤(1)后，采用TRIzol试剂提取实验材料的总RNA，得到盐处理12h的RNA。

(3)完成步骤(2)后，取盐处理12h的RNA，采用ReverTra Ace qPCR RT Master Mixwith gDNA Remover反转录出第一链cDNA，得到盐处理12h的cDNA。

按照上述方法，将步骤(1)中的12h分别替换为24h和72h，其它步骤均不变，依次得到盐处理24h的cDNA和盐处理72h的cDNA。

2、以步骤1得到的各个cDNA为模板，使用Bio-Rad Chromo4 real-time PCR***实时定量PCR检测玉米根中Z76基因的相对表达量(以玉米Actin1(GRMZM2G126010_T01)为内参)。

反应体系、反应程序、检测Z76基因的引物和检测玉米Actin1的引物均同步骤一中2。

将对照cDNA中Z76基因的相对表达量作为1，其它cDNA(盐处理12h的cDNA、盐处理24h的cDNA或盐处理72h的cDNA)中Z76基因的相对表达量见图1(左图为叶片，右图为根系)。结果表明，在盐胁迫下，随着处理时间的延长，叶片和根系中Z76基因的相对表达量先上升后下降。

上述结果表明，在玉米根中Z76基因能够被盐和干旱诱导表达。Z76基因是玉米根部适应非生物逆境过程中一个重要的调节因子。

实施例3、转Z76基因拟南芥的获得及其抗逆性鉴定

一、重组质粒的构建

1、取实施例1构建的重组T载体，用限制性内切酶KpnI和SacI进行酶切，回收约819bp的酶切片段。

2、取pROKⅡ载体，用限制性内切酶KpnI和SacI进行酶切，回收约11kb的载体骨架。

3、将酶切片段和载体骨架进行连接，得到重组质粒pROKⅡ-Z76。

二、重组农杆菌的获得

1、将步骤一制备的重组质粒pROKⅡ-Z76导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pROKⅡ-Z76。

2、将pROKⅡ导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pROKⅡ。

三、转Z76基因拟南芥的获得

1、采用拟南芥花序浸花转化法(Clough SJ,Bent AF(1998)Floral dip:asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J 16:735–743.)，将步骤二中1制备的EHA105/pROKⅡ-Z76转至野生型拟南芥中，获得T₁代拟转Z76基因拟南芥的种子。

2、将T₁代拟转Z76基因拟南芥的种子种植于含50mg/L卡那霉素的MS固体培养基，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T₁代转Z76基因阳性苗。T₁代转Z76基因阳性苗收到的种子即为T₂代转Z76基因拟南芥的种子。

3、将步骤2筛选出的不同株系的T₂代转Z76基因拟南芥的种子播种于含50mg/L卡那霉素的MS固体培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为Z76基因***一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T₃代转Z76基因拟南芥的种子。

4、将步骤3筛选出的T₃代转Z76基因拟南芥的种子再次播种于含50mg/L卡那霉素的MS固体培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T₃代纯合转Z76基因拟南芥。

随机选择两个T₃代纯合转Z76基因拟南芥的株系(分别命名为OE-3和OE-16)，并进行后续实验。

按照上述方法，将EHA105/pROKⅡ-Z76替换为EHA105/pROKⅡ，其它步骤均相同，得到T3代纯合转空载体拟南芥的植株，简称转空载体拟南芥。

四、耐盐性鉴定

正常培养的条件为：22±2℃。光暗交替培养的周期具体为：16h光照培养/8h黑暗培养。光照培养时的光照强度为80-100μmol·m^-2·s^-1。

待测拟南芥种子为野生型拟南芥种子、转空载体拟南芥种子、OE-3的T3代种子或OE-16的T3代种子。

1、萌发率实验

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

(1)向EP管中加入待测拟南芥种子，先用75％(v/v)乙醇水溶液浸泡1min、超纯水清洗3-5次，再用10％(v/v)NaClO消毒10min、超纯水清洗8-10次，最后在无菌滤纸上晾干，得到无菌的待测拟南芥种子。

(2)完成步骤(1)后，将100粒无菌的待测拟南芥种子播种于待测培养基(1/2MS固体培养基、含50mM NaCl的1/2MS固体培养基、含100mM NaCl的1/2MS固体培养基或含150mMNaCl的1/2MS固体培养基)上，正常培养3d，统计萌发率(萌发率＝已萌发的待测拟南芥种子的粒数/100粒×100％)；正常培养5d观察生长状态。

部分拟南芥种子在固体培养基上的生长状态见图2中左图(WT为野生型拟南芥种子)。部分拟南芥种子正常培养3d的萌发率统计结果见图2中右图(WT为野生型拟南芥种子)：正常培养3d，在1/2MS固体培养基上，待测拟南芥种子的长势基本一致，萌发率也无显著差异(说明非胁迫条件下Z76基因的过表达对植物的萌发并无影响)；正常培养3d，在含50mM NaCl的1/2MS固体培养基、含100mM NaCl的1/2MS固体培养基或含150mM NaCl的1/2MS固体培养基上，OE-3和OE-16的萌发率均显著高于野生型拟南芥，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的萌发率没有显著差异；正常培养5d，在含50mM NaCl的1/2MS固体培养基上、100mMNaCl的1/2MS固体培养基或含150mM NaCl的1/2MS固体培养基上，OE-3和OE-16的长势均显著优于野生型拟南芥，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的萌发率没有显著差异。

结果表明，Z76基因的过表达提高了拟南芥在萌发阶段对盐的耐受性。

2、根长实验

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

(2)完成步骤(1)后，将无菌的待测拟南芥种子播种于1/2MS固体培养基，正常培养7d，得到待测拟南芥幼苗。

(3)完成步骤(2)后，将50株长势一致的待测拟南芥幼苗转移至待测培养基(1/2MS固体培养基、含50mM NaCl的1/2MS固体培养基或含100mM NaCl的1/2MS固体培养基)上，正常培养(竖直)6d观察生长状态并测量根长。

部分拟南芥种子在固体培养基上的生长状态见图4(WT为野生型拟南芥种子)。根长统计结果见图3(WT为野生型拟南芥种子)：在1/2MS固体培养基上，待测拟南芥种子的长势基本一致，根长也无显著差异(说明非胁迫条件下Z76基因的过表达对植物的根长并无影响)；在含50mM NaCl的1/2MS固体培养基或含100mM NaCl的1/2MS固体培养基上，OE-3和OE-16的根长均显著高于野生型拟南芥，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的根长没有显著差异。

结果表明，Z76基因参与调控盐胁迫下植物根的生长。Z76基因的过表达提高了拟南芥对盐的耐受性。

上述结果表明，与野生型拟南芥相比，OE-3和OE-16的抗盐性显著增强。

五、耐旱性鉴定

1、萌发率实验

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

(2)完成步骤(1)后，将100粒无菌的待测拟南芥种子播种于待测培养基(1/2MS固体培养基、含100mM甘露醇的1/2MS固体培养基、含200mM甘露醇的1/2MS固体培养基或含300mM甘露醇的1/2MS固体培养基)上，正常培养4d，观察生长状态并统计萌发率(萌发率＝已萌发的待测拟南芥种子的粒数/100粒×100％)。

部分拟南芥种子在固体培养基上的生长状态见图5中左图(WT为野生型拟南芥种子)。部分拟南芥种子的萌发率统计结果见图5中右图(WT为野生型拟南芥种子)：在1/2MS固体培养基上，待测拟南芥种子的长势基本一致，萌发率也无显著差异(说明非胁迫条件下Z76基因的过表达对植物的萌发并无影响)；在含100mM甘露醇的1/2MS固体培养基上，OE-16的萌发率显著高于野生型拟南芥，OE-3和野生型拟南芥的萌发率差异不显著，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的萌发率没有显著差异；在含200mM甘露醇的1/2MS固体培养基或含300mM甘露醇的1/2MS固体培养基上，OE-3和OE-16的萌发率均显著高于野生型拟南芥，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的萌发率没有显著差异。

结果表明，Z76基因的过表达提高了拟南芥在萌发阶段对干旱的耐受性。

2、根长实验

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

(1)向EP管中加入待测拟南芥种子，先用75％(v/v)乙醇水溶液浸泡1min、超纯水清洗3-5次，再用10％(m/v)NaClO消毒10min、超纯水清洗8-10次，最后在无菌滤纸上晾干，得到无菌的待测拟南芥种子。

(3)完成步骤(2)后，将50株长势一致的待测拟南芥幼苗转移至待测培养基(1/2MS固体培养基、含200mM甘露醇的1/2MS固体培养基或含300mM甘露醇的1/2MS固体培养基)上，正常培养(竖直)6d观察生长状态并测量根长。

部分拟南芥种子在固体培养基上的生长状态见图7(WT为野生型拟南芥种子)。部分根长统计结果见图6(WT为野生型拟南芥种子)：在1/2MS固体培养基上，待测拟南芥种子的长势基本一致，根长也无显著差异(说明非胁迫条件下，Z76基因的过表达对植物的根长并无影响)；在含200mM甘露醇的1/2MS固体培养基或含300mM甘露醇的1/2MS固体培养基上，OE-3和OE-16的根长均显著高于野生型拟南芥，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的根长没有显著差异。

结果表明，Z76基因参与调控干旱胁迫下植物根的生长。Z76基因的过表达提高了拟南芥对干旱的耐受性。

六、生理指标测定

将待测拟南芥种子(野生型拟南芥种子、OE-3的T3代种子或OE-16的T3代种子)消毒后，播种于1/2MS培养基上，待种子萌发8-10d后，移栽至营养土中继续生长3-4周，得到待测拟南芥幼苗。

在温度为22±2℃，光照强度为400μmol·m^-2·s^-1，光周期为16h光照/8h黑暗，相对湿度为65-75％的人工气候室，分别将含200mM NaCl的MS液体培养基、含400mM Manntiol的MS液体培养基或水(对照)加入营养土处理待测拟南芥幼苗72h，然后取叶片，进行各种生理生化指标的测定分析。

1、失水率的测定

按照文献(Huiyan Guo，Yucheng Wang，Liuqiang Wang，Ping Hu，Yanmin Wang，Yuanyuan Jia，Chunrui Zhang，Yu Zhang，Yiming Zhang，Chao Wang and ChuanpingYang.Expression of the MYB transcription factor gene BplMYB46 affects abioticstress tolerance and secondary cell wall deposition in Betulaplatyphylla.Plant Biotechnology Journal(2017)15：107–121)中的记载的方法检测待测拟南芥幼苗叶片的失水率。具体步骤如下：取待测拟南芥幼苗叶片(用水处理的对照)100-200mg，立刻称取鲜重FW；然后放入培养皿中，室温放置0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h或5h后，称取待测拟南芥幼苗叶片的鲜重FW(h)。最后将待测拟南芥幼苗叶片放入80℃的烘箱中烘干至恒重，称重DW。计算每个时间段叶片的失水率：

总含水量＝FW-DW；

每个时间点的含水量＝FW(h)-DW；

每个时间点的失水率＝1-(FW(h)-DW)/(FW-DW)。

检测结果见图8中A(WT为野生型拟南芥种子)。结果表明，与野生型拟南芥相比，OE-3和OE-16的失水率显著降低。

2、脯氨酸含量的测定

按照文献(Bates，L.S.，Waldren，R.P.，and Teare，I.D.(1973).Rapiddetermination of free proline for water-stress studies.Plant Soil 39，205-207.)中的记载的方法检测待测拟南芥幼苗叶片的脯氨酸含量。具体步骤如下：

(1)准确称取待测拟南芥幼苗的叶片0.1g，加入1mL 3％(w/v)磺基水杨酸溶液研磨，匀浆转移到离心管中，在沸水浴中提取10min，冷却，3000r/min离心10min，上清液即为脯氨酸的提取液。

(2)标准曲线制作

(2-1)按照下表加试剂

(2-2)完成步骤(2-1)后，摇匀，在沸水浴中显色30min(时间要严格控制，否则会引起沉淀)，冷却至室温，加入2mL甲苯充分震荡，萃取红色产物，萃取后静止一段时间(10-30min)使其分层(红色物质进入到甲苯层)。用注射器或者滴管轻轻吸取上层红色物质于比色皿中，在分光光度计520mn处测定吸光值。

以脯氨酸含量为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

(3)样品测定

将步骤(2)中的标准脯氨酸替换为2mL步骤(1)得到的脯氨酸的提取液，其它步骤均不变，得到吸光值。根据步骤(2)绘制的标准曲线，得到脯氨酸的提取液中脯氨酸的含量。进一步，根据下述公式得到待测拟南芥幼苗的叶片中的脯氨酸含量；

C为脯氨酸的提取液中脯氨酸的含量(μg)；V：提取液总体积，即5mL；Vt：测定时液体体积，即2mL；W：样品质量。

部分检测结果见图8中B(WT为野生型拟南芥种子)。结果表明，在干旱胁迫或盐胁迫条件下，与野生型拟南芥相比，OE-3和OE-16的脯氨酸含量显著增加。

3、相对电导率的测定

按照文献(Lutts S，Kinet J M，Bouharmont J.1996.NaCl-induced senescencein leaves of rice(Oryza sativa L.)cultivars differing in salinityresistance.Annals of Botany，78，389-398.)中的记载的方法检测待测拟南芥幼苗叶片的相对电导率。具体步骤如下：

(1)取规格为50mL的小烧杯，用去离子水反复冲洗三遍后，再用去离子水平衡24h。

(2)取待测拟南芥幼苗的叶片100mg，用去离子水冲洗三遍，剪碎放入完成步骤(1)的小烧杯中，加入50mL ddH₂O。

(3)完成步骤(2)后，将所述小烧杯放入真空泵中，真空渗透15min至叶片呈半透明状。

(4)完成步骤(3)后，取所述烧杯，用电导仪测定伸入烧杯，测定各溶液的电导值S1。

(5)完成步骤(4)后，将所述烧杯置于90℃的水浴锅中，水浴20min，待其冷却至室温后，再次测定此时的电导值S2。

(6)计算相对电导率。相对电导率＝(S1/S2)×100％。

部分检测结果见图8中C(WT为野生型拟南芥种子)。结果表明，在干旱胁迫或盐胁迫条件下，与野生型拟南芥相比，OE-3和OE-16的相对电导率下降。

四、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

按照文献(Wang，Y.C.，Gao，C.Q.，Liang，Y.N.，Wang，C.，Yang，C.P.，and Liu，G.F.(2010).A novel bZIP gene from Tamarix hispida mediates physiologicalresponses to salt stress in tobacco plants.J.Plant Physiol.)中的记载的方法检测待测拟南芥幼苗叶片的SOD活性。

部分检测结果见图8中D(WT为野生型拟南芥种子)。结果表明，在干旱胁迫或盐胁迫条件下，与野生型拟南芥相比，OE-3和OE-16的SOD活性显著提高。

五、叶绿素含量测定

参照专著(李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京：高等教育出版社)中的记载方法检测待测拟南芥幼苗叶片中总叶绿素含量。

部分检测结果见图8中E(WT为野生型拟南芥种子)。结果表明，在干旱胁迫或盐胁迫条件下，与野生型拟南芥相比，OE-3和OE-16的体内总叶绿素含量显著提高。

六、H₂O₂含量测定

按照文献(Velikova，V.，Yordanov，I.，and Edreva，A.(2000).Oxidative stressand some antioxidant systems in acid rain-treated bean plants:protective roleof exogenous polyamines.Plant Science 151，59-66.)中的记载的方法检测待测拟南芥幼苗叶片的H₂O₂含量。

部分检测结果见图8中F(WT为野生型拟南芥种子)。结果表明，在干旱胁迫或盐胁迫条件下，与野生型拟南芥相比，OE-3和OE-16的H₂O₂含量显著降低。

七、超氧阴离子含量测定

按照文献(Able A J，Guest D I，Sutherland M W.1998.Use of a newtetrazolium-based assay to study the production of superoxide radicals bytobacco cell cultures challenged with avirulent zoospores of Phytophthoraparasitica var nicotianae.Journal of Plant Physiology，117，491-499.)中的记载的方法检测待测拟南芥幼苗叶片的超氧阴离子含量。

部分检测结果见图8中G(WT为野生型拟南芥种子)。结果表明，在干旱胁迫或盐胁迫条件下，与野生型拟南芥相比，OE-3和OE-16的超氧阴离子含量显著降低。

上述结果表明，与野生型拟南芥相比，OE-3和OE-16的抗逆性显著增强。

<110> 黑龙江八一农垦大学黑龙江省农业科学院经济作物研究所

<120> 抗逆相关蛋白Z76在调控植物抗逆性中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 804

<212> DNA

<213> 玉米Zea mays L.

<400> 1

atggacgacg gggacctgga tttctccaac ccggacacgt acctgtgtcc ggccctcggc 60

accgacccgc ccagcagctg ctccatggac agctacttcg acgagatcct caaggacacg 120

gagcacctcg cctgcacgca cacccacacc tgcaacccgc cggtgcacga cctctcgcac 180

acccacacct gcgtccacgt ccataccaag atcgtcgcgg cctcgccggg cgacgccgag 240

tcgccgtccg agaacaacag caacggcaac gccgcctcta agaagcgccc gtcggggaac 300

cgcgccgccg tcaggaagta ccgggagaag aagaaggccc acaccgcatc gctcgaggag 360

gaggtggtgc acctccgggc gctcaaccag cagctcatga aaaagctcca gagccacgcc 420

gcgctcgagg cggaggcggc caggctccgc tgcctgctcg tcgacatcag gggcaggatc 480

gagggggaga ttggtgcgtt cccgtatcag aggccgccgg cggtcaagaa cgtcgacctc 540

ctgtctagtg ttgaccagga aagcctcctt ggcagcgctg ctgcccaggt tgccaactcc 600

tgtgatttta gatgcaacca tcagatgtac tgcaaccctg ggatgcaggg cgctatcagc 660

ggtcaggtgt tgggacaagg tgcctgtgat gtcgccagta tgcaatgcat tggaagcacc 720

aagtctggat ccactaagct acctgtttgt gggggtctgg atacactacc tgctgtctgc 780

ttaccaaatg ttgaaaagaa gtga 804

<210> 2

<211> 267

<212> PRT

<213> 玉米Zea mays L.

<400> 2

Met Asp Asp Gly Asp Leu Asp Phe Ser Asn Pro Asp Thr Tyr Leu Cys

1 5 10 15

Pro Ala Leu Gly Thr Asp Pro Pro Ser Ser Cys Ser Met Asp Ser Tyr

20 25 30

Phe Asp Glu Ile Leu Lys Asp Thr Glu His Leu Ala Cys Thr His Thr

35 40 45

His Thr Cys Asn Pro Pro Val His Asp Leu Ser His Thr His Thr Cys

50 55 60

Val His Val His Thr Lys Ile Val Ala Ala Ser Pro Gly Asp Ala Glu

65 70 75 80

Ser Pro Ser Glu Asn Asn Ser Asn Gly Asn Ala Ala Ser Lys Lys Arg

85 90 95

Pro Ser Gly Asn Arg Ala Ala Val Arg Lys Tyr Arg Glu Lys Lys Lys

100 105 110

Ala His Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Val Val His Leu Arg Ala Leu

115 120 125

Asn Gln Gln Leu Met Lys Lys Leu Gln Ser His Ala Ala Leu Glu Ala

130 135 140

Glu Ala Ala Arg Leu Arg Cys Leu Leu Val Asp Ile Arg Gly Arg Ile

145 150 155 160

Glu Gly Glu Ile Gly Ala Phe Pro Tyr Gln Arg Pro Pro Ala Val Lys

165 170 175

Asn Val Asp Leu Leu Ser Ser Val Asp Gln Glu Ser Leu Leu Gly Ser

180 185 190

Ala Ala Ala Gln Val Ala Asn Ser Cys Asp Phe Arg Cys Asn His Gln

195 200 205

Met Tyr Cys Asn Pro Gly Met Gln Gly Ala Ile Ser Gly Gln Val Leu

210 215 220

Gly Gln Gly Ala Cys Asp Val Ala Ser Met Gln Cys Ile Gly Ser Thr

225 230 235 240

Lys Ser Gly Ser Thr Lys Leu Pro Val Cys Gly Gly Leu Asp Thr Leu

245 250 255

Pro Ala Val Cys Leu Pro Asn Val Glu Lys Lys

260 265

Claims

1.蛋白质Z76在调控植物抗逆性中的应用；所述蛋白质Z76为氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

所述抗逆性为抗盐性或抗旱性；

所述植物为玉米或拟南芥。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控植物抗逆性为增加植物抗逆性。

3.编码权利要求1中所述蛋白质Z76的核酸分子在调控植物抗逆性中的应用；

所述抗逆性为抗盐性或抗旱性；

所述植物为玉米或拟南芥。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述编码蛋白质Z76的核酸分子为b1）或b2）所示的DNA分子：

b1）编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

b2）核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述调控植物抗逆性为增加植物抗逆性。

6.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中权利要求1中所述蛋白质Z76的含量或活性，从而增加抗逆性；

所述抗逆性为抗盐性或抗旱性；

所述植物为玉米或拟南芥。